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1.
目的:建立原代小鼠骨髓间充质干细胞成纤维样集落的培养方法,了解问充质干细胞的培养特性及其多向分化潜能。 方法:实验于2004-10/2005-10在郧阳医学院附属人民医院临床医学研究所完成。①间充质干细胞的分离:选取SPF级2月龄昆明种小鼠30只,无菌条件下抽取双侧股骨、胫骨骨髓,制成骨髓单细胞悬液,计数有核细胞的密度。②血清浓度对成纤维样集落的影响:调整有核细胞密度为5&;#215;10^8L^-1,分别接种于体积分数为0.02,0.05,0.1,0.15,0.2,0、25的胎牛血清-DMEM培养基中,每种血清浓度各4孔,1mL/孔,24h后换液。随后每72h换液,连续观察2周。③有核细胞密度对成纤维样集落的影响:分别调整有核细胞至10^6L^-1,10^7L^-1,2.5&;#215;10^8L^-1,5&;#215;10^8L^-1,10^9L^-1,分别接种于12孔板中,每种密度4孔,24h后换液。随后每72h换液,连续观察2周,瑞氏吉姆萨染色后计数成纤维样集落的个数。④成骨与成脂肪诱导:调整有核细胞密度在5&;#215;10^8L^-1,接种于预包被鼠尾胶的12孔板中培养。24h换液,去除未贴壁的细胞,以后每48h换液1次,换液后加入成骨诱导液、成脂肪诱导液。观察各血清浓度下细胞生长情况,消化培养板中的成纤维样集落流式细胞仪检测CD34,CD133,CD90,CD105。VonKossa和油红O法染色鉴定间充质干细胞成骨与成脂肪诱导情况。 结果:①不同血清浓度对成纤维样集落形成的影响:胎牛血清-DMEM培养液体积分数为0.02,0.05时,细胞可保持成纤维样,但增殖较慢;体积分数为0.15,0.2,0.25时,细胞增殖较快,但细胞易分化;体积分数为0.1时,细胞可基本保持成纤维样,且增殖速度适中。②有核细胞不同接种密度对成纤维样集落形成的影响:有核细胞接种密度为10^6L^-1,10^7L^-1时,每孔成纤维样集落数为0~1个。接种密度高于10^9L^-1时,每孔成纤维样集落之间出现交叉或融合。接种密度分别为2.5&;#215;10^8L^-1,5&;#215;10^8L^-1,10^9L^-1时,10d左右可见典型的成纤维样集落。成纤维样集落个数与所接种有核细胞密度呈正相关。③成纤维样集落中的问充质干细胞表面标记流式检测结果:成纤维样集落中的问充质干细胞呈CD34^-,CD133^-.CD90^+,CD105^+,分别各占2.5%,3.1%,67%和78%。④间充质干细胞成骨与成脂肪诱导情况:成脂肪诱导2周后成纤维样集落中(80&;#177;7)%的间充质干细胞出现脂滴,成骨诱导2周后成纤维样集落出现矿物结节。分别以油红0和Von Kossa’s矿化结节特异性染色后,成脂肪诱导中成纤维样集落(85&;#177;6)%的细胞胞浆呈红色,成骨诱导中大多数的成纤维样集落中心位置出现钙结节。 结论:全骨髓接种合适密度的有核细胞可形成典型的成纤维样集落,且成纤维样集落具有成骨、成脂肪等多向分化潜能。  相似文献   

2.
背景组织工程技术的快速发展为骨缺损完全再生修复带来了新的希望,种子细胞的快速扩增是其中的关键问题之一.目的观察人间充质干细胞传代培养时,细胞种植密度对间充质干细胞增殖及成骨诱导分化影响.设计重复测量设计.单位解放军第三军医大学细胞培养室和检测分析室.对象实验于2003-01/2004-03在解放军第三军医大学的创伤、烧伤和复合伤国家重点实验室完成.从5例男性健康志愿者髂骨骨髓中分离扩增的干细胞.方法将第2代间充质干细胞以8×103/cm2,3×103/cm2,8×102/cm2密度接种,分析其生长曲线,并扩增培养18 d,记录细胞扩增数量,再分析扩增后细胞的生长曲线和成骨诱导能力.主要观察指标①不同种植密度下细胞生长曲线.②碱性磷酸酶染色和骨钙素的免疫组化染色结果.结果人骨髓间充质干细胞阴性表达碱性磷酸酶、CD34;在8×103/cm2种植密度下,细胞倍增时间40 h,18 d后细胞数量扩增(51±13)倍;在3×103/cm2种植密度下,细胞扩增(28±6)倍;在8×102/cm2种植密度下,细胞总数仅增加(5±3)倍.在低密度下获得的细胞增殖能力强于高密度组,两组细胞均具有成骨诱导能力. 结论种植密度对间充质干细胞增殖有明显影响,快速扩增间充质干细胞作为骨组织工程种子细胞,宜选择8×103/cm2种植密度.  相似文献   

3.
人骨髓间充质干细胞的优化培养   总被引:5,自引:2,他引:5  
滕勇  胡蕴玉  白建萍  王臻  戴先文  李明全 《中国临床康复》2004,8(29):6337-6339,i003
目的:骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells MSCs)培养大多集中在动物,探讨人MSCs的优化培养方法,为组织工程临床应用奠定基础。方法:手术切取患者骨松质3mm&;#215;3mm&;#215;3mm,在含血清培养基内用剪刀将其剪为1mm&;#215;1mm&;#215;1mm大小,然后用注射器冲洗;抽取患者骨髓5mL。分别用贴壁法和密度梯度离心法原代培养。比较不同培养方法MSCs的生长情况。对各组传代细胞用化学药物进行成骨诱导培养,并检测成骨细胞表型。结果:手术切取患者骨松质和抽取患者骨髓均能培养出骨髓间充质干细胞,切取骨松质获取的细胞数量大,5mL骨髓培养细胞数平均可达2.43&;#215;10^8,3mm&;#215;3mm&;#215;3mm骨松质可以获取MSCs的平均细胞数可达9.57&;#215;10^8;全骨髓法细胞贴壁时间早两三天,密度梯度离心法细胞均一性好,利于纯化。结论:临床组织工程中可以根据情况和需要采用不同方法获取MSCs。  相似文献   

4.
何朝荣  张群林  王玮  王崇全  王卫民 《中国临床康复》2004,8(18):3508-3509,F003
目的:探讨骨髓间充质干细胞体外扩增及其向内皮样细胞定向分化条件。方法:无菌条件下采集兔骨髓,肝素抗凝,经淋巴细胞分层液(相对密度为1.077)密度梯度离心分离骨髓单个核细胞,通过贴壁培养法获得骨髓间充质干细胞(bone marrow-mesenchymal stem cell,MSC),然后在内皮细胞生长环境中进行诱导分化,观察细胞的体外生长特点及其生化特性。结果:MSC每扩增一代,细胞数量增加5~8倍,7.65&;#215;10^3个原代MSCs体外扩增3代即获得1.26&;#215;108个细胞。特定条件下贴壁细胞延展呈梭形,形成细胞簇、索状结构及“铺路石”样结构,扩增细胞免疫组化证实表达CD31和VIII因子相关抗原(factor VIII related antigen von Wille-brand factor,vWF)。具有吞噬乙酰化低密度脂蛋白的功能。结论:.MSC扩增能力强,在体外能诱导其向内皮细胞方向分化。  相似文献   

5.
恒磁场对人脐血间充质干细胞增殖及细胞周期的影响   总被引:4,自引:0,他引:4  
目的:观察不同强度恒磁场辐射对人脐血间充质干细胞增殖水平及细胞周期的影响。方法:实验于2005-08/2005-10在中南大学湘雅医学院组织胚胎学教研室完成。①用密度梯度离心法分离人脐血间充质干细胞。②经贴壁筛选法筛选,对生长良好的第3代人脐血间充质干细胞进行恒磁场辐射(强度分别为0.05,0.1,0.5和1.0mT),连续刺激5d,8h/d。③用四甲基偶氮唑盐法、流式细胞仪法测定细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡情况。结果:(90.05mT组细胞增殖显著高于对照组(0.198&;#177;0.011,0.162&;#177;0.007,P〈0.05);细胞周期静止期/DNA合成前期比例显著降低(66.3&;#177;0.1,75.8&;#177;0.3,P〈0.05);DNA合成期和DNA合成后期/分裂期比例显著增加(14.9&;#177;0.3比9.1&;#177;0.1,18.8&;#177;0.2比15.1&;#177;0.1,P〈0.05)。(2)0.1mT组细胞增殖和细胞周期与对照组相比无明显差异。(3)0.5mT组和1.0mT组细胞增殖均显著低于对熙组,细胞周期静止期/DNA合成前期比例显著增加,DNA合成期和DNA合成后期/分裂期比例显著降低(P〈0.05)。④各组均未发现DNA倍体异常细胞。结论:恒磁场对人脐血间充质干细胞增殖的影响与磁感应强度有关,0.05mT的磁场促进间充质干细胞的增殖,0.1mT的磁场对间充质干细胞无明显影响,0.5mT和1.0mT的磁场抑制间充质干细胞的增殖。  相似文献   

6.
目的:观察体外构建骨髓间充质千细胞、改良纤维蛋白胶及生长因子的组织工程软骨模块的可行性。方法:实验于2004-07/12在南方医科大学附属珠江医院中心实验室进行。选取新西兰兔10只,密度梯度法分离培养兔骨髓间充质干细胞,在培养系统中加入生长因子(含10μg/L转化生长因子β1,100mol/L地塞米松,50mg/L维生素C,以及1%ITS-A。培养第2,4,6,8天采用四甲基偶氮噻唑法在酶标仪上检测吸光度值表示细胞增殖。于培养7,14d行细胞爬片甲苯胺蓝染色及Ⅱ胶原免疫组化。诱导后骨髓间充质干细胞种植于改良纤维蛋白胶支架上,加入生长因子诱导培养,于培养7,14,21d行形态组织学及透射电镜检查。结果:实验兔10只均进入实验结果分析。①四甲基偶氮噻唑法测定培养第6和8天后,实验组骨髓间充质干细胞增殖的吸收度值高于对照组(实验组:0.4554&;#177;0.0206,0.5348&;#177;0.0169;对照组:0.4270&;#177;0.0255,0.5057&;#177;0.0368,P〈0.05)。②细胞爬片甲苯胺蓝染色细胞周围有蓝色基质。Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。③诱导后骨髓间充质干细胞在改良纤维蛋白胶支架中培养,Masson染色可见胞浆及细胞周围有胶原的形成;Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。透射电镜可见细胞代谢旺盛。结论:骨髓间充质干细胞、改良纤维蛋白胶及生长因子的组织工程模块体外培养系统中,改良纤维蛋白胶支架相容性好,转化生长因子β等生长因子促进骨髓间充质干细胞在改良纤维蛋白胶支架增殖,诱导分化成软骨细胞表型。  相似文献   

7.
人胚胎神经干细胞分离、培养、纯化及增殖潜能的特点   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的:探讨获取和培养人胚胎神经干细胞的方法。方法:实验于2003-09/2004—12在重庆医科大学基础研究所完成。人胚胎来源为7-12周人工药物流产胎儿,由重庆医科大学附属第二医院及重庆市妇幼保健院提供,征得产妇本人同意。①从人胚胎大脑皮质中分离、培养、纯化原代神经干细胞,经体外反复传代培养以获得能在体外长期生存的神经干细胞。②免疫细胞化学鉴定神经干细胞特异性表达抗原。⑧观察不同种植细胞密度对神经干细胞增殖的影响,分析其生长特点并绘制生长曲线。④采用悬浮细胞培养法扩增细胞,冷冻复苏后观察细胞的生物学特性。结果:①人胚胎神经干细胞体外生长特点:从7~12周流产胎儿大脑皮质中获得了能在体外长期生存的神经干细胞。经体外传至15代,神经干细胞细胞数量扩增至200倍。②神经干细胞接种密度对增生的影响:当种植细胞的密度为1&;#215;10^5L^-1,1&;#215;10^7L^-1时,体外培养30d后仍呈单细胞贴壁状态。以1&;#215;10^9L^-1细胞密度接种时,12h后即见多个单细胞聚成的小球,悬浮生长。③神经干细胞自我更新能力的检测结果:多数单个细胞在培养后24~48h分裂为2-4个细胞的小克隆,7~10d均发展为上百个细胞的较大的克隆。④nestin抗原的表达:培养的神经干细胞神经球nestin免疫细胞染色均呈阳性。⑤神经干细胞多向分化能力检测:NSE和GFAP免疫细胞化学染色显示,被测细胞胞浆有棕黄色颗粒沉着,呈阳性表达。⑥神经干细胞复苏后的存活率:冻存1,4,8,12周的神经干细胞存活率基本相似[(80.2&;#177;1.8)%,(80.1&;#177;1.2)%,(79.9&;#177;0.8)%,(80.1&;#177;2.1)%,P〉0.05]。结论:成功地从人胚胎大脑皮质中分离得到了神经干细胞。经体外培养证明:人胚胎神经干细胞具有自我更新增殖能力和向神经元样细胞、星形胶质样细胞分化的潜能。  相似文献   

8.
目的:通过体外诱导骨髓间质干细胞向心肌样细胞分化,验证其多能分化特性,检测分化后的细胞进行免疫源性。方法:①实验于2003-03/2004-09在华中科技大学同济医学院附属协和医院心内科实验室完成。实验选用1月龄Wistar大鼠20只。②贴壁法体外培养骨髓间质干细胞,用化学物质5-氮杂胞苷诱导24h.免疫组化检测诱导后的细胞心肌特异性蛋白的表达,单向混合淋巴细胞反应检测诱导分化后的骨髓间质干细胞的免疫源性。③实验分组如下,对照组1:单独的反应细胞组;对照组2:刺激细胞+反应细胞。实验组1:不同数量诱导分化后的骨髓间质干细胞1&;#215;10^7,1&;#215;10^8,1&;#215;10^9L^-1+反应细胞;实验组2:不同数量诱导分化后的骨髓间质干细胞1&;#215;10^7,1&;#215;10^8,1&;#215;10^9L^-1+刺激细胞+反应细胞。以抑制率表示诱导分化后的骨髓间质干细胞的免疫调控活性。④多均数比较采用方差分析,进行方差齐检验后,均数间两两比较采用LSD法。两样本均数比较采用t检验。结果:20只大鼠均进入结果分析。①部分诱导后的细胞胞浆结蛋白,心肌特异性肌钙蛋白,连接蛋白—43免疫组化呈阳性反应。②实验组1(加入的骨髓间质干细胞为1&;#215;10^7,1&;#215;10^8,1&;#215;10^9L^-1时)同种异体淋巴细胞的每分钟脉冲值明显低于对照组1(4610.106&;#177;276.16,3704.55&;#177;159.50,2881.317&;#177;114.62,8232.333&;#177;351.71,P〈0.05),各剂量骨髓间质干细胞组间差异明显(P〈0.05)。③实验组2(加入的骨髓间质干细胞为1&;#215;10^7,1&;#215;10^8,1&;#215;10^9L^-1时)对混合淋巴细胞反应的抑制率明显高于对照组1(43.9%,55.1%,65.7%,1.65%,P〈0.05),各剂量骨髓间质干细胞组间差异明显(P〈0.05)。结论2骨髓间质干细胞具有向心肌样细胞分化的潜能,分化后的骨髓间质干细胞能呈剂量依赖性地抑制同种异体淋巴细胞增殖,可以抑制正在进行的混合淋巴细胞反应,具有低免疫源性,可用于同种异体移植。  相似文献   

9.
目的:观察大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛素阳性细胞能力。方法:①实验于2004-09/2005-01在南京医科大学第一附属医院内分泌及代谢病研究室完成。选用清洁级雄性SD大鼠10只。②取大鼠骨髓,体外分离、培养骨髓间充质干细胞,流式细胞术检测CD45/CD90表达及细胞周期,明确骨髓间充质干细胞特性。③取第3代细胞,随机分为2组,低糖诱导组[先予体积分数0.1胎牛血清低糖Dulbecco改良的Eagle培养液(5.6mmol/L葡萄糖)]或高糖诱导组[高糖Dulbecco改良的Eagle培养液(25mmol/L葡萄糖)1培养14d,换予体积分数0.05胎牛血清低糖Dulbecco改良的Eagle培养液或高糖Dulbecco改良的Eagle培养液+尼克酰胺(10mmol/L)培养7d,再加Exendin-4(10nmol/L)诱导培养7d。④采用反转录聚合酶链反应法检测胰腺一十二指肠同源盒基因1、胰岛素原和胰岛素基因的表达,激光共聚焦显微镜观察胰岛素蛋白的表达,流式细胞术检测胰岛素阳性细胞数和平均荧光强度,电镜观察诱导后细胞的超微结构。⑤组间计量资料比较采用方差分析。结果:①骨髓间充质干细胞贴壁生长,呈长梭形。流式细胞术检测显示,CD90阳性率为(96.3&;#177;1.3)%,CD45阳性率为(0.3&;#177;0.4)%,细胞周期静止期-DNA合成前期占(76.8&;#177;4.8)%,DNA合成后期一有丝分裂期(11.3&;#177;3.7)%,DNA合成期(11.9&;#177;5.7)%。②骨髓间充质干细胞诱导培养过程中,细胞形成团簇状分布,少数聚集成团,直径80~200μm,半悬浮于培养瓶中。电镜观察此类细胞胞浆内有较多分泌颗粒。③低糖诱导组和高糖诱导组均表达胰腺-十二指肠同源盒基因1、胰岛素原和胰岛素基因。④流式细胞术检测显示低糖诱导组和高糖诱导组胰岛素阳性细胞数和平均荧光强度均明显高于骨髓间充质干细胞诱导前[(21.9&;#177;11.1)%,(19.8&;#177;7.8)%,(1.4&;#177;1.2)%;21.0&;#177;7.6,22.5&;#177;14.5,8.7&;#177;3.5,P〈0.051。结论:大鼠骨髓间充质干细胞在体外可以诱导分化为胰岛素阳性细胞。  相似文献   

10.
目的:观察小鼠胎肝间充质干细胞在联合神经生长因子的作用下向神经细胞分化的能力。方法:实验于2004-03/09在暨南大学血液病研究所完成。健康BABL/c小鼠按雌雄2:1的比例合笼过夜,第2天分开并检查。以见到阴栓为怀孕的标准,计为孕0.5d。分离孕13.5d BABL/C胎鼠肝脏,贴壁法收获胎肝间充质干细胞。用以下方案进行诱导:碱性成纤维生长因子(10μg/L 4d;碱性成纤维生长因子(10μg/L和成纤维生长因子8(10μg/L)4d;碱性成纤维生长因子(10μg/L、脑源性神经营养因子(10μg/L以及2%的B27 4d。观察诱导细胞的形态学变化。于诱导0,4,12d收获细胞,反转录聚合酶链反应检测神经特异性基因表达;免疫细胞染色检测神经特异性蛋白的表达。以上实验均重复3次。结果:①形态学变化:经贴壁法分离的胎肝间充质干细胞呈均质梭形。碱性成纤维生长因子诱导3d,胎肝间充质干细胞开始变圆并聚集,呈神经干细胞样形态。经成纤维生长因子8和脑源性神经营养因子的进一步诱导后,大部分细胞呈现典型的神经元样细胞形态,极少数细胞呈星形胶质细胞样形态。②胎肝间充质干细胞经过神经生长因子的顺序诱导后,表达神经特异性基因:未诱导的胎肝问充质干细胞巢蛋白(nestin神经干细胞特异性)、低分子量神经丝蛋白(神经元特异性)、胶质纤维酸性蛋白基因(星形胶质细胞特异性)表达与看家基因(甘油醛-3磷酸脱氢酶)的比值分别为(0.06&;#177;0.02),0,0;诱导4d分别为(0.59&;#177;0.11),(0.46&;#177;0.23),(0.20&;#177;0.96);诱导12d分别为(0.21&;#177;0.07),(0.85&;#177;0.31),(0.13&;#177;0.10)。每种基因在不同诱导时间的表达具有统计学差异(P〈0.01)。③经过神经生长因子的顺序诱导,胎肝问充质干细胞表达神经特异性蛋白:未诱导的细胞不表达巢蛋白(神经干细胞特异性)、微管蛋白Tubulin(神经元特异性)以及胶质纤维酸性蛋白(星形胶质细胞特异性);诱导4d,圆形细胞及细胞团nestin染色阳性,Tubulin阳性细胞为(62.3&;#177;3.5)%,仅有(6.0&;#177;1.6)%的细胞显示胶质纤维酸性蛋白阳性;诱导12d,巢蛋白阳性细胞开始减少,Tubulin阳性细胞达(90.3&;#177;1.5)%;胶质纤维酸性蛋白阳性细胞为(4.7&;#177;1.5)%。诱导12d的细胞微管蛋白Tubulin阳性表达率与诱导4d的细胞相比有统计学差异;而诱导12d的细胞胶质纤维酸性蛋白阳性表达率与诱导4d的细胞相比没有统计学差异。结论:胎肝间充质干细胞在联合神经生长因子提供的信号作用下可以分化为神经元样细胞,诱导结束后,细胞表现为典型的神经元形态并表达神经元特异性蛋白Tubulin。  相似文献   

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韶关市农村留守儿童孤独感状况调查   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的了解广东省韶关市农村地区留守儿童孤独感现状及其影响因素。方法对韶关市某地区两所农村小学3~6年级学生中的489名留守儿童采用儿童孤独量表和自编调查表进行问卷调查。结果17.6%留守儿童存在孤独感,不同性别孤独感发生率无差异性,不同年龄及不同年级间孤独感发生率差异均有极显著性(P〈0.01);随年级增加,孤独感发生率呈下降趋势(X^2趋势=5.970,P〈0.05)。留守儿童孤独感与健康状况、学习成绩、学习困难程度、父母教育方式、父母间关系和老师教育方式等因素显著相关(P〈0.01~0.05)。结论农村地区留守儿童中存在一定程度的孤独感问题,老师和家长应以正确的态度和方法对待留守儿童,以减少其孤独感的发生。  相似文献   

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目的对比观察产科新生儿不同部位经皮胆红素(TCB)报警预值的可靠性。方法132例产科新生儿采取随机数字分组法分为正常产组和剖宫产组各66例,新生儿均于产后第4天同一时间点应用KJ8000经皮测黄仪分别测量额、胸、腹、额胸、额胸腹TCB值,TCB〉12.9mg/dl者,取得亲属同意抽取静脉血检测血清胆红素(SB),对比分析不同部位TCB及其与sB值的差异。结果两组分别有17例或21例达到TCB报警预值。两组TCB或sB相同方法及相同部位比较,差异无统计学意义(P〉0.05);两组TCB不同部位对比,额部值最低、胸部值最高,且与其他部位同组对比差异均有统计学意义(P〈0.01);两组sB值对比差异无统计学意义(t=1.53,P〉0.05),与不同部位TCB对比均以胸部数值差异无统计学意义(P〉0.05),而与其他部位TCB两组差异均有统计学意义(P〈0.01)。结论正常产与剖宫产新生儿术后sB对比差异无意义;TCB动态监测以胸部结果更接近SB。  相似文献   

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Physiatrists are a valuable resource in legal settings, where assessment of functional capacity to perform work and of future medical needs must be determined. Physiatrists help determine what future medical care is needed to restore and maintain an individual at the maximum level of life function. This article focuses on the use of a quality of life (QOL) rehabilitation model, rather than a medical model, for enhancing functional performance, modifying environments, and facilitating patient coping. We discuss use of the QOL model to describe and influence a patient's physical, psychological, cognitive, vocational/economic, and social/leisure domains.  相似文献   

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目的:了解江汉油田血液透析(血液透析)患者家庭护理提供者(护理者)的生活质量。方法:对60例血液透析患者的家庭护理提供者进行一般情况和生活质量综合评定问卷(QOLI-74)调查,并进行相关性和多因素回归分析。结果:家庭护理提供者各维度的主观生活满意度与其客观指标相关,但也与其需求、年龄、文化程度、与患者的关系有关。结论:客观状态是影响主观生活满意度的重要因素,同时应考虑护理者的需求、年龄、文化程度、与患者的关系对护理者主观生活满意度的影响。  相似文献   

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失眠症又称不寐,指入睡困难,或维持睡眠障碍(易醒、早醒和再入睡困难)导致睡眠时间减少或睡眠质量下降,不能满足身体生理需要,明显影响日间社会功能和生活质量。现将星状神经节阻滞治疗失眠疗效观察总结如下。  相似文献   

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