聚乳酸/壳聚糖纳米纤维/纳米羟基磷灰石支架与兔软骨细胞的相容性

背景：传统的支架材料存在疏水性强,材料表面缺乏细胞表面受体特异结合的生物活性分子,材料的酸性降解产物易引发无菌性炎性反应等不足。根据仿生原理及软骨真实结构和构成来选择和制备组织工程软骨支架能够获得理想效果。 目的：制备聚乳酸/壳聚糖纳米纤维/纳米羟基磷灰石支架,评价其与兔膝关节软骨细胞的生物相容性,探讨其应用于关节软骨组织工程的可行性。 方法：采用二次相分离技术制备聚乳酸/壳聚糖纳米纤维/纳米羟基磷灰石复合支架,将第3代新西兰兔软骨细胞接种至复合支架材料上复合培养,倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。细胞-支架复合物在24孔板中培养5 d以后,将其植入裸鼠皮下8周。 结果与结论：聚乳酸/壳聚糖纳米纤维/纳米羟基磷灰石支架材料经化学合成后,具有合适的三维多孔结构,孔隙率为90%,孔径300~450 μm;植入裸鼠皮下8周后Ⅱ型胶原免疫组织化学染色和甲苯胺蓝染色显示细胞-支架复合物中的软骨细胞可以像天然软骨一样分泌黏多糖和Ⅱ型胶原。提示生物材料聚乳酸/壳聚糖纳米纤维/纳米羟基磷灰石对于兔软骨细胞有良好的生物相容性,可作为生物组织工程支架。     

膝关节腔内培养骨髓间充质干细胞复合脱钙骨的组织工程软骨

背景：如何更好地以组织工程学方法修复关节软骨缺损并达到良好的远期疗效目前尚无公识。 目的：创新性地在膝关节腔内培养兔骨髓间充质干细胞复合同种异体脱钙骨的组织工程软骨。  方法：采用全骨髓贴壁筛选法分离培养兔骨髓间充质干细胞,DMEM/F12完全培养基培养,成软骨诱导条件培养基诱导分化。取同种异体兔的髂骨和椎体骨制作成脱钙骨支架,诱导后的骨髓间充质干细胞种植于脱钙骨支架上,培养1 d后将细胞-支架复合物用筋膜包裹置于兔左膝关节腔内培养,单纯脱钙骨支架筋膜包裹置入右膝关节腔。于培养第4,8,12周分别取材,行大体观察并制成石蜡切片,采用苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色,Ⅱ型胶原免疫组化染色方法进行组织学观察。 结果与结论：培养4,8周,细胞-支架组标本Ⅱ型胶原免疫组化的平均吸光度值(A)分别为0.263±0.031,0.340±0.052,单纯支架组标本分别为0.147±0.027,0.165±0.030,两组比较差异有显著性意义(P < 0.05);培养12周细胞-支架组标本Ⅱ型胶原免疫组化A值平均为0.362±0.037,标本类似正常软骨外观,Ⅱ型胶原免疫组化反应呈阳性;而单纯支架组脱钙骨支架降解。培养12周细胞-支架组苏木精-伊红染色结果显示细胞数量多,脱钙骨支架基本被吸收;而甲苯胺蓝染色结果显示有被染成紫红色的异染性基质形成。结果提示兔骨髓间充质干细胞复合同种异体脱钙骨可在兔膝关节腔内培养出组织工程软骨。     

新生兔气管软骨细胞的生物学特性

 目的：探讨体外分离培养的新生兔气管软骨细胞的生物学特性。方法：通过酶消化法体外分离培养新生兔气管软骨细胞;倒置显微镜观察软骨细胞形态及生长状况;电镜观察软骨细胞超微结构;运用real-time PCR、免疫细胞化学染色和甲苯胺蓝染色检测气管软骨细胞分泌的细胞外基质成分。结果：体外分离、培养的兔气管软骨细胞呈短小三角形或不规则形贴壁生长。超微结构显示细胞较多突起,孔隙较多,胞质丰富,细胞器发达,细胞内可见大量蛋白分泌物。软骨细胞表达I、II型胶原、蛋白聚糖等,以II型胶原和蛋白聚糖表达为主。免疫细胞化学染色II型胶原和SOX9阳性,I型胶原弱阳性。甲苯胺蓝染色阳性。结论：适宜的酶消化单层培养法获得的新生兔气管软骨细胞具有分泌软骨细胞外基质成分的特性,可初步为体外构建组织工程气管治疗新生兔气管狭窄的实验研究提供种子细胞。     

TGF-β1诱导分化的兔BMSCs复合左旋聚乳酸\β-磷酸三钙多孔支架材料体外研究实验

目的 研究体外培养rBMSCs经TGF-β1诱导分化的软骨细胞复合左旋聚乳酸\β-磷酸三钙(PLLA\β-TCP)多孔支架材料体外构建仿生人工软骨. 方法 低温挤出成形法制备成PLLA\β-TCP复合多孔支架材料,体外分离、培养rBMSCs至第3代,利用含有TGF-β1特殊诱导系统诱导其向软骨细胞分化,诱导14d后用甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组化进行鉴定后与PLLA\β-TCP多孔支架材料体外复合培养,并取第7、14、21d细胞复合材料进行电镜扫描观察细胞贴附、生长、增殖状况,同时消化收集贴附支架第7、14、21d的细胞,行RT-PCR检测分化软骨细胞相关基因aggrecan、Co12A1在mRNA水平的表达,Western-bolt检测Ⅱ型胶原蛋白的分泌情况.结果 rBMSCs经诱导后向软骨细胞分化,甲苯胺蓝染色见分化软骨细胞分泌糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG),Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阳性;电镜扫描见分化细胞在支架材料分布均匀,黏附良好;RT-PCR及Westem-bolt检测示7、14、21daggrecan、Co12A1在mRNA水平、Ⅱ型胶原蛋白均有不同程度表达. 结论 利用含有TGF-β1特殊诱导系统诱导rBMSCs分化的软骨细胞复合到PLLA\β-TCP多孔支架材料上,细胞生长良好,并能正常分泌软骨细胞特异细胞外基质,体外成功构建了组织工程软骨.     

同种异体脱钙骨与骨髓间充质干细胞关节腔内共培养:与同腔软骨性状的对比

背景:临床发现膝关节内游离体能长期存在于关节腔内并能保持一定的软骨组织学特性和生理学特性,因此大胆提出假设:关节腔环境可能是软骨细胞生长、发育的较佳环境并提出"腔内培养,腔内移植"的理念。目的:观察兔骨髓间充质干细胞复合同种异体脱钙骨基质体外培养或关节腔内培养组织工程软骨与同腔软骨的性状差异。方法:实验分3组进行,体外培养组将经成软骨诱导的乳兔骨髓间充质干细胞与成年兔脱钙骨基质体外复合培养;腔内培养组将经成软骨诱导的乳兔骨髓间充质干细胞与成年兔脱钙骨基质以筋膜包裹,复合培养于成年新西兰兔膝关节腔内,以同腔内正常软骨为对照。结果与结论:培养12周后:①体外培养组苏木精-伊红染色见软骨细胞少量增生,胞核蓝染;甲苯胺蓝染色见软骨细胞排列无序,少量周围基质包绕;Masson染色阳性区域小,细胞排列无序;Ⅱ型胶原免疫组织化学见软骨细胞胞浆及胞外基质少量黄色颗粒。②腔内培养组苏木精-伊红染色见软骨细胞增生,胞核蓝染;甲苯胺蓝染色见软骨细胞成串排列,软骨陷窝形成,周围基质包绕;Masson染色阳性,软骨细胞多,基质蓝染,按一定应力方向排列;Ⅱ型胶原免疫组织化学见细胞外基质中出现较多棕黄色颗粒,Ⅱ型胶原染色阳性。说明骨髓间充质干细胞与同种异体脱钙骨基质复合物可在体外及膝关节腔内培养出组织工程软骨,关节腔内培养的软骨比体外培养的软骨更接近正常软骨。     

以壳聚糖-胶原共混膜为三维支架同种异体工程化软骨的构建

目的探讨以壳聚糖-胶原共混膜为三维支架材料的同种异体软骨细胞构建组织工程化软骨的能力。方法将分离、培养、扩传兔软骨细胞，接种在壳聚糖-胶原共混膜上，倒置显微镜下观察细胞在共混膜上的生长情况。体外培养7d后，将细胞-材料复合物种植在新西兰兔皮下，6周取材，对获得的同种异体工程化软骨进行组织学评价。结果兔软骨细胞接种于壳聚糖-胶原共混膜上4h后有贴壁现象出现，细胞呈梭形。培养48h后，软骨细胞分裂增殖越来越多并向周围延伸，培养第7天取材，HE染色示细胞生长良好，呈梭形。体内培养6周取材，HE染色、Masson染色为均一的成熟软骨组织，且共混膜已降解。结论以壳聚糖-胶原共混膜为支架材料同种异体软骨细胞在有免疫力的动物体内可形成工程化软骨。     

纤维蛋白凝胶与几丁质对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的影响

目的 比较纤维蛋白凝胶与几丁质对骨髓间充质干细胞（BMSCs）向软骨细胞分化的影响,探讨三维支架与软骨组织工程种子细胞BMSCs分化的关系。 方法 BMSCs与几丁质、纤维蛋白凝胶形成复合物,分别体外培养及植入大鼠关节软骨缺损部位。体外培养14d后,进行HE染色、甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色;体内培养2周、4周、6周后,对移植物进行形态学观察,表达软骨特异蛋白分析及BMSCs体内示踪。统计学分析BMSCs向软骨分化情况。 结果 体外培养部分,BMSCs纤维蛋白凝胶组和BMSCs几丁质组的Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性率与对照组无显著差异;体内移植部分,BMSCs-纤维蛋白凝胶组的甲苯胺蓝染色与Ⅱ型胶原免疫组织化学染色积分吸光度（IA）变化率与对照组有显著差异,其他组别软骨分化与对照组无显著差异。 结论 在体外纤维蛋白凝胶或几丁质诱导BMSCs向软骨细胞分化的作用很弱,在体内BMSC-纤维蛋白凝胶可促进BMSCs分化成类软骨细胞。     

成年比格犬骨髓间质干细胞体外软骨方向分化的实验研究

目的：体外诱导成年比格犬骨髓间质干细胞（BMSCs）定向分化为软骨细胞，探讨体外诱导成软骨的方法和条件。方法:比格犬股骨取骨髓10 mL，体外行原代和传代培养扩增，加入转化生长因子（TGF-β1），以高密度细胞团块培养，诱导BMSCs分化为软骨细胞。甲苯胺蓝染色检测软骨基质的分泌，免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达。结果:诱导的软骨样组织甲苯胺蓝染色阳性;Ⅱ型胶原免疫组织化学检测阳性。结论： 应用含TGF-β1的诱导液在体外可以诱导比格犬BMSC分化为软骨细胞，诱导的软骨细胞可作为软骨组织工程较理想的种子细胞。     

胶原-壳聚糖支架与软骨细胞的生长

背景：目前软骨支架材料的种类比较多,但还没有一种材料能完全符合软骨修复的要求。 目的：观察在混合材料胶原-壳聚糖支架中软骨细胞的生长情况。 方法：采用冷冻干燥法将质量分数为2%胶原与3%壳聚糖混合制备胶原-壳聚糖多孔支架。将分离培养的第2代兔软骨细胞接种到胶原-壳聚糖支架上,对照组将软骨细胞接种到无支架的培养板中。观察支架的孔隙率、吸水性及内部形态结构,MTT法检测软骨细胞在支架上的增殖情况,组织切片苏木精-伊红染色,扫描电镜观察细胞在支架的生长、贴附情况,RT-PCR检测细胞支架复合物蛋白聚糖和Ⅱ型胶原mRNA表达情况。 结果与结论：胶原-壳聚糖支架的吸水性为(80.0±0.55)%,孔隙率为(88.5±1.5)%,孔径为100~150 μm,复合细胞培养2周后,细胞增殖活力高,软骨细胞分泌的蛋白聚糖和Ⅱ型胶原mRNA表达明显高于对照组。说明质量分数为2%胶原与3%壳聚糖的混合支架适合软骨细胞生长和快速增殖,是一种良好的修复和重建软骨载体。     

DegraPol支架上培养人气管软骨细胞体外合成组织工程软骨

 目的　探讨以人气管软骨细胞（HTC）为种子细胞在新型生物材料DegraPol泡沫支架上体外合成组织工程气管软骨的可行性。方法　从肺移植供体（9例）取人气管软骨片段，胶原酶消化，将所获软骨细胞传代培养，将传代至6～8代的HTC种植到DegraPol支架上体外静态培养。种植前行II型胶原免疫组织化学染色。于体外静态培养第2 小时末和第 3、7、21、42 天取HTC-DegraPol复合物用噻唑蓝（MTT）法测定细胞增殖活性；培养3周后取HTC-DegraPol复合物制备组织学检测标本行阿辛蓝染色观察硫酸软骨素分泌情况，并制备扫描电镜标本观察HTC在DegraPol支架中培养后的超微结构。结果 HTC在传代培养中显示稳定的增殖活性并分泌II型胶原。种植到DegraPol支架中后培养2 h和3、7、21、42 d时MTT法测定的A值分别为0.112±0.004、0.151±0.021、0.170±0.035、0.176±0.023和0. 213±0.023（每个时点n=4）。培养21、42 d与培养2 h比较， 活性HTC数量差异均有统计学意义（P<0.05）。阿辛蓝染色显示HTC-DegraPol复合物的基质分泌硫酸软骨素，证实HTC- DegraPol复合物具有软骨样结构。扫描电镜观察显示新生软骨在DegraPol材料表面和中央均有形成，但以表面为主。结论　HTC可以在体外良好扩增并以多孔生物材料DegraPol为支架体外合成组织工程气管软骨，但培养条件应进一步优化。     

羧乙基壳聚糖-纳米羟基磷灰石复合材料细胞相容性和生物力学性能的实验研究

制备羧乙基壳聚糖-纳米羟基磷灰石(NCECS/nHA)复合材料,研究其生物力学性能以及与气管软骨细胞的生物相容性。方法 气管软骨片段取自8周龄大耳白兔,Ⅱ型胶原酶消化,将所获得软骨细胞传代培养。将体外制备的NCECS/nHA复合材料分别进行干态标本和湿态标本的生物力学检测。将第3代软骨细胞种植到NCECS/nHA复合材料,分别计算材料表面软骨细胞在2h、6h、12h细胞贴壁率,并用噻唑蓝(MTT)法测定细胞增殖活性。结果 NCECS/nHA复合材料具有良好的生物力学性能。兔气管软骨细胞在NCECS/nHA复合材料表面上12h的贴壁率达(88.4±2.1)％,与其他组差异无统计学意义(P＞0.05)。同时MTT显示气管软骨细胞在NCECS/nHA复合材料表面生长状态良好。扫描电镜结果显示软骨细胞在NCECS/nHA薄膜上增殖和分化良好。结论 NCECS/nHA复合材料具备良好的细胞相容性和适宜的生物力学强度,作为一种具有开发潜力的生物材料,可用于组织工程气管的体外构建。     

以交联透明质酸钠为支架体外构建组织工程软骨

背景：采用组织工程技术再生和重建软骨是目前修复软骨组织缺损效果最好、最有应用前景的方法。 目的：以体外培养的软骨细胞和交联透明质酸钠为支架材料,开发一套体外构建组织工程软骨的完整方案。 方法：分离新西兰兔膝关节软骨细胞,制成细胞悬液滴加于交联透明质酸钠支架上,体外复合培养21 d,提取RNA进行RT-PCR检测,制备冰冻切片进行显微观察和免疫组织化学观察。 结果与结论：软骨细胞接种于交联透明质酸钠支架材料后,可贴附于支架上生长,并且大量细胞聚集成团,在支架材料的纤维间隙中生长或呈单层细胞附着于支架材料纤维。细胞-支架复合物表达软骨组织特异性蛋白聚糖基因和Ⅱ型胶原α1基因,以及软骨组织特异性蛋白Ⅱ型胶原蛋白,可维持软骨细胞表型。表明培养的细胞-支架复合物在体外培养可形成软骨细胞外基质,有望获得组织工程软骨组织。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料;骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性;组织工程全文链接：     

骨髓间充质干细胞与同种异体脱钙骨基质组合生长因子诱导向软骨细胞分化

背景：用组织工程学方法高质量修复关节软骨缺损并达到很好的远期疗效目前尚无定论。鉴于此,课题组提出“同种异体骨髓间充质干细胞关节腔内定向培养组织工程软骨”的实验设技。 目的：同种异体脱钙骨基质组合转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ诱导骨髓间充质干细胞向软骨分化的能力,同时探索其在关节腔内培养促进向关节软骨定向分化的方法。 方法：分离兔骨髓间充质干细胞并行体外培养,分为两组：实验组DMEM培养液中加入转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ,对照组中未加入诱导因子。比较两组细胞的增殖情况和成软骨分化情况。制备同种异体脱钙骨基质支架材料,实验组骨髓间充质干细胞负载到同种异体脱钙骨基质中,构建组织工程软骨复合体,取另2只兔的腰背筋膜包裹后缝合固定到30只兔膝关节腔内行腔内培养。分别于植入后4,8,12周各取10只标本进行组织学切片观察及Ⅱ型胶原免疫组织化学观测,并对结果进行分析。 结果与结论：实验组中骨髓间充质干细胞集落形成效率明显高于对照组(u=3.326,P < 0.01)。实验组细胞爬片做Ⅱ型胶原免疫组化检测呈阳性,对照组未见阳性细胞。组织工程复合体在腔内培养12周后,苏木精-伊红染色见大量软骨细胞增生,胞核染色呈蓝色;甲苯胺蓝染色见软骨细胞成串排列,大量软骨陷窝形成,周围大量基质包绕;Ⅱ型胶原免疫组织化学反应见细胞外基质中出现大量棕黄色颗粒,Ⅱ型胶原染色强阳性。提示转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ可显著促进骨髓间充质干细胞增殖和成软骨分化,骨髓间充质干细胞与同种异体脱钙骨基质结合后可在关节腔内成功培养出组织工程软骨。同种异体脱钙骨基质符合组织工程软骨支架材料的基本要求。     

Tissue engineering of cartilage with the use of chitosan-gelatin complex scaffolds

Chitosan has been shown to be a promising scaffold for various applications in tissue engineering. In this study, a chitosan-gelatin complex was fabricated as a scaffold by a freezing and lyophilizing technique. Chitosan's structure and characteristics are similar to those of glycosaminoglycan (GAG) and its analogs, and possesses various biological activities, whereas gelatin can serve as a substrate for cell adhesion, differentiation, and proliferation. With the use of autologous chondrocytes isolated from pig's auricular cartilage and seeded onto the chitosan-gelatin scaffold, elastic cartilages have been successfully engineered at the porcine abdomen subcutaneous tissue. After 16 weeks of implantation, the engineered elastic cartilages have acquired not only normal histological and biochemical, but also mechanical properties. The tissue sections of the engineered elastic cartilages showed that the chondrocytes were enclosed in the lacuna, similar to that of native cartilage. The presence of elastic fibers in the engineered cartilages was also demonstrated by Vehoeff's staining, and immunohistochemical staining confirmed the presence of type II collagen in the engineered cartilages. Quantitatively, the GAG in the engineered cartilages reached 90% of the concentration in native auricular cartilage. Furthermore, biomechanical analysis demonstrated that the extrinsic stiffness of the engineered cartilages reached 85% of the level in native auricular cartilage when it was harvested at 16 weeks. Thus, this study demonstrated that the chitosan-gelatin complex may serve as a suitable scaffold for cartilage tissue engineering.     

胰岛素样生长因子1与转化生长因子β2促进组织工程软骨构建的体外实验

背景：软骨组织的再生能力差,软骨组织工程能利用较少的细胞、支架材料和细胞因子对缺损进行修复。 目的：观察胰岛素样生长因子1与转化生长因子β2联合应用对组织工程软骨形成的影响。 方法：用酶消化法获取人软骨细胞,将培养的细胞以4×10⁹ L^-1的细胞浓度接种在藻酸钙凝珠支架上,分别加入200 μg/L胰岛素样生长因子1和(或)1 μg/L转化生长因子β2进行立体培养。于培养的第3,5,7,9,11,13天,进行细胞计数,观察软骨细胞的增殖情况。培养2周后,进行大体形态观察和阿尔新蓝-过碘酸雪夫氏染色 (AB-PAS)及抗Ⅱ型胶原免疫组织化学染色。 结果与结论：细胞计数及免疫组织化学染色显示,胰岛素样生长因子1和转化生长因子β2均能促进软骨细胞增殖和软骨相关基质黏多糖及Ⅱ型胶原的分泌,其中胰岛素样生长因子1的作用主要体现在促细胞增殖方面,而转化生长因子β2的作用主要体现在促进软骨相关基质形成方面,二者联合应用具有促进组织工程软骨形成的协同作用。     

自体血清培养新西兰大白兔关节软骨细胞

目的：改进与探讨新西兰大白兔软骨细胞体外培养的方法。方法：取3月龄新西兰大白兔自体血,制备自体血清备用,无菌条件下取4周龄新西兰大白兔双侧膝关节软骨,采用Ⅱ型胶原酶消化并机械吹打的方法,分离关节软骨细胞并应用新西兰大白兔自体血清进行原代、传代培养;采用形态学观察,甲苯胺蓝染色以及Ⅱ型胶原免疫组织化学方法对膝关节软骨细胞进行鉴定,MTT法检测软骨细胞的增值能力;结果：倒置显微镜下见原代软骨细胞2 h后开始贴壁,8 h可形成单层,24 h即可传代。第1~5代细胞表型稳定,增殖力良好。甲苯胺蓝染色显示培养的软骨细胞核呈深染色,细胞质呈淡蓝色;免疫组织化学显示软骨细胞Ⅱ型胶原呈黄褐色表达,MTT检测显示前5代软骨细胞增值能力强,无明显差异;结论：结果表明自体血培养的前5代新西兰大白兔节软骨细胞均可用于膝骨关节炎的研究。     

Evaluation of three-dimensional scaffolds prepared from poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) for growth of allogeneic chondrocytes for cartilage repair in rabbits

Articular cartilage repair using tissue engineering approach generally requires the use of an appropriate scaffold architecture that can support the formation of cartilage tissue. In this investigation, the potential of three-dimensional scaffolds made of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) (PHBHHx) was evaluated in rabbit articular cartilage defect model. Engineered PHBHHx cartilage constructs inoculated in vitro with rabbit chondrocytes for 30 days were examined. Subsequently the constructs inoculated with chondrocytes for 10 days were selected for transplantation into rabbits. After 16 weeks of in vivo implantation, both the engineered cartilage constructs and the bare scaffolds were found to be filled the defects with white cartilaginous tissue, with the engineered constructs showing histologically good subchondral bone connection and better surrounding cartilage infusion. Owing to pre-seeded chondrocytes in the PHBHHx scaffolds, better surface integrality and more accumulation of extracellular matrix (ECM) including type II collagen and sGAG were achieved in the engineered cartilage constructs. The repaired tissues possessed an average compressive modulus of 1.58MPa. For comparison, the defects without repair treatments still showed defects with fibrous tissues. These results demonstrated that PHBHHx is a useful material for cartilage tissue engineering.