pLEGFP—N1-基质细胞衍生因子-1α的构建与目的基因在恒河猴骨髓基质细胞内的稳定表达

目的 构建携带人基质细胞衍生因子（SDF）1α基因的反转录病毒真核表达载体pLEGFP-N1-SDF-1α,转染恒河猴骨髓基质细胞（BMSC）,观察外源性SDF-1α和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因在BMSC中的表达情况.方法 应用基因重组技术,从pBudce4.1-SDF-1α获得SDF-1α基因片段,重组到pLEGFP-N1真核表达载体上.pLEGFP-N1-SDF-1α经病毒包装,转染至恒河猴BMSC,用Western免疫印迹和免疫细胞化学检测表达情况.结果 酶切、PCR和DNA序列鉴定均证实插入基因片段的正确性.BMSC转染pLEGFP-N1-SDF-1α后,在荧光显微镜下发出绿色荧光.western免疫印迹和免疫细胞化学证实SDF-1α在细胞内有效表达.结论 成功构建本研究pLEGFP-N1-SDF-1α,经病毒包装转染至恒河猴BMSC,SDF-1α和EGFP基因在BMSC内有效表达.为BMSC-SDF-1α-EGFP工程细胞自体移植治疗相关疾病提供了依据.     

GFP基因转染对骨髓基质细胞体内向软骨细胞分化的示踪作用

目的 :实现绿色荧光蛋白 (greenfluorescentprotein ,GFP)报告基因在骨髓基质细胞 (BMSC)中的高效、稳定、持久表达 ,直接示踪BMSC在关节软骨缺损内的分布及分化。方法 :构建重组逆转录病毒表达载体RV GFP ,通过PT6 7包装细胞克隆、G4 18筛选及扩增 ,获得大量含GFP基因的假病毒液 ,并直接转染BMSC。将含有GFP基因转染标记的BMSC与生物可降解材料复合后 ,植入猪自体关节软骨缺损处 ,7个月后共聚焦显微镜检测修复组织中GFP标记的BMSC的分布及分化。结果 :经双酶切鉴定证实重组逆转录病毒表达载体RV GFP构建成功 ,转染PT6 7细胞后可在荧光激发波长下 ,发出明亮的绿色荧光 ,转染率达 2 0 %～ 5 0 % ,经G4 18筛选后可达 10 0 %。筛选、扩增后 ,PT6 7细胞的上清培养液可成功地转染BMSC ,筛选后能稳定、持久、高效表达GFP。将标记的BMSC植入关节软骨缺损 7个月后 ,修复组织仍能高效表达GFP ,激光共聚焦显微镜下显示 ,多数新生软骨陷窝内有GFP标记的细胞。结论 :构建的重组逆转录病毒GFP载体 ,能持久标记骨髓基质细胞 ,用于细胞动态变化的研究及细胞转归的示踪 ,该方法简便、灵敏、可靠、直观。标记的BMSC可在关节软骨缺损内分化为成熟的软骨细胞 ,并在软骨缺损的修复中发挥重要作用     

共表达EGFP和CXCR4的大鼠骨髓间充质干细胞的构建及其迁移能力

目的 构建携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)及CXCR4慢病毒载体并实现其在大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)中的表达,观察转CXCR4基因后对rMSCs迁移能力的影响。方法 RT-PCR扩增大鼠CXCR4编码区片段,将其插入慢病毒载体质粒PNL-IRES2-EGFP,获得的PNL-CXCR4-IRES2-EGFP与包装及包膜质粒用脂质体法共转染293T细胞,包装生产慢病毒。所获慢病毒转染rMSCs后,用RT-PCR、Western blot、细胞免疫荧光组织化学和流式细胞术检测转CXCR4基因rMSCs组、转空载体rMSCs组中CXCR4表达情况。利用Transwell方法检测两组rMSCs在SDF-1作用下的迁移能力。结果 双酶切和测序证实,PNL-CXCR4-IRES2- EGFP构建正确,转CXCR4基因rMSCs组CXCR4表达明显增多,在SDF-1α作用下迁移能力明显增强。结论 成功构建带有EGFP和大鼠CXCR4的慢病毒载体,并获得CXCR4-rMSCs基因工程细胞,为深入研究SDF/CXCR4轴在rMSCs向损伤组织定向迁移中的作用奠定了基础。     

RNA干扰抑制基质细胞衍生因子-1基因的表达

目的通过RNA干扰来抑制骨髓基质细胞衍生因子-1(SDF-1)的表达。方法利用脂质体介导人SDF-1特异性小片段双链RNA(siRNA)的表达质粒转染培养的人骨髓基质细胞,G418筛选阳性克隆。RT-PCR和ELISA法检测培养细胞SDF-1 mRNA和上清液SDF-1蛋白。以转染随机变更siRNA碱基序列的表达质粒和未转染的来源相同的骨髓基质细胞作为对照。结果较未转染和转染随机变更siRNA碱基序列表达质粒的骨髓基质细胞,转染SDF-1特异性siRNA表达质粒的骨髓基质细胞SDF-1 mRNA和SDF-1蛋白明显降低。结论用SDF-1特异性siRNA的表达质粒转染骨髓基质细胞,抑制了SDF-1基因表达。     

携带大鼠酪氨酸羟化酶基因慢病毒载体的构建及转染

目的:构建携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)和大鼠酪氨酸羟化酶(TH)基因的慢病毒载体,转染大鼠骨髓间充质干细胞(rMSC),观察TH基因的表达.方法:RT-PCR方法获得大鼠TH基因,将其克隆至慢病毒载体.通过瞬时转染法包装出病毒上清,鉴定滴度.感染rMSCs,荧光显微镜下观察EGFP的表达、转染效率,RT-PCR、免疫印迹法分别检测TH mRNA和蛋白的表达情况.结果:重组慢病毒载体质粒pNL-TH-IRES2-EGFP经双酶切鉴定正确,所获TH基因经测序后与GenBank报道序列完全一致;生产的病毒浓缩后滴度为4.1×10~7TU/ml;感染rMSCs结果显示荧光激发可见绿色荧光,TH-rMSCs、空载体-rMSCs组5d转染效率差异无统计学意义.RT-PCR、免疫印迹法显示TH基因成功在rMSCs中表达.结论:成功构建带有EGFP和大鼠TH基因的慢病毒载体,并获得TH-rMSCs基因工程细胞.     

慢病毒-基质细胞衍生因子-1α-绿色荧光蛋白载体转染大鼠心肌成纤维细胞

目的探讨慢病毒-基质细胞衍生因子-1α-绿色荧光蛋白(LV-SDF-1α-GFP)对心肌成纤维细胞影响,最佳感染条件及目的蛋白表达和分泌特点。方法差速贴壁法分离培养乳大鼠心肌成纤维细胞,观察和免疫荧光鉴定。不同滴度及条件的LV-SDF-1α-GFP转染心肌成纤维细胞,观察荧光表达,探索最佳转染条件。LV-SDF-1α-GFP目的基因病毒以及阴性对照CON145病毒的转染心肌成纤维细胞,绘制生长曲线,探索转染对心肌成纤维细胞的增殖有无明显影响。利用最佳转染剂量组转染心肌成纤维细胞,斑点印迹法(Dot blotting)检测SDF-1α目的蛋白分泌。计量资料进行统计学分析。结果心肌成纤维细胞具很高活性,传至4代纯度高,折光度好,无自发性搏动。LV-SDF-1α-GFP最佳转染感染复数(MOI)值为10,添加感染增强液,聚凝胺组感染效果最好,效率达80%。LV-SDF-1α-GFP组以及阴性对照CON145组对心肌成纤维细胞毒性作用小,细胞形态无明显变化,与非转染组生长曲线相似,差异无统计学意义(P0.05)。转染LV-SDF-1α-GFP的心肌成纤维细胞培养至第4天SDF-1α蛋白分泌量达最高值,差异具有统计学意义(P0.05)。结论 LV-SDF-1α-GFP载体对心肌成纤维细胞具很高的转染效率,细胞毒性小,并能够分泌SDF-1α目的蛋白。     

外周血内皮祖细胞可增强骨髓间充质干细胞SDF-1和MCP-1的分泌并促进其归巢

目的本研究旨在探讨兔外周血内皮祖细胞(PB-EPC)对骨髓间充质干细胞(BMSC)体内归巢的影响及其作用机制。方法应用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)慢病毒表达载体感染BMSC,构建生物骨移植修复兔桡骨缺损模型,实验组采用BMSC和PB-EPC(1∶1)联合培养细胞生物骨;对照组采用BMSC生物骨;空白组仅制作骨缺损不进行任何修复处理。三组均在2、4、8周,实时定量PCR检测骨缺损组织基质细胞衍生因子1(SDF-1)和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)mRNA的表达,ELISA检测血清SDF-1、MCP-1的蛋白水平;免疫组织化学染色检测骨缺损部位2、4、8周EGFP染色阳性率。结果在2、4、8周,实验组SDF-1、MCP-1的表达高于对照组和空白组;4周后实验组骨缺损部位EGFP表达阳性率高于对照组和空白组。结论PB-EPC可促进骨缺损部位BMSC SDF-1、MCP-1的表达且骨缺损部位EGFP表达阳性率增高。     

慢病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因修饰人骨髓基质细胞

背景：原代细胞的转染效率低下一直是制约其发展的主要因素之一,慢病毒转染以其独特的优势成为各种干细胞基因修饰良好的转染方法。 目的：验证慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白基因修饰人骨髓基质细胞的可行性。 方法：将携带增强型绿色荧光蛋白基因的慢病毒在含血清或无血清条件下按不同的MOI值分别转染人骨髓基质细胞,长期观察荧光蛋白表达情况。将经修饰的细胞通过立体定向移植入大鼠纹状体内,观察移植细胞的存活及目的基因的表达情况。 结果与结论：基因转染48 h后,可见人骨髓基质细胞成功表达绿色荧光蛋白,无血清条件下的转染效率高于含血清条件下的转染效率,转染成功的细胞在体外持续培养2个月以上未见明显的荧光消减。转染后的细胞可在大鼠纹状体存活并持续表达绿色荧光蛋白2个月以上。提示慢病毒是一种高效的转染人骨髓基质细胞的载体,慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白基因转染可以作为人骨髓基质细胞的示踪标志用于体内移植研究。     

人胸腺基质淋巴生成素基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的: 构建含人胸腺基质淋巴生成素基因(TSLP)的重组腺病毒载体并表达, 以研究其免疫学功能。方法: 将由人胚肺细胞扩增得到的TSLP基因, 克隆于真核表达载体pcDNA3. 1中, 再亚克隆至穿梭质粒pShuttle中, 并与腺病毒骨架载体pAdEasy -1共同转化大肠杆菌。以获得的重组质粒线性化后转染HEK293细胞, 并包装成病毒颗粒。采用PCR法对重组腺病毒基因进行鉴定, 并以Westernblot检测TSLP蛋白的表达。结果: 通过细菌内同源重组, 成功构建带有人胸腺基质淋巴生成素基因的重组腺病毒质粒, 转染 293细胞后, 包装的重组病毒经PCR检测表明, 基因组含有目的基因,病毒的滴度可达 1×1011pfu/L。Westernblot证实, 感染的肿瘤细胞中有相应基因产物的表达。结论: 通过菌内重组可高效制备带有特定基因的重组病毒。所制备的Ad -TSLP可成功表达相应基因产物, 为进一步研究这一新型细胞因子的功能奠定了基础。     

人树突状细胞SOCS1基因RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建人树突状细胞（hDCs）信号传导通路抑制因子1（SOCS1）基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体。方法根据人树突状细胞SOCS1基因（NM-0037）,筛选出一个靶序列,设计并合成包含正反义靶序列的互补单链寡核苷酸,与经BamH和Xho酶切后的慢病毒载体质粒pRNA-Lenti-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）（含U6启动子和EGFP）连接产生pRNA-Lenti-SOCS1-EGFP慢病毒重组质粒,与慢病毒包装混合物共转染293T细胞,包装产生慢病毒,收集病毒上清,采取系列稀释法测定慢病毒滴度。然后转染hDCs,通过荧光显微镜观察细胞转染情况,利用荧光实时定量PCR和Westernblot检测干扰组、阴性对照组、空白对照组SOCS1的表达情况。结果将目的序列成功连接到载体上,并经测序分析证实载体构建成功。荧光实时定量PCR及Westernblot检测显示慢病毒重组质粒感染hDCs后,与空白对照组及阴性对照组比较,siRNA组mRNA和SOCS1蛋白的表达量显著降低,差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论构建的pRNA-Lenti-SOCS1-EGFP慢病毒载体可有效地抑制hDCs的SOCS1的表达,为进一步研究DCs增强抗肿瘤免疫应答效应奠定基础。     

大鼠ferroportin 1过表达慢病毒载体构建及其转染PC12细胞

目的:构建含大鼠ferroportin 1(FP1,膜铁转运蛋白1)基因和EGFP(绿色荧光蛋白)基因的过表达慢病毒载体并转染PC12细胞。方法:化学合成含有目的基因FP1的质粒,将酶切获得的目的基因连接入线性化慢病毒载体,构建重组质粒PGC-FU-FP1并进行测序鉴定;鉴定正确的阳性克隆采用Lipofectamine2000转染293T细胞,通过荧光显微镜和Western Blot检测FP1表达情况;在脂质体介导下将PGC-FU-FP1、pHelper1.0和pHelper2.0三质粒系统共转染入293T细胞,包装产生慢病毒,并通过实时荧光定量PCR法检测病毒滴度。以重组慢病毒载体质粒PGC-FU-FP1转染PC12细胞,荧光显微镜下观察EGFP的表达,实时荧光定量PCR和Western Blot法分别检测FP1mRNA和蛋白表达情况。结果:FP1基因序列经测序后与GeneBank报道的序列完全一致;重组质粒PGC-FU-FP1中携带有正确的FP1基因并能在293T细胞中表达;病毒滴度为2×108TU/ml。荧光显微镜、实时荧光定量PCR和Western Blot法证实目的基因FP1能被重组慢病毒高效导入PC12细胞并得到过表达。结论:成功构建携带FP1基因的慢病毒载体,并获得FP1基因修饰的PC12基因工程细胞。为进一步研究FP1在帕金森病中的作用及基因治疗奠定基础。     

携EGFP的人Synoviolin基因慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建携EGFP的人Synoviolin基因慢病毒表达载体。方法应用基因重组手段,SalⅠ/NotⅠ双酶切质粒pIRES2-EGFP-syno,得到含EGFP和人Synoviolin的基因片段,将其亚克隆至入门载体pENTR1A的多克隆位点内得到入门质粒pENTR1A-syno-egfp。采用LR重组酶将pENTR1A-syno-egfp和目的载体pLenti4/TO/V5-DEST进行重组反应,形成慢病毒表达载体pLenti4/TO/V5-DEST-syno-egfp。将pLenti4/TO/V5-DEST-syno-egfp与包装质粒混合,利用脂质体共转染293FT细胞,包装产生慢病毒,以293FT细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。结果PCR,酶切及测序结果表明慢病毒表达载体pLenti4/TO/V5-DEST-syno-egfp构建成功,转染后的293FT细胞在荧光显微镜下观察可见强绿色荧光。包装的慢病毒原液滴度为1×10~8TU/ml。结论成功构建了EGFP和Synoviolin基因共表达的慢病毒表达载体,为Synoviolin基因的功能研究提供了高效稳定的转基因技术平台。     

血管生长素-1基因慢病毒载体的构建及其在间质干细胞的表达

目的： 构建带有血管生长素-1（Ang-1）基因的慢病毒载体并实现该基因在大鼠骨髓间质干细胞（rMSCs）中的表达。方法： RT-PCR获得大鼠Ang-1基因，限制性内切酶酶切和基因重组构建慢病毒载体质粒PNL-Ang-1-IRES₂-EGFP，在脂质体介导下与包装质粒HELPER,包膜质粒VSVG共转染293T细胞包装生产慢病毒颗粒并感染rMSCs。 PCR检测Ang-1基因的插入，细胞RT-PCR检测Ang-1 mRNA表达，免疫细胞化学和Western blotting检测Ang-1蛋白的表达。结果： 所获Ang-1基因经测序证实与GenBank报道的序列一致。慢病毒载体质粒PNL-Ang-1-IRES₂-EGFP经SalⅠ和BamHⅠ双酶切后电泳显示 1 512 bp Ang-1目的基因片段和10.5 kb PNL-IRES2-EGFP载体片段。病毒基因组PCR证实Ang-1基因插入。荧光显微镜观察到EGFP表达。细胞RT-PCR检测到Ang-1 mRNA表达。免疫细胞化学和Western blotting检测到Ang-1蛋白表达。结论： 成功构建带有Ang-1基因的慢病毒载体并实现在rMSCs中的表达，为Ang-1基因修饰干细胞的应用研究奠定了基础。     

pLXSN—EGFP逆转录病毒载体的构建及体内外表达的研究

目的构建携带有绿色荧光蛋白（GFP）基因的逆转录病毒载体,观察该报告基因在动物体内外表达情况以及对靶细胞生物特性的影响。方法以质粒pEGFP-C。为模板进行PCR反应,获得增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因片段,定向插入逆转录病毒载体pLXSN获得重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP,转染PA317包装细胞后收集具有感染能力的病毒颗粒,转染人多型性脑胶质瘤细胞SW038-C2,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察EGFP作为报告基因在体内外的表达情况以及对靶细胞生物特性的影响。结果成功克隆携带有EGFP基因的逆转录病毒载体,该载体经包装细胞包装后可有效转染人多型性脑胶质瘤细胞SW038-C2并在体内外稳定表达,对靶细胞及其所成肿瘤的生长无抑制。高表达GFP的靶细胞形态变得细长,FACS检测约有98％的细胞表达GFP,体外培养6个月荧光强度没有明显的衰减,而低表达GFP的靶细胞形态无变化,FACS检测有30．7％细胞表达GFP。结论该载体可在体内外成功表达,对靶细胞的生长无明显抑制,高表达GFP的靶细胞有一定形态上的变化：使用GFP作为报告基因,检测到的病毒载体转染率比实际偏低。     

Beclin1 基因慢病毒表达载体的构建和鉴定

背景：Beclin1基因是哺乳动物的自噬调控基因。 目的：实验拟构建Beclin1 基因慢病毒过表达载体。 方法：聚合酶链反应扩增目的基因Beclin1 后插入慢病毒表达载体pLenex中,构建重组载体pLenex-Beclin1。使用聚合酶链反应、双酶切和DNA的测序方法对其进行鉴定,并与辅助包装质粒共感染293T细胞。慢病毒颗粒转染非小细胞肺癌A549细胞后,用蛋白质印迹法检测Beclin1 基因的过表达效率。 结果与结论：聚合酶链反应鉴定结果显示扩增的阳性片段已插入pLenex载体,聚合酶链反应、双酶切和DNA测序结果表明,重组慢病毒载体pLenex-Beclin1 的插入序列完全正确,重组慢病毒载体感染A549细胞后,细胞内Beclin1蛋白高效表达。结果证实,实验成功构建了Beclin1 基因慢病毒过表达载体。     

基质细胞衍生因子1(SDF-1)预处理的骨髓间充质干细胞移植减轻大鼠颈动脉内皮和平滑肌细胞增生

目的探讨移植基质细胞衍生因子1(SDF-1)预处理的骨髓间充质干细胞(BMSC)对大鼠颈动脉狭窄的作用。方法携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒转染BMSC后经静脉注入大鼠。分为颈动脉损伤模型对照组、 BMSC移植组、 SDF-1预处理的BMSC移植组。细胞移植术后2周,取损伤处血管组织采用免疫荧光技术检测EGFP表达明确BMSC归巢情况;移植术后4周, Evans蓝染色观察损伤内膜内皮化程度,免疫荧光技术检测损伤血管CD31的表达情况; HE染色检测损伤颈动脉新生内膜增生程度,免疫组织化学染色法检测损伤血管增殖细胞核抗原(PCNA)的表达, Western blot法检测血管内皮生长因子(VEGF)的蛋白水平。结果移植SDF-1预处理的BMSC能有效促进干细胞向损伤血管的归巢,并促进损伤血管再内皮化程度。BMSC移植后新生内膜面积、新生内膜面积/中膜面积均低于对照组, SDF-1预处理的BMSC移植组差异更为显著。移植SDF-1预处理的BMSC可显著提高损伤内膜CD31以及VEGF的水平,并抑制PCNA的表达。结论 SDF-1预处理BMSC移植可通过促进BMSC归巢至损伤处并诱导细胞分化,抑制中膜平滑肌细胞增殖来减轻血管狭窄程度。     

EGFP-pBABE逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的 构建表达增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的EGFP-pBABE逆转录病毒载体并对其表达进行鉴定.方法 从pEGFP-N3质粒上切下EGFP片段,连接到pBABE载体,构建EGFP-pBABE重组质粒;将该重组质粒转染到PT67细胞后,荧光显微镜下观察EGFP的表达;收集逆转录病毒感染宫颈癌SiHa细胞后荧光显微镜下观察EGFP的表达.结果 成功构建EGFP-pBABE重组质粒.该质粒转染PT67细胞24 h后,荧光显微镜下可观察到EGFP的表达;用该重组质粒包装的逆转录病毒感染宫颈癌SiHa细胞36 h后,在荧光显微镜下可观察到明显的EGFP表达.结论 成功构建表达EGFP的EGFP-pBABE逆转录病毒载体,为进一步利用该载体制备逆转录病毒并观测逆转录病毒感染细胞的效率奠定了良好的实验基础.     

成年大鼠及猴骨髓基质细胞的体外培养及向神经元的分化诱导

为了探讨成年动物骨髓基质细胞的体外培养和神经元诱导及其不同培养时程对外源基因的转染率,本实验采用直接和间接两种方法分离、培养成年大鼠和猴的骨髓基质细胞。在体外进行神经元诱导,用免疫细胞化学方法进行鉴定;用携带酪氨酸羟化酶基因的逆转录病毒载体转染体外培养第1～10代大鼠骨髓基质细胞,经免疫细胞化学鉴定并计算转染率。结果显示,成年大鼠和猴骨髓基质细胞以未分化状态至少可持续培养20余代,部分细胞表达干细胞的标志蛋白nestin,经BrdU孵育后呈BrdU抗体免疫阳性;经诱导后细胞具有典型的神经元形态,表达神经元的特异性蛋白NeuN;培养第3代至6代的骨髓基质细胞对外源性基因的转染效率较其他时程明显增高。实验结果说明,骨髓基质细胞可以在体外培养并被诱导成为神经元,它还可携带外源性治疗基因。     

细胞内趋化因子重组突变体SDF-1α/54/KDEL的构建及其对CXCR4受体在细胞膜表面表达的抑制作用

构建人基质细胞衍生因子(SDF-1)突变体SDF-1α/54/KDEL重组真核表达质粒,并考察其对T细胞性白血病细胞株Molt-4细胞表面受体CXCR4表达的影响,为尝试表型敲除肿瘤细胞CXCR4以抑制肿瘤的转移提供理论和实验依据.以SDF-WT-Gly×4-Dec/PET30a( )质粒为模板,用PCR法扩增出SDF-1α/54并将其亚克隆至真核表达质粒pEGFP-C3构建成真核表达载体pEGFP-C3/SDF-1α/54/KDEL.经酶切及测序验证后,脂质体介导转染入COS-7细胞,通过Western blot检测SDF-1α/54/KDEL的表达.电穿孔法将重组载体瞬时转染CXCR4高表达的Molt-4,并用流式细胞仪检测CXCR4含量的变化.DNA测序证明:读码框完全正确,重组真核表达载体含有SDF-1α/54基因和编码4肽KDEL的基因,Western blot证明融合蛋白能在COS-7细胞表达.电穿孔转染Molt-4细胞后发现,SDF-1α/54/KDEL可以显著降低胞膜表面CXCR4表达量.由此提示: KDEL介导的SDF-1α/54对Molt-4细胞CXCR4具有表型敲除作用,且此效应不受SDF-1α C端α螺旋缺失的影响.     

外源性胰岛素样生长因子1基因在大鼠骨髓基质细胞中的表达及对其生物学行为的影响

目的：观察人胰岛素样生长因子1（hIGF-1）基因转染大鼠骨髓基质细胞（BMSC）后产物的表达及对BMSC特征的影响.方法：构建hIGF-1逆转录病毒载体并转染BMSC,嘌呤霉素筛选,RT-PCR和ELISA法检测hIGF-1表达,MTT及美蓝、碱性磷酸酶钙钴、苏丹Ⅲ染色观察转染后BMSC增殖、集落形成及分化,并分析药物筛选对其增殖的影响.结果：转染BMSC经筛选后,IGF-1表达的增幅高于未经筛选者（10.7倍：6.7倍）.与空质粒转染组比较,未经筛选的BMSC增殖加快,而经筛选者增殖和集落形成能力降低,向脂肪及成骨细胞分化增强.结论：基因修饰可成功构建高表达IGF-1的BMSC,并促进其增殖和自然分化,但嘌呤霉素筛选对其自我更新能力有负面作用.