小鼠巨噬细胞cDNA酵母表达文库的构建与鉴定

Objective To construct and identify the cDNA library suitable for yeast expression of mouse macrophage by Gateway technique. Methods The mRNA extracted from mouse macrophage was purified. Moreover, cDNA were synthesized by biotin-conjugated Oligo (dT) primer. The double-strand cDNA was bound to attB Adapter and then purified by the cDNA size fractionation columns. BP recombination reaction between the attB- flanked cDNAs ( ＞500 bp) and attP- containing donor vector pDONRTM222 was performed, and the products were transformed into ElectroMAXTM DH10BTMT1 Phage Resistant Cells to generate a Gateway entry cDNA library. Colonies were randomly selected from the plating assay plates. Plasmid DNA was isolated and the cDNA library qualified by plasmid digestion. A reading frame cassette to pGADT7 vector was ligated to construct a Gateway destination vector. The cDNA entry library was transformed into yeast expression library after LR recombination reaction with destination vector and the Gateway entry cDNA library. Results An entry cDNA library was constructed with a titer of (6.80±0.10)× 105 cfu/ml, total clones of 7.48×106 cfu, an average insertion size of about (2.20±0.20) kb and the percentage of recombinant clones was 100%. A yeast expression library was constructed with a titer of (3.24±0.10)× 106 cfu/ml, total clones of 3.89×107 cfu, a mean insertion size about (2.27±0.15) kb and the percentage of recombinant clones was 95.83% (23/24). Conclusion The entry cDNA library and the yeast expression cDNA library meet the requirements of standard library, thereby can be used in further study.     

羊种布鲁氏菌05/43株侵染绵羊肺泡巨噬细胞cDNA文库的构建

 目的 构建羊种布鲁菌 05/43 株侵染绵羊肺泡巨噬细胞的 cDNA 文库。 方法 培养的绵羊肺泡巨噬细胞经羊种布鲁菌 05/43 株侵染后，以 Trizol 试剂提取其总 RNA， 用 cDNA 文库构建试剂盒构建巨噬细胞的 cDNA 文库。随机选取 cDNA 文库中的 18 个克隆进行表达序列标签（EST）序列测定，测序结果用 BlastX 和 BlastN 软件在 GenBank 蛋白质库和核酸库中进行序列同源性比对。 结果 构建的 cDNA 文库的库容量为 1.192 × 10⁶，重组率为 95.65%。18 个 EST 测序，12 个与 CD 抗原基因、细胞因子基因、蛋白酶基因等已知功能的基因序列相关，6 个为未知功能基因的 EST 序列。 结论 成功构建了羊种布鲁菌 05/43 株侵染绵羊肺泡巨噬细胞的 cDNA 文库，这将有助于阐明该菌株的致病机制。     

羊种布鲁菌05／43株侵染绵羊肺泡巨噬细胞cDNA文库的构建

目的构建羊种布鲁菌05／43株侵染绵羊肺泡巨噬细胞的cDNA文库。方法培养的绵羊肺泡巨噬细胞经羊种布鲁菌05／43株侵染后，以Trizol试剂提取其总RNA，用cDNA文库构建试剂盒构建巨噬细胞的cDNA文库。随机选取cDNA文库中的18个克隆进行表达序列标签（EST）序列测定，测序结果用BlastX和BlastN软件在GenBank蛋白质库和核酸库中进行序列同源性比对。结果构建的cDNA文库的库容量为1．192×10^6，重组率为95．65％。18个EST测序，12个与CD抗原基因、细胞因子基因、蛋白酶基因等已知功能的基因序列相关，6个为未知功能基因的EST序列。结论成功构建了羊种布鲁菌05／43株侵染绵羊肺泡巨噬细胞的cDNA文库，这将有助于阐明该菌株的致病机制。     

小鼠子宫巨噬细胞的分离纯化与鉴定

目的 建立一套简便易行、高效可靠的小鼠子宫巨噬细胞的分离纯化及鉴定方法. 方法 5只雌鼠处死并获取子宫,利用酶消化法和机械法相结合制备小鼠子宫组织单细胞悬液,密度梯度离心法收集子宫巨噬细胞,贴壁培养获得纯化的巨噬细胞.采用锥虫蓝拒染法鉴定巨噬细胞活率,利用鸡红细胞吞噬试验检测巨噬细胞吞噬活性,并通过酸性磷酸酶染色、非特异性酯酶染色和CD14免疫细胞化学染色鉴定巨噬细胞纯度. 结果 采用该法每只小鼠可获得子宫巨噬细胞3×105～5×105个,且活率达到(85.35±0.43)%,酶化学和免疫细胞化学鉴定阳性率分别达到了(86.12±1.19)%、(85.83±0.57)%和(84.02±1.64)%. 结论 成功建立了小鼠子宫巨噬细胞的分离纯化方法,并能获得较高的细胞存活率和纯度.     

人骨肉瘤9901细胞cDNA表达文库的构建和鉴定

目的:构建骨肉瘤9901细胞cDNA表达文库,为筛选骨肉瘤特异性抗原创造条件。方法:从9901细胞中提取总RNA,分离mRNA,反转录合成双链cDNA,末端削平,和EcoR I适配子连接。磷酸化EcoR I适配子5’端,过Sephacryl一S400柱除去小于400 bp的cDNA片段,与噬菌体λgt11(载体)连接,用包装蛋白体外包装后形成初级cDNA文库。取适量包装体系倍比稀释后感染E.coli Y1090,测定文库克隆数、重组率,用PCR法测定cDNA插入片段的大小。最后扩增cDNA文库。结果:建成含1.5×106个重组子的骨肉瘤9901细胞cDNA表达文库,重组率为94.3％。重组子中插入的外源片段不小于 0.5 kb,平均长约1.4 kb。结论:达到良好文库的质量标准,适合进一步筛选目的cDNA克隆。     

鸡B淋巴细胞cDNA T7噬菌体表达文库的构建与鉴定

目的:构建鸡B淋巴细胞cDNAT7噬菌体表达文库并对文库质量进行鉴定。方法:利用oligo(dT)-纤维素亲和层析从SPF雏鸡法氏囊细胞制备mRNA,合成的双链cDNA定向克隆到T7EcoR I/HindIII载体臂,包装并构建cDNA表达文库。对文库进行滴度测定和重组子测定。扩增文库并进行PCR鉴定插入序列的长度及分布。结果:文库初始滴度为5×107pfu/mL,扩增后滴度达到1.88×1010pfu/mL。插入片段平均长度1440bp,主要分布在750～2000bp之间。结论:构建的鸡B淋巴细胞cDNAT7噬菌体表达文库具有很高的质量,为进一步研究鸡B细胞发育以及传染性法氏囊病毒(IBDV)的分子致病机制奠定了实验基础。     

人大肠癌抗原基因cDNA噬菌体表达文库的构建和鉴定

目的:为获得大肠癌的特异性抗原基因,构建人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体表达文库.方法:从2株人大肠癌细胞CCL-187和CX-1中提取总RNA,分离纯化mRNA,并以此为模板合成第1链cDNA,用置换法合成第2链cDNA.双链cDNA经末端削平、EcoR Ⅰ接头连接、Xho Ⅰ酶切、过柱分级分离,除去＜400 bp片段.收集符合需要的cDNA片段与噬菌体ZAP Express载体连接,体外包装后获得人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体表达文库.结果:构建的人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体文库,原始库容量为2.3×109 pfμ/L,重组率97%.重组子插入cDNA片段平均大小1 kb以上.结论:成功地构建高质量的人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体表达文库,为大肠癌的特异性抗原筛选奠定了基础.     

巨噬细胞特异的人工miRNA表达载体的构建与鉴定

根据小RNA(microRNA,miRNA)前体分子结构特点而设计并合成的人工miRNA(artificial miRNA,amiRNA)也可以在体内通过与内源miRNA相同或相似的途径发挥RNA干扰(RNA interference,RNAi)作用,目前amiRNA技术在调控基因表达、抗病毒领域得到了广泛应用[1-4]。amiRNA由表达载体生成,弥补了人工合成小干扰RNA(small interfering RNA     

巨噬细胞特异性真核表达载体的构建与鉴定

目的:克隆人清道夫受体A(SR-A)启动子,构建巨噬细胞特异性的真核表达载体。方法:从人外周血中提取基因组DNA,采用PCR技术分别扩增人SR-A的启动子及第一内含子和增强子序列,并插入带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的真核表达载体pcDNA-GFP中,构建巨噬细胞特异性表达载体pSRA-GFP。将pSRA-GFP转染巨噬细胞和非巨噬细胞,通过荧光显微镜观察和流式细胞术比较GFP在不同细胞中的表达水平。结果:成功克隆SR-A启动子,其在巨噬细胞RAW264.7中的表达活性显著高于NRK、LLC、Hepa1-6等非巨噬细胞株(P<0.05)。结论:构建的表达载体pSRA-GFP具有良好的组织细胞特异性,可用于巨噬细胞特异性miRNA表达载体的构建。     

利用多位点Gateway技术构建小鼠平滑肌肌动蛋白α基因启动子慢病毒载体

背景：平滑肌肌动蛋白α基因是相对局限于在血管平滑肌细胞中表达的少数几个基因之一,公认是血管平滑肌细胞表型转化的标志。 目的：利用多位点Gateway技术构建慢病毒载体pLVpuro/平滑肌肌动蛋白α控制绿色荧光蛋白基因的表达。 方法：设计合成含有attB位点的小鼠平滑肌肌动蛋白α基因启动子引物,构建pUp-平滑肌肌动蛋白α;通过LR反应将pUp-平滑肌肌动蛋白α和pDown-绿色荧光蛋白(含att位点的绿色荧光蛋白入门克隆)连接到目的载体pDEST-puromycin,得到pLVpuro/平滑肌肌动蛋白α-绿色荧光蛋白表达载体;经PCR和测序鉴定,将载体质粒瞬时转染C2C12细胞系,并且用免疫荧光染色检测基因的表达。 结果与结论：成功构建pLVpuro/平滑肌肌动蛋白α-绿色荧光蛋白报告基因载体,测序结果表明启动子序列正确;细胞转染实验以及免疫荧光检测证实构建的报告基因载体可以反映平滑肌肌动蛋白α基因的表达情况。     

虎眼万年青EST文库构建和Syntaxin基因的克隆及生物信息学分析

目的构建虎眼万年青 EST 文库,筛选相关基因并对其进行功能鉴定。方法 CTAB 法提取虎眼万年青鳞茎总 RNA,通过SMART 方法构建全长 cDNA 文库,获得库容大于3×106 cfu/ml 的均一化全长 cDNA 文库。随机挑取1440个单克隆测序,并对得到的 EST 序列进行 Blast 分析（NR、NT、Swiss-Prot 和 KEGG）以及 COG 功能分类。结果获得1398条有效 EST 序列,含有1146条单一基因,cDNA 文库平均插入片段长度在1.5 kb 以上,全长率54%,冗余率3.3%。其中两段基因都与 Syntaxin 43基因相似,同源性分别为76%和89%,根据 Blast 比对结果,推断这两个基因片段是同一个 Syntaxin 基因的5'端和3'端。据此设计引物,以虎眼万年青 cDNA 为模板,通过常规的 RT-PCR 扩增得到全长 Syntaxin 基因,将其克隆到大肠杆菌表达载体,接着导入大肠杆菌进行诱导表达,SDS-PAGE 和 Western blot 证实该基因在大肠杆菌获得表达。结论首次构建成功虎眼万年青 EST 文库;并从中筛选得到一条和 Syntaxin 具有同源性的基因,实现了 Syntaxin 蛋白在大肠杆菌中的表达,为 Syntaxin 基因功能的鉴定奠定基础。     

藜草花粉变应原λ噬菌体cDNA表达文库的构建及初步鉴定

目的:构建藜草花粉变应原λ噬菌体cDNA表达文库,并进行初步鉴定.方法:用TRIzol试剂抽提藜草花粉总RNA并分离mRNA.以纯化的mRNA为模板,以含有Xho I内切酶位点和18 by的Poly(dT)序列的引物,用ZAP Express cDNA合成试剂盒反转录合成cDNA.将cDNA修饰、分级纯化后,获得大于400 by的cDNA片段.将带有黏性末端的双链ds cD-NA与Uni-ZAP XR载体连接,采用ZAP Express cDNA文库合成试剂盒利用λ噬菌体构建藜草花粉λ噬菌体cDNA表达文库,用包装蛋白对合成的ds cDNA进行体外包装,以包装产物感染宿主菌XL1-Blue MRF即获得cDNA表达文库.用PCR方法检测cDNA表达文库的滴度和插人片段的大小.结果:构建的藜草花粉变应原λ噬菌体表达文库的滴度为9.7×10(8)pfu/L,重组率为100%,库容量为4.85pfu.插人片段的长度平均约为1.0 kb.结论:构建的cDNA表达文库的容量及插人片段的大小合适,适用于藜草花粉变应原cDNA克隆的筛选,为制备基因重组藜草花粉变应原疫苗奠定了基础.     

酵母双杂合系统BD端血型糖蛋白A 表达质粒的构建

目的:获得血型糖蛋白A(GPA)cDNA片段,并构建酵母双杂合BD端表达质粒。方法:利用RT-PCR方法,从K562细胞mRNA中扩增GPAcDNA片段,约410bp。测序后将其克隆至pbridge载体上。用醋酸锂法将构建好的pbridge-GPA转染酵母菌AH109,观察其在选择性培养基上的表达情况。结果:克隆到的410bpGPAcDNA编码的氨基酸序列基本与公布序列相同。pbridge—GPA转染酵母菌后,在SD/Gal/—His/Ura培养基上出现1mm大小白色菌落。结论:获得了血型糖蛋白AcDNA克隆,pbridge—GPA对酵母无毒性,不能激活检测基因,可作为酵母双杂合系统中的靶基因。     

酵母双杂交随机环肽库的构建、鉴定与扩增

目的 :构建含 16个氨基酸的酵母双杂交随机环肽库。方法 :以PCR扩增人工合成的随机DNA模板 ,经BamHI和EcoRI酶切后 ,克隆入酵母表达质粒pGADT7GH ,构建酵母双杂交随机环肽库并检验其库容及随机性 ,扩增、抽提并纯化酵母双杂交环肽库质粒。结果 :构建了酵母双杂交随机环肽库 ,库容为 1.2 8× 10 7,氨基酸分布与理论频数无显著差异 ,并扩增获得大量高纯度的环肽库质粒。结论 :成功地构建酵母双杂交随机环肽库 ,并获得大量高纯度的环肽库质粒。     

高温致畸金黄地鼠神经管cDNA文库的构建与鉴定

目的:构建高温致畸金黄地鼠神经管cDNA文库。方法:在高温致神经管畸形动物模型上,提取高温致畸金黄地鼠胚胎神经管总RNA,用SMARTTMcDNA文库构建试剂盒反转录合成cDNA第1链,经LD-PCR合成全长双链cDNA,去除小于500 bp的片断后与λTriplEx2噬菌体左、右臂连接,体外包装,构建成未扩增cDNA文库,再进行文库扩增。测定未扩增和扩增文库的滴度及重组率;随机挑取噬菌斑,经PCR扩增,电泳检测所构建cDNA文库的质量。结果:未扩增文库滴度为2.03×106pfu/ml,重组率为98.4%,文库扩增后滴度达2.503×109pfu/ml,重组率为97.6%。插入片段长度分布于500~3 000 bp之间。结论:成功地构建了高质量的高温致畸金黄地鼠神经管cDNA文库。     

人胎儿骨膜全长cDNA文库的构建及测序

目的构建人胎儿的骨膜组织的全长cDNA文库,了解该组织表达谱的特征。方法以胎儿胫骨骨膜为材料,运用末端模板转换技术(SMART)构建cDNA文库,测定库容量并应用菌落PCR的方法确定平均插入片段长度,随后大规模测序并进行生物信息学处理分析。结果所构建的cDNA文库的库容量为5.2×106,平均插入片段的长度为1.2kb。随机测序了25000余个克隆的序列,拼接后为5230个聚类群(contigs)和4714个独立EST(singleton),Blast比对分析得到骨膜基因表达谱的概况,发现了23个候选的新基因。结论构建的骨膜组织的cDNA文库质量满足后续工作的需要,骨膜组织基因表达谱及一些新基因的获得为今后寻找骨膜组织特异性的基因从而研究骨相关疾病的发病机制、发现具有药物开发靶点的功能基因奠定了基础。