骨形态发生蛋白2和7共转染骨髓间充质干细胞的成骨分化

背景：骨形态发生蛋白最主要的作用是诱导骨形成,但因提取困难、代谢速度快、难以准确控制其使用浓度、价格昂贵等限制了其在体外和体内相关研究中的应用。 目的：构建含特异细胞生长因子基因骨形态发生蛋白2,7的腺病毒载体,观察骨形态发生蛋白2和骨形态发生蛋白7基因共转染对兔骨髓间充质干细胞成骨分化的促进作用。 方法：将全骨髓贴壁法分离得到兔骨髓间充质干细胞传至第3代,分为5组,空白组和常规诱导组分别以常规培养基和成骨诱导分化培养基培养;骨形态发生蛋白2, 7腺病毒转染组：分别单独以骨形态发生蛋白2、骨形态发生蛋白7腺病毒进行转染;联合转染组：以2种骨形态发生蛋白腺病毒联合转染。 结果与结论：转染第7天,联合转染组成骨相关基因Runx-2、Osx、Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶mRNA表达均较其他各组增高(P < 0.05);骨形态发生蛋白2,7腺病毒转染组上述指标较空白组和常规诱导组增高(P < 0.05)。转染第14天,联合转染组4个指标均较其他各组明显增高(P < 0.05);同时,4个指标表达均高于第7天(P < 0.05)。病毒转染后第7天,联合转染组Ⅰ型胶原和骨钙素蛋白表达均较其他组明显增高(P < 0.05)。提示对骨髓间充质干细胞进行骨形态发生蛋白2腺病毒和骨形态发生蛋白7腺病毒共转染后,较单基因转染和成骨诱导液诱导更能促进成骨相关基因和蛋白的表达。     

人骨髓间充质干细胞接种纳米晶胶原骨构建组织工程骨

目的观察体外培养的人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）与纳米晶羟基磷灰石/胶原骨（nano-hydroxyapatite/collagen,nHAC）的生物相容性及细胞在nHAC上的生长情况。方法全骨髓法体外培养骨髓间充质干细胞,应用成骨诱导剂诱导向成骨细胞表型转化,通过细胞活性、免疫组化鉴定诱导培养的成骨细胞的细胞学特性。通过倒置显微镜、扫描电镜观察细胞生长及其在nHAC上的生长情况。结果原代培养的骨髓细胞增殖迅速,10～12d左右即可稳定传代,传代细胞7～9d即可传代。经诱导培养的细胞的ALP染色阳性,Von Kossa染色阳性,可见钙化的基质沉积,呈现典型的成骨细胞形态和生物学特征。构建的MSCs与nHAC共培养的模型中,细胞可在nHAC表面良好贴壁。复合培养8天,分布于支架材料上的细胞大量增殖、分泌细胞外基质。第14天,大量细胞在材料表面和孔隙中生长。细胞之间广泛存在突起连接。结论nHAC适合种子细胞的贴附、生长和增殖,是组织工程良好的载体材料。     

兔骨髓间质干细胞成软骨分化的诱导及体内研究

目的研究骨形态发生蛋白-2(BMP-2)对兔骨髓间质干细胞(MSCs)的定向诱导作用,探讨MSCs的成软骨能力。方法分离并培养兔MSCs,BMP-2诱导MSCs向软骨细胞分化,观察其形态学改变及碱性磷酸酶(ALP)活性。将诱导后的MSCs接种于PGA无纺网体外培养2周,将MSCs-PGA无纺网复合体植入裸鼠背部皮下,2个月后取材,进行组织学观察。结果经BMP-2诱导后,MSCs的形态由长梭形向多角形和三角形转化,群体倍增时间约为3.0 d。诱导5、10 d后,ALP活性为0.282±0.015、0.502±0.012,明显高于对照组(0.265±0.010、0.315±0.021)(P<0.01),ALP染色阳性。MSCs-PGA无纺网复合体植入裸鼠后,组织学可见软骨陷窝,陷窝内可见核蓝染的成软骨细胞,证实MSCs具有体内成软骨能力。结论经BMP-2诱导的MSCs向软骨细胞分化和增殖,在裸鼠体内可形成软骨组织。     

骨髓间充质干细胞成骨分化中血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白2的表达

背景：有研究表明血管内皮生长因子可促进内皮细胞增殖、分化和迁移,而骨髓间充质干细胞经诱导分化后细胞自身的血管内皮细胞生长因子及骨形态发生蛋白2如何表达,却鲜见报道。 目的：观察兔骨髓间充质干细胞成骨诱导分化过程中血管内皮细胞生长因子和骨形态发生蛋白2的表达。 方法：取第3代新西兰大白兔骨髓间充质干细胞,1 d后将细胞分为两组：对照组不更换培养基;诱导组加入成骨诱导培养基进行成骨诱导,流式细胞仪检测其表面抗原。RT-PCR和Western-Blot检测细胞成骨分化过程中血管内皮细胞生长因子和骨形态发生蛋白2的表达。 结果与结论：兔骨髓间充质干细胞成骨诱导后,细胞形态由长梭形逐渐变为短梭形,多角形,最后成集落层叠生长;在诱导过程中,碱性磷酸酶活性逐渐增高,与对照组比较有显著性差异(P < 0.05);诱导7 d时Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色、14 时骨钙素免疫细胞化学染色、21 d时钙化结节染色阳性;RT-PCR和Western-Blot结果显示两组均有骨形态发生蛋白2和血管内皮细胞生长因子表达,诱导后第7,14,21天表达比较,差异有显著性意义(P < 0.05),第7天,两者表达最强。说明兔骨髓间充质干细胞分离、提取操作简便易行,且有较强的生长增殖能力,可诱导分化为成骨细胞。其在成骨诱导过程中,骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子表达均先增强后减弱,血管内皮细胞生长因子表达可能对血管生成有促进作用。     

脂肪间充质干细胞复合骨诱导性磷酸钙陶瓷支架的异位成骨CSCD

背景:生物材料的骨诱导现象已经在多种动物实验中被证实。目的:考察磷酸钙陶瓷自身固有的诱导骨生成能力在其作为骨组织工程支架时的表现。方法:取健康家犬10只,在每只的背部肌肉内分别植入骨诱导性磷酸钙陶瓷与自体脂肪间充质干细胞复合物、非骨诱导性磷酸钙陶瓷与自体脂肪间充质干细胞复合物、骨诱导性磷酸钙陶瓷及非骨诱导性磷酸钙陶瓷,植入后8,12周,取出植入材料及其周围组织进行Micro-CT检测和组织形态学检测,评价成骨情况。结果与结论:组织学观察结果显示,骨诱导性磷酸钙陶瓷组及骨诱导性磷酸钙陶瓷与自体脂肪间充质干细胞复合物组均有有异位骨生成,并且骨诱导性磷酸钙陶瓷与自体脂肪间充质干细胞复合物组的成骨量显著大于骨诱导性磷酸钙陶瓷组(P<0.05);其余两组均无异位成骨。Micro-CT检测结果与组织形态学检测结果一致。结果表明骨诱导性磷酸钙陶瓷作为骨组织工程支架材料有明显的成骨优势,而脂肪间充质干细胞作为种子细胞对异位成骨有明显的促进作用。     

骨髓间充质干细胞与复合I型胶原和骨形态发生蛋白2的聚乳酸乙醇酸构建组织工程骨

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSC)体外分离培养后种植到复合Ⅰ型胶原和重组人类骨形态发生蛋白2(rhBMP-2)的聚乳酸乙醇酸(PLGA)生物支架上,构建组织工程骨的可行性.方法密度梯度离心法提取分离BMSC,倒置显微镜观察细胞形态,流式细胞分析法对细胞表面抗原进行鉴定.相分离法制备多孔三维PLGA生物支架,支架材料上复合Ⅰ型胶原和rhBMP-2,扫描电镜观察其超微结构.将第3代的BMSC接种于复合支架上,扫描电镜观察材料的细胞黏附性,将培养6 h 后的细胞-支架复合体植入SD大鼠肌袋内,于2个月后取材进行HE染色,观察其构建组织工程骨的情况.结果 BMSC可在体外分离扩增,表达CD29、CD44,不表达CD34和CD45.制备的PLGA支架孔隙率为90%,平均孔径为100 μm,与BMSC有较好的黏附性.2个月后动物体内细胞-支架复合体的大体观察和HE染色显示,BMSC种植到复合Ⅰ型胶原和rhBMP-2的PLGA生物支架上可构建骨组织.结论 BMSC可在体外长期、稳定培养,是理想的组织工程种子细胞.PLGA与干细胞有较好的黏附性,可用来做组织工程生物材料.BMSC种植到复合Ⅰ型胶原和rhBMP-2的PLGA生物支架上后,在动物体内可构建组织工程骨.     

生物支架材料促进骨髓间充质干细胞成骨分化的研究热点北大核心

背景:目前单一生物支架材料难以满足骨组织工程的成骨需要,骨髓间充质干细胞具有优良的成骨特点,复合支架材料及复合生长因子的支架具有更优良的成骨能力,是目前研究的热点。目的:对不同生物支架材料及其改型后促进骨髓间充质干细胞成骨分化进行综述。方法:由第一作者通过检索中国知网、万方、维普、PubMed、Embase数据库2014年1月至2020年7月发表的相关文献,检索词为"骨髓间充质干细胞,支架,成骨分化,羟基磷灰石,胶原,壳聚糖;Bone marrow mesenchymal stem cells,scaffold,osteogenic,hydroxyapatite,collagen,chitosan",最终选取符合标准的文献69篇。结果与结论:骨组织工程的飞速发展可有效解决骨缺损修复的难题,种子细胞和生物支架材料是骨组织工程的核心内容。骨髓间充质干细胞具有优良的成骨分化能力,被广泛应用于骨组织工程。将不同的支架材料复合,利用先进的制备工艺或者进行支架的表面修饰、添加生长因子等可充分结合各种生物支架材料的优点,诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化和支架血管的形成,达到修复骨缺损的目的,是骨组织工程的研究热点。     

人骨形态发生蛋白2基因修饰自体骨髓间充质干细胞移植促进兔下颌骨牵张成骨实验的组织形态学观察

背景：如何提高牵张成骨过程中新骨形成的速度和质量,缩短牵张成骨治疗时间,减少并发症的发生是目前该领域的研究热点。 目的：观察人骨形态发生蛋白2基因修饰自体骨髓间充质干细胞移植对兔下颌骨牵张成骨新骨形成的促进作用。 方法：36只新西兰白兔随机摸球法分为3组。建立牵张成骨动物模型,在固定期第2天,实验组于牵张间隙注射人骨形态发生蛋白2基因修饰的自体骨髓间充质干细胞;对照组注射等量自体骨髓间充质干细胞;空白组注射等量生理盐水。 结果与结论：在固定期2周及6周实验组牵张区骨小梁形成质量明显好于对照组和空白组。证实骨形态发生蛋白2基因修饰的自体骨髓间充质干细胞移植能有效促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成。     

骨髓间充质干细胞在骨形态发生蛋白2/注射式硫酸钙载体上的成骨

背景：将生长因子复合到支架上构建复合材料可同时具备骨诱导和骨传导作用。 目的：观察骨形态发生蛋白2/注射式硫酸钙复合载体对大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导成骨的影响。 方法：取生长状态良好的第2代SD大鼠骨髓间充质干细胞悬液,分3组培养：实验组将细胞悬液滴加到骨形态发生蛋白2/注射式硫酸钙复合材料表面,对照组在细胞悬液中加入骨形态发生蛋白2,空白对照组正常培养。 结果与结论：3组细胞随培养时间延长逐渐增多,实验组细胞数量最多,明显多于对照组及空白对照组(P < 0.05)。实验组培养不同时间点碱性磷酸酶活性高于对照组及空白对照组(P < 0.05)。体外实验显示骨形态发生蛋白2/注射式硫酸钙复合载体可促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。     

腺病毒介导骨形态发生蛋白2诱导兔骨髓间充质干细胞的成骨分化

背景:天然骨形态发生蛋白2在体内无法实现缓释、持续诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,如何获得内源性骨形态发生蛋白2蛋白是目前研究的热点.目的:探讨腺病毒介导人骨形态发生蛋白2转染兔骨髓间充质干细胞的成骨分化能力及其可能机制.方法:采用腺病毒介导人骨形态发生蛋白2基因转染第3代兔骨髓间充质干细胞,转染后48 h采用qR...     

大鼠BMSCs成骨诱导及复合支架材料构建组织工程骨组织的研究*

目的利用诱导成骨分化的骨髓间充质干细胞(bone marrowmesenchymal stem cells,BMSCs)复合生物支架材料构建组织工程骨组织。方法采用密度梯度离心法获取大鼠骨髓间充质干细胞,原代培养扩增后,条件培养基诱导成骨分化作为实验组,并设非条件培养基培养为对照组。诱导培养后,通过碱性磷酸酶、钙结节染色;I型胶原、骨钙素检测鉴定成骨性。将诱导的BMSCs利用滴加法种入自制组织工程生物支架复合培养,采取扫描电镜、HE切片染色观察培养8天时细胞在支架内部的生长情况。结果密度梯度离心法获取培养的原代骨髓间充质干细胞呈梭形或三角形贴壁生长,以梭形为主;经成骨诱导剂诱导后细胞呈多角形贴壁生长,碱性磷酸酶染色呈阳性、茜素红染色出现阳性的钙化结节;Western blotting检测Ⅰ型胶原蛋白表达较对照组明显增加(<0.05);ELISA法检测骨钙素结果较对照组明显升高(<0.01)。HE切片染色可见支架内部有细胞长入,细胞呈圆形或椭圆形。扫描电镜可见支架内部有大量细胞长入,细胞粘附、生长良好,呈现完全伸展状态,细胞-支架-细胞之间有基质连接。结论本实验获取的原代细胞为骨髓间充质干细胞,诱导剂诱导后成功分化为成骨细胞。采用经诱导成骨后的细胞作为组织工程骨构建的种子细胞,与三维支架材料复合后共培养,使构建的组织复合物更接近骨组织,为临床大段骨缺损的修复增加可能性。     

胶原-壳聚糖复合材料作为组织工程支架的研究

目的 本研究考察壳聚糖对于胶原膜理化性质的影响,选择合适比例的胶原-壳聚糖复合膜作为骨髓间充质干细胞（BMSCs）载体.方法 胶原溶涨液中添加一定比例的壳聚糖,交联并冷冻干燥制备多孔组织工程支架,研究壳聚糖对胶原膜形态学、孔隙率、机械强度、降解特性等理化性质的影响,并初步探讨了胶原-壳聚糖材料作为组织工程三维支架材料与BMSCs的相容性.结果 制备的胶原-壳聚糖支架孔径分布均匀;相对于单纯胶原海绵支架,胶原-壳聚糖复合材料支架降低体外降解速度,提高支架材料的力学性能,稳定支架的结构.BMSCs种植于胶原-壳聚糖（mCol∶mCS=9∶1）支架14 d时,SEM观察到细胞通过微绒毛与支架纤维复合,细胞相容性好.结论 胶原-壳聚糖复合支架有良好的细胞相容性,作为BMSCs诱导体外支架材料具有好的研究前景.     

rhBMP-2／PLGA缓释支架的制备及对MSCs细胞成骨活性的体外研究

目的探讨骨形态发生蛋白（rhBMP-2）的聚乳酸聚乙醇酸共聚物（PLGA）体外缓释生物支架对人骨髓间充质干细胞（MSCs）细胞的影响。方法采用粒子沥滤-冷冻干燥复合工艺制备了附载rhBMP-2的PLGA生物支架,并检测了在PLGA的降解过程中rhBMP-2的释药规律;同时分离培养人骨髓间充质干细胞,体外培养后分别接种于附载和未附载rhBMP-2的PLGA支架上。扫描电镜观察不同时间段MSC在支架上的生长情况;MTT法测定细胞增殖情况。结果rhBMP-2能被包裹进PLGA支架中,而且可以在PLGA支架降解过程中持续释放出来并诱导骨发生。结论骨形态发生蛋白的PLGA复合载体是一种较为理想的新型生物支架。     

Sustained localized presentation of RNA interfering molecules from in situ forming hydrogels to guide stem cell osteogenic differentiation

To date, RNA interfering molecules have been used to differentiate stem cells on two-dimensional (2D) substrates that do not mimic three-dimensional (3D) microenvironments in the body. Here, in situ forming poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels were engineered for controlled, localized and sustained delivery of RNA interfering molecules to differentiate stem cells encapsulated within the 3D polymer network. RNA interfering molecules were released from the hydrogels in a sustained and controlled manner over the course of 3–6 weeks, and exhibited high bioactivity. Importantly, it was demonstrated that the delivery of siRNA and/or miRNA from the hydrogel constructs enhanced the osteogenic differentiation of encapsulated stem cells. Prolonged delivery of siRNA and/or miRNA from this polymeric scaffold permitted extended regulation of cell behavior, unlike traditional siRNA experiments performed in vitro. This approach presents a powerful new methodology for controlling cell fate, and is promising for multiple applications in tissue engineering and regenerative medicine.     

异体皮质人工骨复合物治疗骨折不愈合及骨缺损

背景：异体皮质干燥异体骨为多孔状结构,孔均匀且相互贯通,孔径200 µm 左右,在形态结构上与人类无机骨极为相似。 目的：观察应用骨形态发生蛋白-骨髓间充质干细胞-异体皮质人工骨复合物治疗骨折不愈合及骨缺损的临床效果。 方法：选择33例创伤性骨缺损患者,其中男19例,女14例;年龄26-85岁。首先提取患者自体骨髓间充质干细胞,进一步以异体皮质人工骨为支架材料,同时导入骨形态发生蛋白和骨髓间充质干细胞,通过人工合成方式制成骨形态发生蛋白-骨髓间充质干细胞-异体皮质人工骨复合物,植入骨缺损处,每例植入人工骨复合物20-45 g。 结果与结论：随访6个月-2.5年,根据Mankin及Komender等对同种异体骨移植结果的评分标准,满意32例,不满意1例。复查X射线片示32例达骨性愈合,其中新鲜骨折愈合时间2-7个月,陈旧性骨折愈合时间4-9个月。同种异体松质骨6-9周开始与自体骨融合爬行替代。1例感染性骨缺损移植后迟发性感染,去除内固定及同种异体骨,置管冲洗、局部稳定后再次植骨愈合,随访2年1个月骨感染未复发;1例钢板松动致骨折未愈合,再次行内固定、自体骨移植后骨折愈合。表明应用骨形态发生蛋白-骨髓间充质干细胞-异体皮质人工骨复合物治疗骨折不愈合及骨缺损无明显不良反应,修复效果良好。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料;骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性;组织工程全文链接：     

Tet-On系统调控的人骨形态发生蛋白2基因的表达

目的 在骨髓间充质干细胞(BMSC)水平上构建调控表达人骨形态发生蛋白2(hBMP-2)基因的Tet-On系统,在低剂量强力霉素(DOX)诱导下测定其表达水平.方法 将hBMP-2的cDNA亚克隆至穿梭载体pTRE-Shuttle2,再定向克隆到腺病毒,构建重组的Adeno-X-hBMP-2载体后,将线性化后的Adeno-X-hBMP-2与携带Tet-On转录活化因子的腺病毒载体BD Adeno-X Tet-On virus Stock分别转染人胚肾293(HEK293)细胞扩增,再共转染小鼠BMSC.在DOX诱导下用RT-PCR检测hBMP-2 mRNA的表达,并用ELISA检测DOX诱导浓度与hBMP-2蛋白表达量之间的关系.结果 在BMSC水平上成功构建能诱导表达hBMP-2的Tet-On调控系统,RT-PCR可以检测到hBMP-2 mRNA显著表达;ELISA检测到浓度为0.01 mg/L的DOX,hBMP-2含量为(165.677±0.008)ng/L;高于该浓度时,hBMP-2分泌量对DOX有浓度依赖性(R2=0.892 4,P<0.05).结论 表达hBMP-2的Tet-On调控系统在低剂量DOX诱导后能够显著表达hBMP-2,并在DOX>0.01 mg/L时有浓度依赖性.     

透明质酸复合BMP-2转染骨髓基质干细胞修复兔桡骨干缺损的生物力学研究

目的评价携带人骨形成蛋白-2(hBMP-2)基因重组腺病毒(Adv-hBMP-2)转染的骨髓基质干细胞(BMSCs)与透明质酸(HA)复合构建的组织工程化骨对兔桡骨干缺损的修复效果。方法取兔骨髓行BMSCs培养及Adv-hBMP-2的体外转染,建立兔桡骨干1.5cm的缺损模型。20只兔(40侧)分4组(n=10):第1组注射Adv-hBMP-2转染细胞+HA组,第2组注射Adv-hBMP-2转染细胞组,第3组单纯注射HA组、第4组空白对照组;通过影像学、组织学检查、生物力学测试和骨组织形态计量分析观察修复效果。结果(1)第1组,第12周8侧骨缺损中6侧完全愈合;第二组第12周8侧骨缺损中有3侧完全愈合;第3组和第4组,第12周骨缺损均未愈合。根据骨缺损内新生骨面积行X线疗效评分,各组依次为4.63±0.74、3.38±1.60、1.63±0.74、1.50±0.53,差异有统计学意义(P<0.0001)。(2)第1、2组,4￣8周时骨缺损内均有多量新生骨痂形成,12周时部分骨髓腔再通;第3、4组,4￣8周时骨缺损处为纤维组织填充,12周时骨缺损未愈合,两骨端硬化。新生骨小梁面积第1、2组分别为(16.25±3.49)mm2、(10.37±2.02)mm2,差异有统计学意义(P<0.001)。(3)第1组的最大压缩载荷和弹性模量分别为(211.54±63.58)N和(113.36±56.47)MPa,第2组分别为(126.74±53.13)N和(98.91±63.36)MPa,差异有统计学意义(P<0.05)。平均最大压缩载荷与正常桡骨组之比:前者为75.86%,后者为45.45%。结论HA复合Adv-hBMP-2转染BMSCs构建的组织工程化骨可以修复兔桡骨干骨缺损。     

Chondrogenic differentiation of rat MSCs on porous scaffolds of silk fibroin/chitosan blends

Adult bone marrow derived mesenchymal stem cells are undifferentiated, multipotential cells and have the potential to differentiate into multiple lineages like bone, cartilage or fat. In this study, polyelectrolyte complex silk fibroin/chitosan blended porous scaffolds were fabricated and examined for its ability to support in vitro chondrogenesis of mesenchymal stem cells. Silk fibroin matrices provide suitable substrate for cell attachment and proliferation while chitosan are promising biomaterial for cartilage repair due to it’s structurally resemblance with glycosaminoglycans. We compared the formation of cartilaginous tissue in the silk fibroin/chitosan blended scaffolds with rat mesenchymal stem cells and cultured in vitro for 3 weeks. Additionally, pure silk fibroin scaffolds of non-mulberry silkworm, Antheraea mylitta and mulberry silkworm, Bombyx mori were also utilized for comparative studies. The constructs were analyzed for cell attachment, proliferation, differentiation, histological and immunohistochemical evaluations. Silk fibroin/chitosan blended scaffolds supported the cell attachment and proliferation as indicated by SEM observation, Confocal microscopy and metabolic activities. Alcian Blue and Safranin O histochemistry and expression of collagen II indicated the maintenance of chondrogenic phenotype in the constructs after 3 weeks of culture. Glycosaminoglycans and collagen accumulated in all the scaffolds and was highest in silk fibroin/chitosan blended scaffolds and pure silk fibroin scaffolds of A. mylitta. Chondrogenic differentiation of MSCs in the silk fibroin/chitosan and pure silk fibroin scaffolds was evident by real-time PCR analysis for cartilage-specific ECM gene markers. The results represent silk fibroin/chitosan blended 3D scaffolds as suitable scaffold for mesenchymal stem cells-based cartilage repair.     

AngⅡ诱导大鼠BMSCs联合脱细胞牛心包体外构建工程化心肌组织的实验研究

目的：探讨血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导骨髓间充质干细胞（BMSCs）分化为心肌细胞的能力,及诱导后BMSCs体外联合脱细胞牛心包构建工程化组织心肌的可行性。方法分离培养大鼠BMSCs,用含0.1μmol/L AngⅡ的完全培养基诱导培养第3代BMSCs 24 h,然后换用完全培养基连续培养;对照组采用完全培养基连续培养。采用免疫荧光法检测诱导后的BMSCs表达心肌特异蛋白cTnT、β-MHC情况;透射电镜观察诱导后的细胞超微结构。用去污剂-酶消化法对新鲜牛心包行脱细胞处理,然后将诱导后4周的BMSCs接种于脱细胞牛心包生物支架上培养3 d后,对其进行观察检测。结果 AngⅡ诱导后的BMSCs向心肌细胞分化,可表达cTnT和β-MHC,对照组则不表达cTnT和β-MHC。电镜结果显示诱导后的细胞间可见类肌节组织及明显的桥粒连接;新鲜的牛心包经去污剂-酶联合四步法脱细胞处理及京尼平交联后,HE染色观察脱细胞的效率接近100%。扫描电镜观察发现脱细胞处理后的牛心包表面无细胞残留且表面排列杂乱,放大后可见有2μm小孔。观察体外构建的工程化心肌显示诱导后的BMSCs可良好地黏附于脱细胞牛心包生物支架表面并生长增殖,且少量可渗透到支架内部。结论 AngⅡ诱导的大鼠BMSCs可向心肌细胞方向分化,表达心肌特异蛋白cTnT和β-MHC。将其种植于脱细胞牛心包生物支架上,表面黏附良好,且可渗透到支架内部及血管周围,有望用于构建具有血管网络化的组织工程化心肌。     

双基因转染犬骨髓间充质干细胞复合HA/ZrO2生物材料新型组织工程骨的构建及其体外成骨能力的研究

目的 构建骨形态发生蛋白2(BMP-2)、血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)双基因修饰的骨髓间充质干细胞(BMSCs)复合羟基磷灰石复合二氧化锆(HA/ZrO₂)生物材料的新型组织工程骨,并观察该组织工程骨在体外的成骨能力。方法 采用有机泡沫作为模版,干铺烧制法制备新型的蜂窝状HA/ZrO₂梯度生物材料,电镜观察新型生物材料的表面特性,生物力学试验机检测其力学性能。采取1岁龄健康beagle犬骨髓分离原代BMSCs进行培养,建立双基因修饰的BMSCs复合蜂窝状HA/ZrO₂梯度生物材料的共培养体,构建新型组织工程骨。实验分为4组:未转染组,只转染BMP-2(BMP-2组)和VEGF165(VEGF165组)单一目的基因的BMSCs,以及转染BMP-2、VEGF165共基因慢病毒的BMSCs组(BMP-2+VEGF165组)。显微镜下观察细胞在支架材料上的生长情况,用碱性磷酸酶染色检测各组细胞成骨分化能力,免疫组织化学染色检测其成骨细胞特异性蛋白骨Ⅰ型胶原及骨钙素的分泌。结果 新型材料电镜下其表面整体呈多孔状,孔径125~550 μm,各孔之间存在缝隙联结;其平均抗弯强度为812.25 MPa,最高可达987.12 MPa;共培养体建立后扫描电镜观察转染后的BMSCs在支架材料上黏附生长状况良好,双基因联合转染组细胞分泌基质旺盛;BMP-2+VEGF165组细胞碱性磷酸酶活性检测明显高于其他各组(F=1 029.398,P<0.01),免疫组织化学染色在不同阶段发现成骨细胞早晚期分泌的骨Ⅰ型胶原及骨钙素特异性蛋白。结论 新型的蜂窝状HA/ZrO₂梯度生物材料是一种合适种子细胞生长的支架材料,并且其力学满足人体四肢承重骨的需要;VEGF165、BMP-2双基因转染BMSCs后具有协同作用,能够促进其在体外的成骨分化。