靶向髓样细胞表达的激发受体1基因短发夹RNA真核质粒表达载体的构建及筛选

目的 构建编码髓样细胞表达的激发受体1(TREM-1)基因短发夹RNA(shRNA)真核质粒表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体.方法 针对TREM-1的靶位点设计含shRNA的靶序列,分别构建pGCsi-TREM-1 shRNA1和pGCsi-TREM-1 shRNA2的质粒表达载体和pGCsi-NegshRNA阴性质粒表达载体,通过酶切及测序进行鉴定.鉴定后以脂质体包裹转染肺泡上皮A549细胞,分为未转染对照组(A组)、转染空质粒载体pGCsi对照组(B组)、转染阴性shRNA质粒表达载体pGCsi-NegshRNA对照组(C组)、转染TREM-1 shRNA1质粒表达载体组(D组)和转染TREM-1shRNA2质粒表达载体组(E组),48 h后观察转染细胞绿色荧光蛋白表达效果.转染24、48、72 h后,以A组为对照采用MTT法测定B、C、D、E组细胞的存活率.转染48 h后,通过荧光定量PCR检测各组TREM-1 mRNA的表达水平并与转染前相比较.结果 经酶切和测序鉴定证实,目的 TREM-1基因shRNA1和shRNA2片段已被克隆到pGCsi载体中.荧光显微镜下,B、C、D、E组A549细胞有明显的绿色荧光蛋白表达.各时间点B、C、D、E组细胞存活率均达90%以上.A、B、C 3组转染前后TREM-1mRNA的表达水平差异无统计学意义,D、E组转染的重组质粒均能有效抑制A549细胞的TREM-1mRNA的表达([(1.945±0.252)×105比(1.010±0.194)×105,(1.933±0.216)×105比(1.202±0.171)×105,均P＜0.05],抑制率分别为48.07%和37.82%.结论 成功构建了靶向TREM-1基因的shRNA质粒表达载体,可有效抑制细胞中TREM-1目的 基因的表达,为后续脓毒症的基因治疗提供了依据.     

转导骨桥蛋白短发夹状RNA预防动脉粥样硬化模型兔血管成形后的再狭窄

背景：血管成形后再狭窄严重限制了经皮冠状动脉介入治疗的应用和远期疗效。平滑肌细胞的表型转变,增殖是血管成形后再狭窄的重要机制。 目的：探讨利用球囊在体转导骨桥蛋白短发夹状RNA,通过抑制实验性动脉粥样硬化模型兔损伤血管部位骨桥蛋白的表达,预防血管成形后再狭窄。 方法：构建动脉粥样硬化模型兔20只,随机等分成空质粒组和OPN-shRNA质粒组,分别利用球囊在腹主动脉导入OPN-shRNA质粒和空载体。 结果与结论：2组兔球囊扩张后血管平滑肌层出现特异性绿色荧光,且随转染后时间的延长荧光强度逐渐降低,与空质粒组相比,OPN-shRNA质粒组兔扩张动脉的管腔面积明显增加,而斑块负荷明显减小。提示在动脉粥样硬化兔模型局部血管利用球囊导管能成功地转导OPN-shRNA质粒,被扩张血管的再狭窄程度减轻,血栓负荷减轻。这对于预防模型兔血管成形后再狭窄的发生具有十分重要的意义。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植;肝移植;移植;心脏移植;组织移植;皮肤移植;皮瓣移植;血管移植;器官移植;组织工程全文链接：     

质粒载体系统介导的人肿瘤细胞RNA干扰作用

目的 研究质粒载体介导的肿瘤细胞RNA干扰效果。方法 构建以H1 RNA为启动子的针对GFP基因不同序列片段的RNAi质粒pLasRiGFP1／2／3。将其与pcdna3．1EGFP共转染HEK293、Hela和SPCA1细胞或单独转染SPCA1-GFP，用倒置荧光显微镜观察和流式细胞仪分析GFP表达。结果 pLasPdGFP1、pLasRiGFP2和pLasRiGFP3在HEK293中对GFP表达的抑制率分别为97．5％、97％和89％，Hela细胞中为83％、90％和90％，SPCA1细胞中为65％、55％和40％。pLasRiGFP1与plasRiGFP2在SPCA1-GFP细胞对GFP的抑制率分别为53％和58％。RNAi作用在48，96h最强，并随RNAi质粒增加抑制效果呈增强趋势，但到达一定量后作用趋势平缓。结论 H1 RNA为启动子的RNAi质粒能有效介导肿瘤细胞RNAi，其作用存在剂量和时间效应，受靶序列、细胞类型等因素的影响。     

雌激素受体α亚基基因小干扰RNA表达载体的构建

目的探讨构建雌激素受体α（ERα）亚基基因小干扰RNA（siRNA）表达载体的方法，为建立基因敲除ERα亚基突变株提供素材和依据。方法利用计算机辅助设计ERα特异性siRNA，体外合成siRNA基因，并将其定向克隆入pSilencer4．1-CMV质粒中，构建真核表达载体。采用PCR扩增、酶切分析鉴定。结果双酶切法鉴定重组质粒后，RT-PCR法鉴定ERasiRNA载体可特异地抑制人成骨样细胞株MG63细胞中ERα的表达。结论ERα亚基特异性siRNA表达载体被成功构建，为进一步研究雌激素受体在骨代谢中的作用机制提供了实验素材和依据。     

介导RNAi的tRNAVal启动子质粒载体的建立

目的 构建以tRNA^Val启动子控制shRNA转录引发RNAi的质粒载体。方法 从人基因组中用PCR方法扩增出tRNA^Val基因片段，人工突变去除3′末端数个碱基，连以Linker序列，用此经过改造的tRNA^Val启动子，构建控制针对荧光素酶的shRNA转录载体pUC-tRNA^Val lueRi，与pMAMneoLuc共转染BHK-21细胞，观察对荧光素酶表达的影响。结果 pUC-tRNA^Val lucRi可以高效特异性抑制pMAMneoLuc中荧光素酶的表达，效率达97．1％～99．5％。结论 tRNA^Val启动子载体可以高效转录shRNA，引发哺乳动物细胞RNAi现象。     

雌激素受体α亚基基因小干扰RNA表达载体的构建

目的 探讨构建雌激素受体α(ERα)亚基基因小干扰RNA(siRNA)表达载体的方法,为建立基因敲除ERα亚基突变株提供素材和依据.方法 利用计算机辅助设计ERα特异性siRNA,体外合成siRNA基因,并将其定向克隆入pSilencer 4.1-CMV质粒中,构建真核表达载体.采用PCR扩增、酶切分析鉴定.结果 双酶切法鉴定重组质粒后,RT-PCR法鉴定ERαsiRNA载体可特异地抑制人成骨样细胞株MG63细胞中ERα的表达.结论 ERα亚基特异性siRNA表达载体被成功构建,为进一步研究雌激素受体在骨代谢中的作用机制提供了实验素材和依据.     

猪Toll样受体7基因人工miRNA表达质粒的构建与筛选

目的 构建猪Toll样受体7(TLR7)基因的人工miRNA (amiRNA)特异性表达载体,筛选有效amiRNA.方法 RT-PCR扩增猪TLR77基因的1984 ～2648 bp序列,构建融合表达载体pTLR7-EGFP.设计针对猪TLR7的5对amiRNA,构建重组干扰质粒pcDNA5-miRTLR7.将pcDNA5-miRTLR7和pTLR7-EGFP共转染NIH-3T3细胞,通过RT-PCR检测amiTLR7的表达,以荧光显微镜观察和流式细胞术分析干扰效率.结果 5个amiTLR7都成功表达,且均能沉默NIH-3T3细胞中TLR7基因的表达,抑制效率为36.99％到97.28％,其中amiTLR7-3效果最佳.结论 成功构建了针对猪TLR基因的amiRNA表达质粒,筛选出了沉默猪TLR7基因的最佳干扰序列.     

大鼠delta阿片受体短发卡RNA干扰真核表达载体的构建和鉴定

背景：长期应用阿片受体治疗疼痛会导致药物耐受或成瘾,可能与delta阿片受体密度上调有关。 目的：设计及构建大鼠delta阿片受体短发卡RNA真核表达载体并鉴定。 方法：根据大鼠delta阿片受体mRNA序列设计并体外合成短发卡RNA寡核苷酸片段,退火形成双链,克隆到线性化质粒pGenesil-1,然后进行酶切和测序鉴定。 结果与结论：酶切证明delta阿片受体-短发卡RNA已经插入到质粒载体pGenesil-1里,测序结果证明均为插入正确的克隆质粒,而且质量均符合设计标准,证实靶向大鼠delta阿片受体基因的短发卡RNA真核表达载体构建成功。     

钙粘附蛋白N-cadherin基因RNAi质粒载体的构建与鉴定

目的:构建有效的小鼠神经型钙粘附蛋白(N-cadherin)基因RNA干扰质粒载体。方法:在小鼠基因库中选择3个靶序列并设计合成相应3对寡核苷酸序列,同时合成1对阴性对照寡核苷酸序列,然后将以上4对寡核苷酸序列退火后连入pSilencerTM 3.1-H1 hygro质粒并分别命名为pSicad1、pSicad2、pSicad3、pSi-control。酶切和测序鉴定后,将以上重组质粒转染MN9D细胞,用Western Blot和半定量RT-PCR方法检测N-cadherin基因mR-NA和蛋白的表达水平。结果:酶切和测序证实目的寡核苷酸片段已被准确克隆到pSilencerTM 3.1-H1 hygro质粒,与对照组相比,pSicad2和pSicad3转染MN9D细胞后,N-cadherin mRNA和蛋白水平的表达均受到明显抑制,其中N-cadherin蛋白水平在pSicad3组下降50%(P0.01)。结论:结果表明已成功构建了小鼠N-cadherin基因RNAi质粒载体,为N-cadherin功能研究奠定了基础。     

靶向端粒酶反转录酶基因短发夹RNA载体的构建

背景：端粒酶反转录酶对端粒酶活化起重要作用。 目的：利用pLentilox3.7.U6载体构建靶向大鼠脊髓星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的短发夹RNA干扰分子表达载体并鉴定其作用。 方法：选择端粒酶反转录酶基因上两段序列体外合成RNA干扰分子的正义链和反义链模板序列,经退火成互补双链,与线性化pLentilox3.7.U6载体连接、转化大肠杆菌和序列测定,应用蛋白质印迹和免疫荧光技术,在体外培养的大鼠脊髓星形胶质细胞模型上验证构建的干扰载体抑制端粒酶反转录酶基因表达的效果。 结果与结论：蛋白质印迹和免疫荧光检测结果表明,重组质粒干扰组中星形胶质细胞端粒酶反转录酶均呈低表达。结果证实,实验成功构建了针对大鼠脊髓星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的短发夹RNA质粒表达载体,此载体能有效抑制体外培养的大鼠脊髓星形胶质细胞端粒酶反转录酶的表达。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

Attenuation of SARS coronavirus by a short hairpin RNA expression plasmid targeting RNA-dependent RNA polymerase

Severe acute respiratory syndrome (SARS) is a highly contagious and sometimes a lethal disease, which spread over five continents in 2002-2003. Laboratory analysis showed that the etiologic agent for SARS is a new type of coronavirus. Currently, there is no specific treatment for this disease. RNA interference (RNAi) is a recently discovered antiviral mechanism in plant and animal cells that induces a specific degradation of double-stranded RNA. Here, we provide evidences that RNAi targeting at coronavirus RNA-dependent RNA polymerase (RDRP) using short hairpin RNA (shRNA) expression plasmids can specifically inhibit expression of extraneous coronavirus RDRP in 293 and HeLa cells. Moreover, this construct significantly reduced the plaque formation of SARS coronaviruses in Vero-E6 cells. The data may suggest a new approach for treatment of SARS patients.     

短发夹RNA对人端粒酶催化亚基表达的影响

目的:研究短发夹RNA(shRNAs)对人端粒酶催化亚基(hTERT)表达的影响。方法:将编码针对hTERT的shRNA的寡聚核苷酸克隆入哺乳细胞shRNA表达载体pUC18U6形成pUC18U6ht,然后以脂质体法转染入HepG2细胞。被pUC18U6和表达抗绿色荧光蛋白shRNA的pUC18U6GFPsir转染的HepG2细胞作为对照。转染细胞的hTERTmRNA以实时定量RT-PCR定量测定。结果:与对照相比,shRNA可使hTERTmRNA的水平降低49%(P<0.05)。结论:shRNAs抑制了hTERT的表达。     

靶向MAG基因shRNA慢病毒载体的构建及其对MAG基因表达的沉默

 目的：设计以MAG基因为靶点的短发夹状RNA（shRNA）,构建重组慢病毒载体并鉴定此RNA干扰体系对MAG基因表达的影响。方法：将3条靶向大鼠MAG基因的shRNA片段插入至慢病毒载体pWPI,与pCDNA3-MAG-FLAG质粒用Lipofectamine　2000共转染293T细胞,Western blotting法鉴定出最有效的shRNA。此重组质粒与pAX2和pMD2G经293T细胞包装后,产生的重组慢病毒感染少突胶质细胞,48 h后Western blotting法检测MAG蛋白的表达情况。结果：经双酶切后测序鉴定,构建了MAG shRNA慢病毒载体pWPI-MAG,鉴定出shRNA-2为最为有效的shRNA。重组慢病毒能明显抑制少突胶质细胞中MAG的表达。结论：慢病毒介导的shRNA干扰技术可特异性阻断MAG的表达,为进一步探讨MAG特异性shRNA治疗神经系统髓鞘损伤奠定了基础。     

Mcl-1短发夹RNA在Raw264.7细胞内特异性的筛选

目的:将Mcl-1shRNA转染到Raw264.7细胞内,针对shRNA对小鼠Raw264.7巨噬细胞系中Mcl-1表达的影响,筛选出沉默Mcl-1基因效果最明显的特异性shRNA真核表达质粒。方法:将特异性shRNA经脂质体介导转染小鼠巨噬细胞系Raw264.7;半定量RT-PCR和Western blot分别检测转染24、48 h后Mcl-1 mRNA水平变化和Mcl-1蛋白表达情况,分析对应不同位点的三对特异性shRNA片段对Mcl-1的沉默效果。结果:特异性shRNA片段在24、48 h均能有效降低Mcl-1 mRNA和蛋白水平,沉默效率高于正常组、脂质体组和阴性对照组,差异具有统计学意义(P0.05);对应不同位点的三对shRNA真核表达质粒,其中Mcl-1 shRNA3对Mcl-1 mRNA和蛋白的抑制作用均最强。结论:RNA干扰技术可有效下调小鼠Raw264.7巨噬细胞系中Mcl-1 mRNA水平,明显下调Mcl-1蛋白表达。成功筛选出了沉默Mcl-1基因效果最明显的特异性shRNA真核表达质粒。     

短发夹状RNA特异性抑制HeLa细胞的Hax-1基因表达

目的:构建靶向Hax-1基因的短发夹状干扰RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体pGenesil-Hax-1,并探讨siRNA靶向抑制Hax-1基因表达的作用。方法:根据shRNA设计的原则,在Hax-1全长序列中选取含19个核苷酸靶序列,设计形成siRNA的DNA模板并克隆到shRNA表达载体pGenesil-1中,获得可靶向抑制Hax-1基因的重组shRNA表达载体。采用LipofectamineTM2000转染试剂将pGenesil-Hax-1导入HeLa细胞中;分别采用RT-PCR以及Western blot从mRNA和蛋白水平上检测干扰效果。结果:半定量PCR及Western blot结果表明,siRNA可使Hax-1mRNA的转录水平得到显著抑制(P<0.01),Hax-1蛋白的表达较对照组减少约70%。结论:靶向Hax-1基因的重组shRNA表达载体pGene-sil-Hax-1介导的siRNA可显著抑制Hax-1基因在人宫颈癌HeLa细胞中的表达。     

靶向PERK基因的shRNA真核表达载体的构建及对内质网应激状态下L02肝细胞凋亡的影响

目的: 构建靶向RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶(PERK)基因的短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体,观察其对内质网应激(ERS)状态下人正常肝细胞株L02凋亡的影响。方法: 根据PERK基因核苷酸序列,按照小干扰RNA(siRNA)靶序列的设计原则,设计并构建靶向PERK基因mRNA的3个特异性shRNA表达载体(PERK1-shRNA、PERK2-shRNA、PERK3-shRNA)和1个无同源性的阴性对照载体(HK-shRNA),经酶切和测序鉴定确认shRNA载体构建成功后,转染L02肝细胞,RT-PCR和Western blotting方法检测PERK基因的表达,筛选出抑制效果最佳的表达载体。分别应用MTT法和流式细胞术检测ERS状态下沉默了PERK基因的L02肝细胞活力和凋亡的变化。结果: 经酶切和测序鉴定证实,4个shRNA表达载体均构建成功。RT-PCR和Western blotting结果显示,与空白对照组相比,PERK1-shRNA、PERK2-shRNA、PERK3-shRNA组L02细胞中PERK基因在mRNA及蛋白水平上的表达均明显降低(P<0.05),其中PERK1-shRNA干扰效果最强。MTT法和流式细胞术结果表明,沉默PERK基因能明显增加ERS状态下肝细胞活力、抑制其凋亡(P<0.05)。结论: 成功构建靶向PERK基因的shRNA真核表达载体,PERK基因缺失对ERS状态下L02肝细胞凋亡有抑制作用。     

BACE1基因RNA干扰质粒的构建及干扰效果的鉴定

目的构建BACE1基因干扰质粒,并研究其在neuro．2a细胞中的表达,为以其为靶点的基因治疗提供稳定转染的质粒。方法选择人、小鼠和大鼠的BACE1基因共有序列为干扰靶点,设计3组连接有GFP的干扰质粒,将构建好的质粒转染nellro-2a细胞,通过RealtimeRT—PCR及Western—blotting的方法分别在RNA及蛋白质水平上检测BACE1的表达,以分析其干扰的效率。结果经酶切及测序证实,插入的DNA片段序列与设计序列完全一致。与空质粒对照组相比,3个干扰靶点对BACE1基因的表达均有不同程度的抑制作用。其中pYr-1．1-siBACE1在mRNA水平及蛋白质水平干扰效果均最好。结论成功构建了BACE1基因的干扰质粒pYr-1．1-siBACE1,并能有效抑制neuro．2a细胞内源性BACE1基因表达,为靶向BACE1基因的治疗提供了有力的工具。