高原红细胞增多症患者骨髓间充质干细胞的培养

目的：对高原红细胞增多症（HAPC）患者骨髓间充质干细胞（MSCs）进行分离培养,为进一步探讨其生物学特性奠定基础。方法：采用密度梯度离心和贴壁筛选法对10例HAPC和10例正常人骨髓MSCs进行分离培养,倒置显微镜下观察MSCs形态,流式细胞仪行细胞表面抗原检测,检测MSCs生长情况,判断其增殖能力。结果：骨髓密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞（BMMNC）后培养,骨髓MSC均分离培养成功,贴壁细胞呈梭形;两组骨髓MSCs均表达CD29、CD105和CD13,不表达CD45、CD4、CD8、CD14、CD3、CD34和HLA-DR（P〉0.05）。HAPC骨髓MSCs增殖能力高于正常骨髓（P〈0.01）。结论：HAPC患者骨髓MSCs体外可有效分离培养,所培养的细胞成分单一,可供进一步实验应用。     

改良直接贴壁法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞及其鉴定

目的 观察并鉴定兔骨髓间充质干细胞生物特性,建立一套简单、高效的培养方法.方法 采用直接贴壁法分离培养兔骨髓间充质干细胞,倒置显微镜下观察其形态.MTT法测定其增殖水平并绘制其生长曲线.流式细胞仪测定第三代骨髓间充质干细胞表型.结果 细胞培养第5d,镜下见细胞呈小集落生长,形态呈多边形;7～8 d小集落融合成大集落,10d左右可传代.第二代细胞镜下呈梭形成纤维样细胞,即间充质干细胞;细胞生长曲线成S形;流式细胞仪检测细胞表达CD 73、CD 90、CD 105、不表达CD 34、CD 45.结论 改良直接贴壁法可获得大量、纯化、稳定的间充质干细胞.     

慢性高原病患者骨髓间充质干细胞培养方法的改良

目的：对慢性高原病患者骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）进行体外改进分离纯化和培养扩增,为慢性高原病患者MSCs的进一步研究奠定基础。方法：取慢性高原病患者骨髓细胞液,采用改良密度梯度离心结合贴壁培养法进行分离纯化,并传代扩增。结果：经改良密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化慢性高原病患者骨髓MSCs,MSCs在MSC专用培养液中生长性状相对稳定,细胞呈成纤维细胞样生长,细胞贴壁存活率高,传代时间短,细胞纯度高,细胞稳定扩增。结论：改良密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化慢性高原病患者骨髓MSCs,为慢性高原病患者MSCs的进一步研究提供了来源。     

人胚胎骨髓间充质干细胞的分离与鉴定

目的：摸索分离和鉴定高纯度的人胚胎骨髓间充质干细胞。方法：采用密度梯度离心法，分离含有间充质干细胞的人胚胎骨髓细胞悬液，获得人胚胎骨髓间充质干细胞。用流式细胞仪检测获得的细胞中人胚胎骨髓间充质干细胞含量。结果：获得的细胞中人胚胎骨髓间充质干细胞含量达85％。结论：密度梯度离心法分离获得的人胚胎骨髓间充质干细胞纯度高。     

大鼠间充质干细胞的体外分离培养及CFSE标记

目的 探讨体外分离、培养及荧光染料CFSE标记大鼠间充质干细胞(MSCs)的方法.方法 Wistar大鼠10只.用密度梯度离心及贴壁法相结合的方法分离纯化大鼠MSCs并进行鉴定.荧光染料CFSE标记MSCs,荧光显微镜检测标记率,CCK-8法检测标记细胞的增殖能力.结果 原代MSCs 72h贴壁,呈梭形,集落样生长;传代后,细胞变为形态均一,排列有序的成纤维细胞样.CFSE标记当天,荧光显微镜下大鼠MSCs呈明亮的绿色荧光,标记率达100%,随着培养时间延长,荧光强度逐渐减弱,标记率随之下降,标记4周后,标记率下降至78%;标记细胞的增殖能力与未标记细胞相比,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 利用密度梯度离心法结合贴壁法可以获得比较纯的MSCs;CFSE短期标记MSCs效率很高,且标记细胞的增殖能力不受影响,但荧光强度及标记率随着时间延长而下降.     

兔骨髓间充质干细胞获取与特性的实验研究

目的：完善兔骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）体外扩增培养体系并观测其特性。方法：兔骨髓经密度梯度离心获得单核细胞后贴壁培养，光镜、透射电镜观察所获细胞形态，流式细胞术检测细胞周期，体外诱导MSCs向成骨细胞、成脂肪细胞分化并鉴定。结果：原代及传代MSCs为漩涡状贴壁生长的长梭形成纤维细胞样细胞，传代细胞具有类似的生长规律；透射电镜示所获细胞具有较强的自我更新能力；细胞周期分析显示87％以上细胞处于G0／G1期；MSCs经体外诱导可向成骨细胞、成脂肪细胞分化。结论：利用密度梯度离心联合贴壁培养法可分离、纯化MSCs，所获细胞具备成体干细胞特性，于体外可大量扩增，做为种子细胞和载体细胞满足实验需要。     

成人骨髓间充质干细胞培养上清对人脐血间充质干细胞体外培养及扩增的支持作用

目的：研究人骨髓间充质干细胞培养上清对人脐带血（HUCB）中所含有间充质干细胞（MSCs）的影响。方法：取脐带血，肝素抗凝，Percoll淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，低糖DMEM培养获得贴壁细胞层。与人骨髓间充质干细胞培养上清共孵育。流式细胞仪检测表面抗原。结果：脐带血的单个核细胞与人骨髓间充质干细胞培养上清共孵育经体外培养贴壁后出现形似纤维状细胞形态并表达与MSCs相关的抗原（CD13，CD44，CD71，CD166）。但不表达造血细胞抗原（CD34，CD45），这与源于骨髓的MSCs一致。结论：人脐血间充质干细胞与骨髓间充质干细胞培养上清共孵育，对脐血间充质干细胞体外分离培养及扩增有支持作用。     

全骨髓法分离培养骨髓间充质干细胞及向神经样细胞分化的研究

目的目前尚缺乏标准的骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离方法,实验通过全骨髓培养法分离纯化骨髓间充质干细胞,并诱导分化为神经样细胞,以寻找一种简便、实用的分离方法。方法取大鼠骨髓,全骨髓培养法结合差速贴壁法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,传代扩增。倒置相差显微镜下观察骨髓间充质干细胞形态及生物学特点,免疫组化染色鉴定细胞。用MTT法间接测定不同代数细胞活力。诱导分化,先用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）预诱导24h,然后加入丁羟基茴香醚诱导（BHA）和二甲基亚砜（DMSO）诱导。观察诱导过程中细胞的形态变化,并用免疫组化染色法鉴定细胞。结果全骨髓培养法成功分离培养BMSCs,免疫荧光染色示CD90、CD71、CD106表达阳性,CD45阴性。MTT法检测细胞活力示2、4、6代细胞于酶标仪490nm波长处吸光度值均高于第8、10代细胞。细胞经诱导后,细胞呈神经样细胞形态,并且神经元特异性表面标志β微管蛋白（β-Ⅲ-Tubulin）、巢蛋白（Nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）表达阳性。结论采用全骨髓培养法可获得较纯化的骨髓间充质干细胞,其在适宜的诱导分化条件下可诱导分化为神经样细胞。     

骨髓间充质干细胞的培养和超顺磁氧化铁标记

目的探讨全血贴壁法培养成年大鼠骨髓间充质于细胞的可行性,寻找一种对间充质干细胞进行示踪的方法。方法取6～8周龄雄性SD大鼠胫骨、股骨,收集骨髓腔冲洗悬液直接培养,经多次换液、传代,免疫组化法检测CD34、CD44表达情况。以超顺磁氧化铁和P1代间充质干细胞共同孵育培养24h,普鲁士蓝染色评价标记效率,台盼蓝染色检验标记后细胞的活性。结果全血贴壁法培养的大鼠间充质干细胞贴壁,呈纤维细胞样生长,CD44阳性细胞比率为96％,不表达CD34。经超顺磁氧化铁标记后,普鲁士蓝染色标记效率为90％,标记后98％的细胞保持活性。结论全血贴壁法能成功培养大鼠间充质干细胞,超顺磁氧化铁可以安全、有效地标记间充质干细胞。     

兔骨髓间质干细胞的体外生物学特性及超微结构研究

目的 对兔骨髓问质干细胞进行体外分离培养并观察其生物学特性.方法 无菌条件下抽取健康幼年新西兰兔胫骨骨髓2ml,经密度梯度离心后获取骨髓间质十细胞,接种至100ml玻璃培养瓶中进行体外培养,观察其细胞形态、贴壁率和超微结构,流式细胞仪检测细胞表面标记物及细胞生长周期,并进行成骨诱导反向证明,对细胞体外的生物学行为进行研究.结果 兔骨髓间质干细胞在体外培养2h后开始贴壁,20h后细胞基本贴壁完全,15d左右细胞融合达90%以上.透射电镜观察显示分离培养的兔骨髓问质干细胞表面可见许多微绒毛,主要分布于胞体一侧,胞核不规则,有切迹,细胞器丰富,具有典型未分化细胞特点;流式细胞仪检测显示分离培养的兔骨髓间质干细胞表面标记物CD44、CD90表达呈阳性,CD4S表达呈阴性,且绝大多数(约占细胞总数的97%)细胞的生长周期处于G1或G2期;成骨性诱导3周后,骨髓间质干细胞逐渐形成小的钙盐结晶体,细胞碱性磷酸酶染色阳性,VonKossa染色显示细胞聚集处存在大量钙盐,呈黑色沉积.结论 密度梯度离心法获取的兔骨髓问质干细胞纯度较高,生长稳定,传代多次后仍保持干细胞特性,因取材及体外扩增较简单易行,适合作为组织工程椎间盘髓核退变缺损修复的种子细胞来源.     

脑瘫患者骨髓间充质干细胞传代过程中细胞表型和所分泌细胞因子变化特点

 目的 分析脑瘫患者骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC)的基本生物学特性,观察其在传代培养过程中的表型和所分泌的因子变化,为临床应用提供理论依据.方法 密度梯度离心法提取脑瘫患者的BMSCs,采用人淋巴细胞分离液分离BMSCs,在相同条件下观察各代细胞形态、生长情况,检测各代细胞的表型和分泌的细胞因子.结果 BMSCs在第3至第10代,CD29、CD44、CD106等表型的表达变化无统计学差异,CD54的表达变化最大,在第9代时最高.CD14、CD34、CD45和HLA-DR等细胞表型在各代骨髓间充质干细胞中表达均<5%;NGF、NT3、VCAM、ICAM-1、VEGF、BDNF等细胞因子的浓度变化无统计学差异,PGE2的变化需进一步研究予以确认.结论 在体外培养的条件下,8代以前的细胞生长形状稳定,可作为组织工程等临床应用的良好对象.     

人骨髓间充质干细胞分离与培养方法的建立

目的：建立并优化骨髓间充质干细胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ,ＭＳＣｓ）分离纯化及培养扩增的方法。方法：利用Ｐｅｒｃｏｌｌ（１．０７３ｇ／ｍｌ）及Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ（１．０７７ｇ／ｍｌ）两种分离介质分离骨髓单个核细胞,筛选体外培养ＭＳＣｓ适宜的血清及浓度,通过流式细胞术分析鉴定ＭＳＣｓ的纯度。结果：经Ｐｅｒｃｏｌｌ分离,应用１０％筛选出的血清培养与扩增的ＭＳＣｓ,细胞纯度可达９５％左右;相反,应用常规Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ分离骨髓单个核细胞或增加血清浓度,ＭＳＣｓ纯度显著下降。结论：建立了一种稳定而实用的体外分离与培养ＭＳＣｓ的方法。     

白藜芦醇促进γ射线照射小鼠造血系统损伤修复的作用

目的观察白藜芦醇对60Coγ射线照射小鼠造血系统损伤修复的影响。方法 ICR小鼠随机分成5组,即正常对照组、照射对照组以及白藜芦醇50、100、200 mg.kg-1照射组,照射前3 d灌服给药,每天1次。除正常对照组外,所有小鼠60Co射线全身5.5 Gy辐照1次,照射后第7天小鼠取骨髓细胞和脾脏,对骨髓单个核细胞和脾集落形成单位进行计数,测定骨髓细胞DNA含量和细胞周期。结果与正常对照组比较,照射对照组小鼠骨髓单个核细胞数和骨髓细胞DNA含量显著降低（P〈0.05）,脾集落形成单位数和S和G2/M期细胞百分率显著增多（P〈0.05）;与照射对照组比较,白藜芦醇100、200 mg.kg-1照射组小鼠照射骨髓单个核细胞数、骨髓细胞DNA含量、脾集落形成单位数和S和G2/M期细胞百分率显著增多（P〈0.05）,白藜芦醇50 mg.kg-1照射组有增多趋势。结论白藜芦醇可以促进60Coγ射线照射小鼠造血系统损伤的恢复,防护效果与给药剂量相关。     

党参乙醇总提物的抗辐射作用研究

目的探讨党参乙醇总提物（total ethanol extract from Codonopsis pilosula,TEC）对60Coγ射线损伤的防护及其治疗作用。方法 70只小鼠受60Coγ射线7.5 Gy照射前后,实验组用2种不同浓度的TEC灌胃,照射对照组小鼠用蒸馏水灌胃,观察不同处理组小鼠的存活率及血像变化情况,在此基础上优选出最佳保护方式;另外对40只小鼠给予8.0 Gy致死剂量照射,观察TEC对小鼠的辐射保护作用。结果 （1）致伤前预防给药,两个剂量TEC均明显提高了30 d存活率以及外周血白细胞计数（WBC）和血小板计数（PLT）;（2）致伤后给药两个剂量均没有显示出显著的治疗效果;（3）给予8.0 Gy致死剂量照射,TEC较照射对照组提高存活率50%,有统计学差异（P〈0.05）。结论 TEC具有较强的辐射预防作用,能显著提高受60Coγ射线致死剂量照射小鼠的存活率,降低辐射对小鼠外周血WBC和PLT的损伤作用。     

pDsRed1-N1基因核转染兔原代骨髓基质细胞的实验研究

目的探讨以最近发展起米的核转染技术直接将编码红色荧光蛋白DNA质粒转染到兔原代骨髓基质细胞细胞核内进行基因修饰的可行性。方法从兔股骨抽取骨髓，密度梯度离心法获取原代骨髓基质细胞。以Nucleofectorw^TM技术转染pDsRed1—N1（DsRed组），以同期培养未转染的细胞作为对照组。测定细胞的活力、贴壁率、生长曲线以及转染的效率。结果在转染后48h成功发现DsRed的表达。两组细胞具有相似的形态学变化、贴壁率以及生长曲线。DsRed的表达逐渐增强，至第10天达到最高峰（54．2％），观察1个月未发现表达减弱。结论pDsRed1-N1基因核转染对兔原代骨髓基质细胞的体外增殖无明显影响；DsRed可以作为兔骨髓基质细胞有效的基因表达标记；Nucleofector^TM技术是一种简易而高效的转染兔原代骨髓基质细胞的方法。     

大鼠骨髓间充质干细胞移植治疗喉返神经损伤实验研究

目的通过建立喉返神经损伤(recurrent laryngeal nerve injury)动物模型,探讨自体骨髓间充质干细胞(BMSC)移植对喉返神经损伤的治疗效果。方法随机数字表法将40只SD大鼠分成两组,每组20只。对全部大鼠手术复制喉返神经损伤动物模型。一组大鼠骨髓,培养、分化骨髓间充质干细胞后,自体进行干细胞移植为实验组。另一组为生理盐水注射对照组。建立模型3 d后,将BMSC诱导后的类神经细胞0.2 ml注射移植至大鼠左侧喉返神经损伤处,于移植后7、14、21、28、60 d,观察喉返神经电生理指标。结果实验组和对照组喉返神经损伤后均有不同程度的失神经和神经再生现象。移植14 d后实验组与对照组喉返神经电生理检测的潜伏期和波幅平均值分别为(1.78±0.41)ms与(2.36±0.16)ms(t=5.72、P<0.01)和(0.69±0.09)mV与(0.46±0.07)mV(t=8.18、P<0.01),差异有统计学意义。60 d后实验组与对照组喉返神经电生理检测的潜伏期和波幅分别为(0.93±0.03)ms与(1.16±0.18)ms(t=5.50,P<0.01)和(1.33±0.18)mV与(1.04±0.20)mV(t=4.64、P<0.01),差异有统计学意义。结论自体骨髓间充质干细胞移植对喉返神经损伤有促修复作用,治疗效果明显。     

骨髓间充质干细胞体外培养和成骨诱导

目的：观察骨髓问充质干细胞（MSC）体外培养及诱导成骨分化的特征。方法：采用密度梯度离心和体外扩增培养人骨髓MSC,并进行成骨诱导。应用茜素红染色法和钙钴法分别进行成骨诱导的MSC钙化结节检测和碱性磷酸酶（ALP）检测。结果：MSC成骨细胞诱导培养第l～3天的细胞增殖旺盛,3～5d即融合成单层。随着诱导培养时间的延长,细胞逐渐堆积并矿盐沉积,形成矿化结节。培养14d和21d后,矿化结节形成率分别为（70．5±3．5）％和（87．5±3．5）%,ALP染色阳性率分别为（41．5±1．5）％和（85．2±1．7）％。结论：在体外培养条件下,骨髓MSC可诱导分化为具有含矿化结节及ALP阳性特征的骨样细胞。