绵羊胎儿成纤维细胞体外培养及转基因研究

目的用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染体外培养绵羊胎儿成纤维细胞,探讨绿色荧光蛋白对绵羊胎儿成纤维细胞生物学特性的影响.方法体外分离培养绵羊胎儿成纤维细胞,经脂质体介导EGFP基因转染第一代成纤维细胞,G418筛选10～12*!d,挑选转基因单克隆细胞,传代培养,进行细胞形态观察、生长曲线以及染色体核型分析,并进行了培养细胞性别鉴定.结果整合有EGFP基因的绵羊胎儿成纤维细胞生物学行为与未转染外源基因的细胞无明显差别,根据荧光强度可直接反应外源基因的表达量.结论 EGFP基因作为体内报告基因可用于转基因细胞的研究,并将整合有EGFP基因的转基因细胞为克隆动物提供核供体奠定了基础.     

p α-MHC/EGFP小鼠胚胎干细胞株的构建及其向心肌细胞分化的观察

目的构建含有心肌特异性基因肌球蛋白重链α(α-MHC)调控的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达的载体并转染到小鼠胚胎干细胞(ESC),建立p α-MHC/EGFP小鼠ESC株,利用该细胞株可识别和纯化分化形成的心肌细胞。方法应用电穿孔技术将pα-MHC/EGFP载体转染到ESC,G418筛选10~12d后收集G418抗性细胞克隆并采用悬滴法体外诱导向心肌分化。通过PCR扩增细胞克隆基因组EGFP片段,并在心肌分化过程中通过荧光显微镜观察EGFP的表达,鉴定pα-MHC/EGFP胚胎干细胞株的建立。细胞免疫组化法检测自发性搏动拟胚体(EB)中EGFP阳性区域心肌肌钙蛋白T的表达。结果G418抗性细胞克隆基因组中能够扩增EGFP片段;在心肌细胞分化过程中,荧光显微镜下能观察到EB局部出现自发性搏动的亮绿色细胞团;细胞免疫组化检测显示,EGFP阳性区域肌钙蛋白T表达阳性。结论成功构建了pα-MHC/EGFP胚胎干细胞株,该细胞株在分化为心肌细胞的同时表达EGFP,便于对心肌细胞进行识别和纯化。     

p α-MHC/EGFP小鼠胚胎干细胞株的构建及其向心肌细胞分化的观察

目的 构建含有心肌特异性基因肌球蛋白重链α(α-MHC)调控的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达的载体并转染到小鼠胚胎干细胞(ESC),建立p α-MHC/EGFP小鼠ESC株,利用该细胞株可识别和纯化分化形成的心肌细胞. 方法 应用电穿孔技术将p α-MHC/EGFP载体转染到ESC,G418筛选10～12 d后收集G418抗性细胞克隆并采用悬滴法体外诱导向心肌分化.通过PCR扩增细胞克隆基因组EGFP片段,并在心肌分化过程中通过荧光显微镜观察EGFP的表达,鉴定p α-MHC/EGFP胚胎干细胞株的建立.细胞免疫组化法检测自发性搏动拟胚体(EB)中EGFP阳性区域心肌肌钙蛋白T的表达. 结果 G418抗性细胞克隆基因组中能够扩增EGFP片段;在心肌细胞分化过程中,荧光显微镜下能观察到EB局部出现自发性搏动的亮绿色细胞团;细胞免疫组化检测显示,EGFP阳性区域肌钙蛋白T表达阳性. 结论 成功构建了p α-MHC/EGFP胚胎干细胞株,该细胞株在分化为心肌细胞的同时表达EGFP,便于对心肌细胞进行识别和纯化.     

pSecTag-EGFP真核表达载体的构建及其转染鸡胚胎成纤维细胞条件的优化

目的构建含报告基因增强绿色荧光蛋白(EGFP)的分泌型真核表达载体pSecTag-EGFP,用以研究pSecTag/HygroB转染鸡胚胎成纤维细胞的转染效率,为目的基因的成功表达奠定基础。方法用PCR方法克隆得到EGFP基因,通过酶切、连接、转化构建pSecTag-EGFP分泌型真核表达载体,设计优化实验,通过脂质体介导的方法转染鸡胚胎成纤维细胞,在荧光显微镜下直接观察该基因的表达。用B radford法检测不同组合的细胞培养液中的EGFP蛋白的相对含量。结果脂质体介导的方法能有效转染鸡胚胎成纤维细胞,实验中EGFP蛋白相对表达量随质粒量的增加而明显升高(P<0.01)。其中脂质体2μl、质粒1.0μg时目的蛋白相对表达量最高。结论pSecTag-EGFP质粒构建成功,并成功优化了转染条件。     

含EGFP的人BMP2表达载体在人皮肤成纤维细胞中的表达

目的构建带加强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的人骨形成蛋白2(hBMP2)真核表达载体，观察其在正常人皮肤成纤维细胞中的表达情况。方法构建携带hBMP2和EGFP基因的真核表达载体pcDNA3-hBMP2-IRES-ECFP(pcBE)，将其转染NIH3T3细胞和正常人皮肤成纤维细胞后，采用RT—PCR和免疫组化染色方法分别检测人BMP2和EGFP基因在mRNA和蛋白质水平上的表达情况。结果转染后的NIH3T3和正常人皮肤成纤维细胞均能转录人BMP2 mRNA和表达人BMP2蛋白，同时显示绿色荧光。结论pcBE真核表达载体可在正常人皮肤成纤维细胞内有效表达人BMP2蛋白，并以其荧光报告基因起示踪作用。     

电穿孔法转染人原代成纤维细胞条件的优化

目的 通过优化电穿孔转染条件,探讨影响人原代成纤维细胞电转染效率和转染后细胞存活率的因素,筛选出人原代成纤维细胞的最佳电转染条件.方法 通过改变脉冲电压、脉冲次数和质粒浓度等条件,将含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的质粒pEGFP-N1电穿孔转染入人原代成纤维细胞.利用锥虫蓝染色检测细胞存活情况,采用流式细胞术检测转染24 h后的转染效率.结果 在低电压模式下,脉冲电压320 V、质粒浓度为20 μg/mL、脉冲1次时,人原代成纤维细胞的电转染效果最理想,转染效率达到(42.53±0.63)％,细胞存活率为(74.30±3.01)％.结论 优化了人原代成纤维细胞的电转染条件,在保证细胞较高存活率的前提下提高了人原代成纤维细胞的电转染效率,为后续基因功能的研究打下基础.     

pSecTag-EGFP真核表达载体的构建及其转染鸡胚胎成纤维细胞的研究

目的 研究pSecTag真核表达载体转染鸡胚胎成纤维细胞的转染效率,选出该质粒转染鸡胚胎成纤维细胞的最佳转染条件,从而为研究目的 基因在鸡胚胎成纤维细胞中成功表达奠定基础.方法 用PCR方法克隆得到EGFP基因,通过酶切、连接、转化的方法构建了pSecTag-EGFP分泌型真核表达载体,设计优化试验,通过脂质体介导的方法转染鸡胚胎成纤维细胞,用Bradflord检测法检测正交优化不同组合细胞培养液中所表达分泌的增强绿色荧光蛋白的相对含量.结果 成功构建psecTag-EGFP分泌型真核表达载体,并选出该质粒转染鸡胚胎成纤维细胞的最佳转染条件,即脂质体加2μl、质粒加1.0μg.结论 脂质体介导的方法能有效转染鸡胚胎成纤维细胞.     

腺病毒载体Ad-BDNF-EGFP的构建和在神经干细胞中的表达

目的研究腺病毒载体Ad-BDNF-EGFP的构建及其在神经干细胞(NSCs)中的表达。方法通过RT-PCR从大鼠海马中获得BDNF基因,通过基因克隆、HEK293包装,获得含增强绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒表达载体pAd-BDNF-EGFP,将其感染原代培养的神经干细胞,观察EGFP及BDNF2种基因的表达,镜下测定转染率,并检测RT-PCR产物,证实BDNF的存在。转染后的神经干细胞经G418筛选,抗性细胞传代扩增后获得成功转染BDNF基因的NSCs克隆。结果荧光显微镜下可见感染后的NSCs表达EGFP而发出绿色荧光;通过RT-PCR证明感染后的NSCs具有表达BDNF的能力;用ELISA鉴定细胞上清中分泌的BDNF,72h的含量达到最高值,为12.78ng/mL;证明通过构建病毒的感染可以使神经干细胞获得分泌BDNF的能力,且EGFP基因可作为神经干细胞移植研究中良好的示踪剂。结论腺病毒病毒介导EGFP基因及BDNF基因在大鼠胚胎神经干细胞中成功表达,为应用以神经干细胞直接作为基因靶细胞,介导基因治疗中枢神经系统疾病奠定了基础。     

含EGFP的人BMP2表达载体在人皮肤成纤维细胞中的表达

目的构建带加强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的人骨形成蛋白2(hBMP2)真核表达载体,观察其在正常人皮肤成纤维细胞中的表达情况.方法构建携带hBMP2和EGFP基因的真核表达载体pcDNA3-hBMP2-IRES-EGFP(pcBE),将其转染NIH3T3细胞和正常人皮肤成纤维细胞后,采用RT-PCR和免疫组化染色方法分别检测人BMP2和EGFP基因在mRNA和蛋白质水平上的表达情况.结果转染后的NIH3T3和正常人皮肤成纤维细胞均能转录人BMP2 mRNA和表达人BMP2蛋白,同时显示绿色荧光.结论pcBE真核表达载体可在正常人皮肤成纤维细胞内有效表达人BMP2蛋白,并以其荧光报告基因起示踪作用.     

AANAT基因工程化ES细胞减少APP高表达PC12细胞Aβ的分泌

目的 构建AANAT基因工程化的胚胎干细胞，并探讨其在阿尔茨海默氏病治疗中的可能作用。方法 将外源性neo基因转染人胚胎成纤维细胞，作为饲养层细胞用于ES细胞转基因后筛选及增殖过程的培养。将pBK-CMV/AANAT真核表面质粒转染小鼠胚胎干细胞，用RT－PCR方法筛选阳性细胞克隆，用此工程细胞的条件培养液培养APP过量表达的PC12细胞，观察β淀粉样蛋白分泌情况。结果 （1）转入neo基因的人胚胎成纤维细胞能很好维持ES2细胞的未分化。（2）AANAT基因工程培养液能减少β淀粉样蛋白的分泌。（3）褪黑素能使PC12／APP细胞Aβ分泌明显减少。结论 首次构建AANAT基因工程化的胚胎干细胞，其减少Aβ分泌的作用可能在阿尔茨海默病的治疗中具有重要应用价值。     

胚胎干细胞诱导的内皮细胞对自身向成骨细胞分化的影响

目的探讨由胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）诱导的内皮细胞（endothelial cells,Ec）与自体胚胎干细胞联合培养时对ESCs成骨作用的影响。方法提取小鼠的胚胎干细胞和胚胎成纤维细胞,诱导胚胎干细胞生成Ec,培养细胞分为四组。A组：胚胎干细胞诱导组;B组：胚胎干细胞诱导组;C组：胚胎干细胞诱导生成的内皮细胞（Ec）诱导组;D组：ESCs和诱导的EC联合培养诱导组。通过干细胞形态的观察、免疫荧光、细胞的增值、碱性磷酸酶以及骨钙素含量的测定从酶学、组织学及生化学等不同方面观测骨髓基质细胞对胚胎干细胞向成骨细胞诱导转化的影响。结果通过细胞免疫荧光染色证实C组培养诱导的细胞为EC。D组ESCs和诱导的Ec联合培养组MTT检测结果各组细胞生长差异没有显著意义（p〉0.05）,骨钙素和碱性磷酸酶测定D组有明显差异高于其他3组（p〈0.05）。结论以胚胎干细胞诱导生成的内皮细胞对胚胎干细胞的成骨有明显的促进作用。     

胚胎干细胞研究进展

近年来,胚胎干细胞(ES细胞)因其自身的许多特性成为生命科学的研究重点。ES细胞能够自我更新和多向分化的生物学特性,具有重要的医学价值,在基因治疗、组织工程学、药学研究等许多领域都具有广泛的应用。本文就ES细胞的生物学特性、培养因素及主要研究领域的最新进展、研究存在的问题作一概述。     

肾母细胞瘤中凋亡情况的研究

目的:分析肾母细胞瘤中凋亡的情况,探讨凋亡与肾母细胞瘤预后的关系.方法:采用原位细胞末端转移标记(ISEL)法进行凋亡指数测定,TdT去除液用于阴性对照,断奶4 d后的母鼠乳腺作为阳性对照.结果:肾母细胞瘤中胚基型的3种分化程度的凋亡指数间不存在统计学差异;预后较好病理组织(FH)中的各病理分型间也不存在统计学差异.但FH与预后不好病理组织(UH),FH与正常对照间存在显著的统计学差异,而UH与正常对照间无统计学差异.结论:肾母细胞瘤中降低的凋亡指数与差的预后存在相关关系.     

ICR小鼠胚胎成纤维细胞的培养及饲养层的制作

目的：建立ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养体系，用于胚胎干细胞建系及研究。方法：选取不同胎龄的鼠胚原代细胞分离成纤维细胞，制作饲养层，使用不同浓度丝裂霉素C处理，以细胞形态、生长曲线、囊胚种植情况为饲养层评价指标。结果：ICR小鼠胚胎成纤维细胞可在胎龄12．5～14．5d进行原代细胞分离；12．5d为最佳分离时间；13．5和14．5d分离的细胞需在3代以后使用；6代以前细胞可用于饲养层制作；20mg/L丝裂霉素C作用2．5h可达到较好的处理效果。结论：ICR小鼠可用来分离、培养胚胎成纤维细胞，用于胚胎干细胞饲养层的制作。     

体外受精-胚胎移植中胚胎形态与发育潜能的关系

①目的探讨不同形态胚胎的发育潜能。②方法对222对夫妇242个周期的胚胎着床率进行了分析。③结果4～5细胞胚胎着床率为10．34％，6～7胚胎着床率为15．84％，8细胞胚胎着床率为34．95％，≥9细胞胚胎着床率为11．11％。8细胞胚胎着床率高于其他细胞组。无碎片胚胎着床率为33．89％，碎片〈20％胚胎着床率为17．81％，碎片〈50％胚胎着床率为11．11％。无碎片胚胎着床率高于其他组。④结论胚胎中卵裂球数目及胚胎内碎片对着床率有明显的影响。胚胎形态可作为评估胚胎发育潜能的参数。     

基因印记与胚胎发育

基因印记的擦除、建立和维持是正常胚胎发育的基础,这一过程的实现主要有赖于各种DNA甲基转移酶的准确表达和密切合作,多种遗传综合征和胚胎发育缺陷与基因印记异常有关。基因印记对原始生殖细胞胞核全能性、配子成熟、胚胎生长发育、胎盘结构和功能,以及出生后个体的生长发育均有重要意义。     

基因印迹与胚胎生长发育

基因印迹为近年来新发现的遗传规律 ,与胚胎的生长发育 ,罕见的遗传病 ,肿瘤发生有着密切的联系 ,且解释了许多孟德尔规律无法企及的现象 ,其意义正逐渐被认识 ,研究也日趋深入。传统的孟德尔规律指出 :胚胎从父亲和母亲遗传的两个拷贝即等位基因 (Ａｌｌｅｌｅｓ)均有同等的机会表达而与其亲代来源无关 ,但近年来发现一小部分基因的表达取决于这些基因是源自父亲还是源自母亲 ,这种等位基因表达取决于亲本来源的现象即是基因印迹 (Ｇｅｎｏｍｉｃｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ) ,也称亲代印迹 (Ｐａｒｅｎｔａｌｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ)或配子印迹 (…