新生大鼠皮层神经元体外无血清原代培养

目的：探讨建立较为简便的新生大鼠皮层神经元细胞体外无血清原代培养方法。方法取新生大鼠（24 h ）大脑皮层组织,消化后种植在有多聚-L-赖氨酸包被的六孔培养板中,以含10％胎牛血清DEM E-HG培养液种植,4～8 h后换用含B27的Neurobasal培养基维持饲养。于不同时间在倒置相差显微镜下观察形态变化,分别采用RT-PCR、Western blot、免疫组织化学对神经元特异性标记物神经元特异性烯醇化酶（NSE）基因及蛋白进行鉴定。结果2～8 h神经元细胞贴壁,随着时间延长,形态多变,突起逐渐增多,神经元突起间相互接触形成网络,培养7～10 d神经元胞体最为丰满,通过RT-PCR、Western blot和免疫组织化学证明所分离培养的是神经元细胞。结论该方法简单易行,神经元纯度较高,可作为神经元体外培养的良好模型用于以后的研究。     

八肽胆囊收缩素对新生小鼠大脑皮层神经元生长的影响

目的：探讨八肽胆囊收缩素（octa-peptide cholecystokinin,CCK8）对体外培养的新生小鼠大脑皮层神经元生长的影响。方法：原代培养新生小鼠大脑皮层神经元,采用烯醇化酶（neuron-specific enolase,NSE）免疫细胞化学染色法鉴定皮层神经元,培养24h的皮层神经元随机分为对照组和CCK8刺激组（终浓度为10-7mol/L）,作用24h、48h、72h、96h后,倒置相差显微镜下行动态观察,MTT法检测细胞的生长活性并以OD值绘制生长曲线。结果：CCK8处理后,有突起的神经元数目增加,存活时间延长,同一时间点的细胞活性明显增强,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：CCK8能促进皮层神经元的生长,延长其存活时间。     

大鼠皮层神经元原代培养及毒胡萝卜素干预后的表现

目的探讨离体大鼠皮层神经元原代培养方法及毒胡萝卜素诱导大鼠皮层神经元内质网应激的作用特点。方法体外培养SD乳鼠皮层神经元细胞,免疫组织化学、免疫荧光染色鉴定神经元纯度,Hoechst33258单染法观察凋亡细胞核的形态变化及测出细胞凋亡率,透射电子显微镜观察神经元的亚细胞结构。结果 SD乳鼠皮层神经元可纯化体外培养,对培养7d后的神经元进行NSE免疫荧光染色显示计数NSE阳性细胞数占细胞总数的百分数为（95±3）%,在TG浓度为2μmol/L作用时间为24h时离体培养原代神经元细胞凋亡率最高为19%±0.54%,P〈0.05。神经元细胞在2μmol/LTG作用24h后神经元呈现典型凋亡形态学改变,核周内质网,线粒体结构模糊不清,包膜破损,且出现染色质浓集、核固缩、细胞皱缩、核碎裂。结论体外改良的培养方法可以获得较高纯度的神经元,在毒胡萝卜素诱导的神经元内质网应激时,线粒体改变引起的变化可能是下游事件。     

一种改进的大鼠皮层神经元原代培养方法及其性质鉴定

目的：对原有大鼠皮层神经元原代培养方法进行改进, 以获得数量更多、纯度更高、体外生长时间更长的神经细胞进行相关实验研究。方法: 使用3种不同成分的液体对培养器皿进行序贯预处理, 分离16~17 d胎龄的Wistar大鼠胎鼠皮层, 采用木瓜蛋白酶化学消化与机械吹打相结合的方法制备单细胞悬液, 经细胞计数后按照不同实验目的进行梯度密度接种。细胞接种当日4~6 h将含有血清的接种培养液换为添加B27的Neurobasal无血清培养基, 培养第3天(DIV3)用终浓度10 μmol/L的阿糖胞苷(cytosine arabinoside, Ara-C)处理24 h抑制胶质细胞增殖, 以后每周半量换液1次。用倒置相差显微镜观察细胞形态, 利用神经元特异性标志物微管相关蛋白2(microtubule associated protein 2, MAP2)与细胞核双标记法鉴定培养神经细胞的纯度, 并以免疫荧光法检测突触前、后标记物以评估突触形成情况。 结果: 与单纯多聚赖氨酸预处理培养器皿, 胰蛋白酶化学消化法分离细胞及含血清培养基培养的原方法相比, 方法改进以后收获的细胞产量明显增加, 且消化过程对细胞损伤小, 接种后细胞分散均匀, 杂质少, 纯度高, 树突、突触发育正常, 可长期存活。 结论: 该方法简便可行, 结果稳定,用该方法培养的大鼠皮层神经元可作为神经元体外培养的良好实验模型。     

一种大鼠海马神经元的原代培养方法

目的 建立一种简便高效的海马神经元的原代培养方法.方法 无菌环境下取新生SD大鼠(24 h内)海马,清洗、剪碎,以0.25%胰蛋白酶消化,200目滤网过滤,混合培养,约5 d后加入阿糖胞苷抑制神经胶质细胞的生长.采用免疫细胞化学方法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达情况,观察海马神经元形态.结果 海马神经元纯度≥90%.神经元接种3 d后具有典型的形态特征,13～14 d突起形成密集的神经纤维网络,14 d后细胞出现凋亡.结论 本实验方法步骤简便,可获得纯度较高的海马神经元,为研究与海马神经元相关的疾病提供了实验基础.     

海马神经元原代培养与纯度鉴定方法的优化

目的:通过优化和改进传统的神经元培养方法,探讨一个简单、高纯度的大鼠胚胎海马神经元的原代培养及活性检测方法。方法:颈椎脱臼处死孕鼠,迅速取海马,剥离血管网等结缔组织后,消化并吹打制成细胞悬液,以适当的密度接种入DMEM/HG培养基,4h后换用Neurobasal培养基,以后每2-3d进行1/3量换液。倒置显微镜观察神经元的形态变化,并采用CCK-8试剂盒检测神经元活性和神经元特异性烯醇化酶(NSE)鉴定神经元纯度。结果:细胞接种4h后贴壁,随着培养时间的延长神经元的形态发生一系列变化,从圆形、透亮、体积小逐渐变为椭圆形、三角形或椎形,有光晕,胞体增大,突起伸长且分支增多,在培养第4天后逐渐连接呈网络状。神经元纯度随时间的延长逐渐升高,培养第7天纯度高达90%以上。神经元在培养的第9、10天达到成熟,即可用于后续研究。结论:本实验方法简便易行,神经元纯度高、细胞活性好,体外存活时间长,是体外研究的良好实验模型,值得推广应用。     

神经干细胞原代培养及GABA能神经元的诱导分化

目的探讨神经干细胞(NSC)的原代培养及γ-氨基丁酸(GABA)能神经元的诱导分化、鉴定。方法取出生1~3dSD大鼠全脑,分离、培养NSC并诱导分化了GABA能神经元,用免疫荧光染色进行鉴定。结果培养24h后,由单细胞发展成2~4细胞神经球,随时间延长球体增大,神经球均有Nestin阳性细胞;用含10%血清分化液分化1d后,神经球开始贴壁,伸出细长突起,部分可和周边神经球伸出的突起连接。神经球周边见大量散在贴壁的双极或多极细胞,免疫荧光染色可见NSE、GABA阳性细胞。加了分化液的实验组GABA阳性细胞分化率为(30·25±2·12)%,而对照组分化率为(1·14±1·39)%。结论成功从新生大鼠脑组织中分离、培养了NSC,并能较大比率分化GABA能神经元。     

SD大鼠海马神经元原代培养及形态学观察

目的：掌握SD大鼠海马神经元体外培养方法,观察神经元形态学特点,测定细胞生长曲线。方法：新生SD乳鼠,剥离海马,胰酶消化,接种,1 d换为Neurobasal培养基;小鼠抗大鼠微管相关蛋白-2、兔抗鼠神经元特异性烯醇化酶为一抗,免疫细胞化学法计数阳性细胞百分率并显微摄影;1%甲苯胺蓝、苏木精伊红染色。结果：原代培养神经元6~8 h内开始贴壁,培养5~7 d突起增粗增长,连接成网,以多极神经元为主,胞体呈三角形、梭形、椭圆形;MAP-2、NSE染色为棕褐色,经鉴定神经元纯度达90%左右;细胞经历生长潜伏期,对数生长期,平台期;细胞核大而圆,HE染色胞核深蓝色,胞浆红色,胞体中可见尼氏颗粒。结论：相差显微镜下神经元形态多样,MAP-2、NSE染色阳性细胞,HE染色细胞核呈深蓝色,胞浆为红色,尼氏体位于细胞质内,神经突起内少见。     

一种简单高效的新生鼠海马神经元原代培养方法

【目的】建立一种简单、高效、高纯度的新生小鼠海马神经元的原代培养方法。【方法】取出生24 h内的C57BL/6J新生鼠,分离海马组织,采用胰蛋白酶消化加机械吹打的方法获得单个细胞,用含体积分数1%B27及2%Glutamax-100X、终浓度25μmol/L Glutamate的Neurobasal-A培养基接种培养,3 d后用去Glutamate成分的上述培养基换液,并加阿糖胞苷作用48 h以抑制胶质细胞增长。于倒置相差显微镜下观察细胞的生长状态,采用微管蛋白相关标志物2(MAP2)及Hoechst33258免疫荧光染色鉴定神经元纯度。【结果】此培养方法获得的海马神经元生长状态良好,细胞形态从接种时的圆形透亮、无突起,到培养第7天后发展为神经元胞体聚集、树突发达并形成纵横交错的神经网络;经鉴定,神经元的纯度高达97.2%以上,且能稳定存活2~3周。【结论】该方法操作简单、高效,所得神经元纯度高,结果稳定。     

原代海马神经细胞体外培养的纯化与鉴定

目的 建立原代海马神经细胞体外培养纯化及鉴定的优选方法.方法 取新生Wistar乳鼠,分离海马后在体外采用含血清结合无血清法进行培养,并用NSE、GAP-43、MAP2等海马神经细胞特异抗体经免疫细胞化学方法鉴定细胞性质及纯度.结果 接种24 h后细胞全部贴壁,并长出突起,随时间增加,突起延长并交错形成网络,至第7～8天神经元形态最为成熟饱满,随后逐渐出现细胞老化,神经元最长可生存4周.经鉴定,海马神经元纯度达96%以上.结论 体外采用含血清和无血清法相结合进行原代海马神经细胞培养,细胞纯度高,杂细胞少,可为神经疾病体外研究提供必要细胞基础.     

创伤性脑损伤后高血糖对脑神经元损害作用的研究

目的:探讨大鼠创伤性脑损伤后高血糖对神经元的损害作用.方法:成年雄性SD大鼠随机分成正常对照组,创伤性脑损伤(Traumatic brain iniury,TBI)组和胰岛素治疗组.每组伤侧及健侧皮层设立自身对照.分别测定各组伤前伤后各时间点血糖值,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定伤后伤侧及健侧皮层葡萄糖转运蛋白3(Glucose transporter 3,GLUT-3)基因表达,Western-blot法测定伤后伤侧及健侧皮层GLUT-3蛋白表达,免疫荧光法测定伤后各组伤侧及健侧皮层单个神经元神经特异性烯醇化酶(Neuronspecificenolase,NSE)表达量和NSE阳性染色细胞数,longa评分、平衡木试验、网屏试验综合评定伤后各组神经功能.结果:正常对照组各时间点血糖值,GLuT-3表达量,单个神经元NSF:表达量及NSE阳性细胞数均未见明显变化;TBI组动物伤后血糖升高,伤侧皮层GLUT-3表达增加,单个神经元NSE表达量增加而NSE阳性染色细胞数明显减少神经瘫裂较重;胰岛素治疗组伤后血糖变化不明显,伤后12、24、48、72 h GLUT-3表达量,单个神经元NSE表达量及NSE阳性染色细胞数均明显多于TBI组神经瘫裂程度明显轻于TBI组.各组健侧皮层GLUT-3和单个神经元NSE表达量,NSE阳性染色细胞数均未见明显变化.结论:TBI后高血糖可加重神经元损伤,其机制可能与TBI后高血糖抑制伤后神经元CLUT-3的表达,增加伤后神经元葡萄糖代谢障碍有关.     

胰岛素诱导低血糖对新生大鼠海马神经干细胞增殖和分化的影响

目的探讨胰岛素诱导低血糖对新生大鼠海马神经干细胞(NSCs)增殖和分化的影响。方法新生1日龄大鼠禁食24 h后腹腔注射胰岛素50 u.kg-1,血糖值<1.0 mmol.L-1后取脑海马组织在含碱性成纤维生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)和B27的无血清培养基中进行原代和传代培养,并分别对原代和传3代的细胞进行单克隆培养及诱导分化:单克隆培养细胞行巢蛋白(Nestin)免疫细胞荧光染色;诱导分化后的细胞分别行神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞荧光染色,计数NSE阳性细胞比例。结果原代组培养细胞与传代组和对照组原代细胞相比生长较快;单克隆培养的细胞均Nestin阳性表达,诱导分化后的细胞分别呈NSE或GFAP阳性表达;原代组的细胞诱导分化为神经元的比例明显高于传代组和对照组(P<0.05);传代组的细胞诱导分化为神经元的比例与对照组传代细胞比较无统计学意义(P>0.05)。结论低血糖能够短暂地促进新生大鼠海马神经干细胞增殖及提高向神经元分化比例。     

简易大鼠海马神经元原代培养方法及神经元兴奋性检测

目的 对原有大鼠海马神经元原代培养方法进行改进,在获得数量多、纯度高、体外生长时间长的神经细胞的同时,简化操作流程、节省时间、减少污染.方法 分离24h内出生的Wistar大鼠双侧海马,采用机械吹打法,以沉降法代替过滤制备单细胞悬液,细胞接种24h后培养液更换为添加B27的DMEM/F12无血清培养基,以后每周半量换液2～3次.用倒置相差显微镜观察细胞形态,利用神经元特异性标志物神经元特异烯醇化酶(NSE)鉴定神经细胞的纯度,并以钙影像仪测定KCl作用神经元后细胞的钙离子浓度变化,了解神经元的兴奋性.结果 此简易方法节约操作时间及科研成本,减少了污染的机会.所培养的神经元杂质少、纯度高、细胞活性好,体外存活时间长.结论 该方法简便可行,结果稳定,用该方法培养的大鼠海马神经元可作为神经元体外培养的良好实验模型.     

新生大鼠海马神经元的原代培养与鉴定

目的:探讨建立简便高效的大鼠海马神经元原代培养的纯化方法。方法:(1)离体培养新生24 h内SD乳鼠海马神经元,每天在倒置相差显微镜下进行神经元的形态学观察;(2)MTT法检测培养不同时间段神经元的活力变化,并绘制生长曲线;(3)纯化培养9 d神经元利用免疫荧光染色法检测β-微管蛋白Ⅲ(β-tublinⅢ)的表达率。结果:(1)倒置相差显微镜下观察原代培养的海马神经元,刚分离种植时可见神经细胞为圆形,24 h大多数细胞贴壁,3 d细胞突起增大、增粗,培养5~7 d神经元胞体丰满,突起交织成的网络更密集,培养14~16 d后,神经元开始退化;(2)生长曲线结果发现海马神经元体外培养经历了4个时期,即生长潜伏期、对数生长期、平台期、生长停滞期;(3)经β-tublinⅢ鉴定海马神经元纯度为(93.0%±2.5%)。结论:本实验方法步骤简便,可获得纯度较高的海马神经元,为研究与海马神经元相关的疾病提供了实验基础。     

一种改良的Sprague Dawley新生大鼠视网膜Müller细胞培养方法

目的改良Sprague Dawley(SD)新生大鼠视网膜Müller细胞培养方法。方法取新生1～2 d的SD,分2 d完成视网膜Müller细胞的提取,第1天将眼球浸泡于含体积分数1%双抗的无血清高糖达尔伯克改良伊戈尔培养基(DMEM)中,置于37℃、含体积分数5%CO2的培养箱内过夜;第2天,去培养基,以2. 5 g·L-1胰蛋白酶消化眼球1 h,分离视网膜组织,加入含体积分数1%双抗和体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基,制备细胞悬液接种培养; 24 h后换液,6～8 d后传代,传至第4代,细胞免疫荧光染色法鉴定Müller细胞纯度。结果 Müller细胞贴壁生长良好,细胞体宽大,细胞质丰富,细胞核呈圆形或椭圆形,无神经元共生长,Müller细胞纯度> 95%。结论改良的SD新生大鼠视网膜Müller细胞培养方法操作简单,细胞纯度高。     

α-突触核蛋白促进大鼠原代培养神经元突起生长

目的研究人α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)对神经元突起生长的作用。方法原代培养新生大鼠大脑皮质神经元,细胞外添加α-Syn蛋白,测定不同时间神经元突起的长度;观察添加不同浓度的α-Syn蛋白后神经元突起的生长情况。结果α-Syn处理组神经元突起的平均长度在培养1h、2h和4h时均明显大于对照组,α-Syn的这一作用可被其特异性单克隆抗体阻断;向培养基中添加不同浓度的α-Syn后,神经元突起的长度随α-Syn浓度的增加而增加。结论α-Syn具有促进神经元突起生长的作用,并且呈明显的量-效关系。     

神经元特异性烯醇化酶在神经元氧糖剥夺损伤模型复氧后的表达变化

目的 探讨神经元特异性烯醇化酶（NSE）在体外培养神经元氧糖剥夺损伤模型复氧后的水平变化。方法 体外原代培养24 h内的新生SD大鼠海马区神经元,应用免疫荧光染色及电子显微镜鉴定神经元,应用体外氧糖剥夺建立大鼠海马区神经元缺血低氧损伤模型,分别对复氧1、6、12、24、48、72 h神经元提取蛋白质,Western blotting法检测不同时间点神经元损伤模型中NSE表达水平。结果 培养第4天的细胞免疫荧光染色显示神经元细胞核染色清晰,形态典型,突起走形如网状,阳性率为（93.6±1.6）%。各组NSE蛋白表达比较,差异有统计学意义（F=500.75,P＜0.01）。实验组损伤后各时间点NSE蛋白表达高于对照组,细胞培养24、48 h NSE蛋白表达均高于其他时间点（P＜0.05）。结论 NSE可作为自发性蛛网膜下腔出血（SAH）后早期脑损伤（EBI）标志物,能够反映脑组织的损伤程度。     

胰岛素对大鼠创伤性脑损伤后脑GLUT-3表达的影响

目的 探讨大鼠创伤性脑损伤急性期胰岛素降糖治疗的脑保护作用机制.方法 成年雄性SD大鼠随机分成正常对照组、创伤性脑损伤(TBI)组和胰岛素治疗组,分别测定各组伤前、伤后血糖值,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测定伤后伤侧及健侧皮层葡萄糖转运蛋白3(GLUT-3)基因表达,免疫组化法测定伤后伤侧及健侧皮层GLUT-3蛋白表达量和神经元神经特异性烯醇化酶(NSE)阳性染色细胞数.结果 TBI组伤后血糖升高,伤侧皮层GLUT-3表达增加,NSE阳性染色细胞数明显减少;胰岛素治疗组伤后血糖变化不明显,12、24、48、72 h GLUT-3表达量,NSE阳性染色细胞数明显多于TBI组;各组伤后健侧皮层GLUT-3表达量和NSE阳性染色细胞数未见明显变化.结论 创伤性脑损伤急性期胰岛素降糖治疗可减少伤后脑神经元缺失,对脑有保护作用,其机制可能与其降低高血糖所致的GLUT-3表达下调有关.     

三丁基氯化锡诱导下丘脑神经元细胞凋亡的模型研究

目的:建立三丁基氯化锡(TBTC)诱导的新生雌性大鼠下丘脑神经元细胞凋亡模型,并探讨相关机制。方法:取新生24 h以内的雌性SD大鼠,分离下丘脑神经元细胞进行原代培养。免疫荧光染色法鉴定下丘脑神经元纯度后,分别暴露于含不同浓度TBTC(0、100、150、200、250、300μg/L)的培养基中。孵育24 h后,CCK-8检测各组细胞存活率,流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况,Hoechst 33258染色观察凋亡细胞核形态,透射电镜观察细胞形态的改变,Western blot检测凋亡相关蛋白JNK、p-JNK的表达。结果:免疫荧光染色鉴定神经元纯度约为92.23%。与TBTC 0μg/L组相比,各浓度TBTC干预24 h对下丘脑神经元细胞的生长均有抑制作用,其相对存活率均显著降低(P0.01),且呈浓度依赖性;与TBTC 0μg/L组相比,不同浓度的TBTC作用24 h后,下丘脑神经元细胞均出现不同程度的细胞凋亡,其细胞凋亡率均显著升高(P0.01),且呈浓度依赖性。Hoechst 33258染色显示,TBTC 150μg/L组下丘脑神经元细胞核呈致密浓染的高强度蓝色荧光,细胞核出现明显的凋亡形态。透射电镜观察显示,TBTC 150μg/L组出现细胞核固缩并发生裂解,染色质边集化,可见多个凋亡小体;与TBTC 0μg/L组相比,TBTC 150μg/L组细胞p-JNK蛋白表达显著增多,p-JNK/JNK蛋白表达比值显著上调(P0.01)。结论:TBTC 150μg/L干预24 h可诱导下丘脑神经元细胞凋亡,其损伤机制与上调p-JNK蛋白表达有关。     

重组Leptin干预对新生鼠下丘脑中STAT3磷酸化蛋白表达的影响

目的：观察重组Leptin干预对原代培养的新生大鼠下丘脑神经元STAT3磷酸化蛋白的表达的影响。探讨Leptin干预及STAT3的磷酸化在肥胖发生中的可能作用，以期更加深入的研究肥胖症发生的中枢信号转导机制。方法：取新生5～7天SD大鼠下丘脑神经元，分散培养，观察下丘脑神经元的形态和NSE免疫染色鉴定活性；培养7天后。Leptin（100ng／ml培养液）干预24h，免疫细胞化学染色检测下丘脑神经元STAT3和磷酸化STAT3蛋白的表达情况。结果：新生大鼠下丘脑培养神经细胞接种时为圆形，逐渐贴壁、伸出突起；培养7～10天，神经细胞生长良好，细胞胞体逐渐增大。胞核和核仁清晰可见。神经元多数为突起多极细胞。神经细胞NSE染色呈阳性。胞浆和突起被染成棕色；而非神经细胞呈阴性反应。无Leptin干预时．下丘脑神经元胞浆和胞核内STAT3蛋白表达呈阳性，而磷酸化STAT3蛋白呈阴性表达。Leptin干预24h后，培养下丘脑神经元的胞核和胞浆内均有磷酸化STAT3蛋白的表达，呈棕黄色。STAT3蛋白表达仍为阳性。结论：重组Leptin干预可以影响培养的下丘脑神经元中STAT3磷酸化蛋白的表达，并增强其活性。