人胰岛素样生长因子I基因的半合成及其克隆表达

将人胰岛素样生长因子 Ⅰ（ＩＧＦ－ Ｉ）基因克隆到 ｐＥＴ１１Ｃ中,构建成 ｐＥＴＩＧＦ－ Ｉ表达载体,完成人ＩＧＦ－Ｉ基因在大肠杆菌中的高表达。方法：利用固相亚磷酸三酯法化学合成人ＩＧＦ－Ｉ基因的２条寡核苷酸片段,通过互补配对和Ｋｌｅｎｏｗ酶促补平成完整的ＩＧＦ－Ｉ双链ＤＮＡ片段,然后经酶切克隆于ｐＴＶ１１８Ｎ载体中,构建ｐＴＶＩＧＦ－Ｉ克隆载体并测定ＤＮＡ序列后,构建ＰＥＴＩＧＦ－Ｉ表达载体。结果：合成的人ＩＧＦ－Ｉ基因经测序证明与设计的一致,人 ＩＧＦ－ Ｉ基因在大肠杆菌中表达量高于 １０％。结论：选用大肠杆菌偏性密码子,小分子的人 ＩＧＦ－ Ｉ在大肠杆菌中可实现高表达     

人EPO cDNA基因在CHO细胞中的稳定表达

建立稳定表达人红细胞生成素（ＥＰＯ）的工程细胞株。方法：用 ＤＮＡ磷酸钙共转染法,将人ＥＰＯ ｃＤＮＡ的表达质粒 ｐＣＤＢ与标志质粒 ｐＳＶ－ｄｈｆｒ共转染到 ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－细胞中。用 ＥＬＩＳＡ法检测到 ７０个克隆的细胞培养上清,筛选出５０个克隆细胞系。结果：经ＭＴＸ加压扩增,获得４系高效表达ＥＰＯ的细胞系（Ｂ４、Ｃ３、Ｆ１０、Ｇ７）,表达量为 ２． ２～１０ μｇ／（１０６ ｃｅｌｌ· ２４ ｈ）,ＥＰＯ的分泌量在上述细胞系扩增了 １１～３１倍。 Ｆ１０细胞系表达量为最高,并进一步亚克隆纯化。其中Ｆ１０－６亚克隆细胞株的平均表达水平为１０ ｕｇ／（１０６ｃｅｌｌ·２４ ｈ）,细胞冻存后复苏传代１５次,ＥＰＯ的表达水平无明显改变。结论：以Ｆ１０－６亚克隆细胞株建立了工程细胞株。     

反相高效液相色谱法测定人血浆中双氯灭痛浓度

本文建立了用反相高效液相色谱法测定人血浆中双氯灭浓度的方法。血浆经酸化后正己烷－异丙醇（９０：１０，Ｖ／Ｖ）提取。     

乌苯美司对体外人白细胞介素—2生成及受体表达的促进作用

乌苯美司（乌比美克）１０￣１００μｇ／ｍｌ能促进人外周血淋巴细胞分泌ＩＬ－２；而０．０１￣０．１μｇ／ｍｌ则能增强人外周血淋巴细胞表达ＩＬ－２受体以及对ＩＬ－２发生反应的能力；在０．０１￣１００μｇ／ｍｌ范围内，乌苯美司对人血清中ＩＬ－２抑制物活性无明显影响。     

重组hIL-2腺病毒在体外癌细胞中的表达

为鉴定已构建的重组ｈＩＬ－腺病毒在体外的感染和表达活性,体外转导人多种癌细胞系,通过ＥＬＩＳＡ法测定所表达ＩＬ－２的量,ＭＴＴ法测定所表达ＩＬ－２的活性。结果发现ＡｄｖＩＬ－２能高效转导癌细胞,并检测到有１０ｎｇ水平ＩＬ－２表达,持续时间为３周左右。     

乌苯美司对体外人白细胞介素－2生成及受体表达的促进作用

乌苯美司（乌比美克）１０～１００μｇ／ｍｌ能促进人外周血淋巴细胞分泌ＩＬ－２；而０．０１～０．１μｇ／ｍｌ则能增强人外周血淋巴细胞表达ＩＬ－２受体以及对ＩＬ－２发生反应的能力；在０．０１～１００μｇ／ｍｌ范围内，乌苯美司对人血清中ＩＬ－２抑制物活性无明显影响。     

几种增渗剂对吡喹酮经离体鼠皮渗透性的影响

本文利用水平式Ｖａｌｉａ－Ｃｈｉｅｎ扩散池考察了过饱和生理盐水溶液中药物经离体鼠皮的渗透性及不同增渗剂的促渗作用，同时考察了吡喹酮体外经活性表皮的渗透性，结果表明吡喹酮经离体鼠皮及其活性表皮的渗透系数分别为４．７３×１０~（－６）ｃｍ／ｓ和２．９２５×１０~（－５）ｃｍ／ｓ，稳态流量分别为１．３１３×１０~（－３）μｇ／ｃｍ~２．ｓ和８．１１１×１０~（－３）μｇ／ｃｍ~２·ｓ，滞后时间分别为１．５２５ｈ和０．８６４ｈ，对皮肤经增渗剂处理前后，吡喹酮体外经皮的渗透实验结果表明月桂氮酮、泊洛沙姆１８８和油酸对其经皮渗透均有一定的促进作用，其中３％月桂氮酮的促渗作用最为显著，而Ｎ－乙基－２－吡咯烷酮则无明显增渗作用。此外，测定了吡喹酮在正辛醇／水、全皮／水和角质层／水的分配系数，结果表明药物的亲脂性极强。     

乌苯美司体外对人单核细胞功能的活化作用

观察了国产乌苯美司（乌比美克）体外对人单核细胞功能的影响：①０．０１￣１００μｇ／ｍｌ乌苯美司能直接诱导人单核细胞生成ＩＬ－１；②经０．１μｇ／ｍｌ乌苯美司作用４ｈ后，人单核细胞即开始分泌ＩＬ－１，２４ｈ达到高峰，以后逐渐下降；③经１０￣１００μｇ／ｍｌ乌苯美司预处理，单核细胞可促进ＮＫ细胞活性，而经０．０１￣０．１μｇ／ｍｌ乌苯美司处理，单核细胞则抑制ＮＫ细胞活性。     

人IL－18cDNA的RT－PCR扩增及重组质粒的构建

为构建人白细胞介素18（IL－18）的重组质粒，用RT－PCR技术从健康人外周血单核细胞中扩增出编码人IL－18的cDNA ,并将此基因定向克隆入表达载体pBV220中，通过对转化子的筛选得到带有IL－18插入片段的阳性克隆。经酶切分析及核苷酸测表明，克隆到基因与献报道完全一致。表达的重组IL－18占菌体总蛋白质的20％，表达的蛋白分子量约为18．3kD。表达产物主要以包涵体的形式存在。     

人粒细胞集落刺激因子基因重组及在E.coli中的表达和鉴定

将RT－PCR扩增的人粒细胞集落刺激因子（hG－CSF）结构基因与表达载体pJGW1重组，转化含有pGP1－2质粒的E.coliDH5α，进行温度诱导表达。经SDS－PAGE分析，rhG－CSF表达量占菌体总蛋白量的30％以上。将其复性，经CM－52FF离子交换层析纯化，纯化后的rhG－CSF（纯度＞98％）经SDS－PAGE测定分子量约为19kD；经胰酶裂解、反相HPLC分析肽谱具有8条特异肽段；等电聚焦测定PI值约为5．8；免疫印迹实验证实其与标准hG－CSF具有相同的抗原反应特异性；NH2-末端氨基酸分析与文献报道一致，采用小鼠白血病细胞株NFS－60测定活性为I×108IU／mg。     

醋酸汞和醋酸铅对大鼠间质细胞功能的影响

研究结果发现，醋酸汞Ｈｇ２＋（１０－８－１０－５ｍｏｌ／Ｌ）和醋酸铅Ｐｂ２＋（１０－７－１０－４ｍｏｌ／Ｌ）分别使得经ｈＣＧ（１００ｍＩＵ）刺激处理２４小时的Ｌｅｙｄｉｇ细胞内ｃＡＭＰ含量显著下降；同时Ｈｇ２＋（１０－７－１０－５ｍｏｌ／Ｌ）和Ｐｂ２＋（１０－６－１０－４ｍｏｌ／Ｌ）也使得Ｌｅｙｄｉｇ细胞Ｔ含量明显降低并且具有明显的剂量－反应关系。醋酸锌（Ｚｎ２＋）对原代培养的Ｌｅｙｄｉｇ细胞的上述观察指标均无影响，表明用这些指标的变化可以评价Ｈｇ２＋和Ｐｂ２＋对大鼠睾丸Ｌｅｙｄｉｇ的某些毒性。     

rhIL-6大肠杆菌高效表达的影响因素及其产品中试的研究

研究自构建的重组人白细胞介素－ ６（ｒｈＩＬ－６）基因工程菌株高效表达的影响因素及其ｒｈＩＬ－６产品中试工艺。方法：①将ｒｈＬ－６－ＰＢＶ重组质粒转化至ＲＲＩ、ＪＭ１０３和 ＤＨ５ ａ不同宿主菌中,在Ｍ９ＣＡ和 ＬＢ培养基中,４２℃诱导培养不同时间（３～６ ｈ）,观测 ｒｈＩＬ－６不同表达效率。②采用 １０ Ｌ发酵罐诱导培养,经破菌－洗包－溶包初步纯化后,再经三步柱层析纯化,提取ｒｈＩＬ－６。结果：①ｒｈＩＬ－６在ＤＨ５ ａ大肠杆菌中（ＳＤＨ－９４５株）表达效率高;可达 ３９％,用 Ｍ９ＣＡ培基,４２℃诱导培养 ５ｈ可使表达效率提高到４１％,②ＳＤＨ－９４５菌株在５批 １０Ｌ Ｍ９ＣＡ发酵诱导培养 ５ ｈ,ｒｈＩＬ－６表达效率可达 ３５． ８７±２． ６５％。经初步纯化后,ｒｈＩＬ－６的纯度达 ７４． ８７±３． ６８％,再经三步柱层析后,纯度可达 ９５％以上,比活性达 ４ × １０８ Ｕ／ｍｇ,总得率稍低可达 ２３．１％．结论：①ＳＤＨ－９４５工程菌株在 Ｍ９ＣＡ培养基巾,４２℃诱导培养 ５ ｈ,ｒｈＩＬ－６表达效率最佳。②１０ Ｌ发酵和纯化工艺可获高效价、高比活性、高纯度的ｒｈＩＬ－６合格生物制品。     

基因工程链激酶的中试研究

链激酶是急性心肌梗塞溶栓治疗的特效药物，我们利用基因工程方法在大肠杆菌中高效表达重组链激酶，用１０Ｌ发酵罐对工程菌进行高密度，高表达发酵，通过简便的复性和纯化流程，一次能够获得纯度达９８％以上，比活性９～１０万ＩＵ／ｍｇ的ｒ－ＳＫ，可分装３００～４００个剂量静脉注射用ｒ－ＳＫ冻干粉制剂，形成了中试规模的批量生产能力。     

大肠杆菌表达的重组人肿瘤坏死因子的分离纯化

对表达在大肠杆菌里的重组人肿瘤坏死因子（ｒｈＴＮＦ－α）进行分离纯化。方法：采用疏水相互作用层析和离子交换层析。结果：考察了影响疏水相互作用层析纯化的因素,优化了层析操作条件;样品经疏水相互作用层析后,少量残余的杂蛋白可通过离子交换层析除去。结论：获得了比活性为 ２． ８９×１０~７ｕ／ｍｇ的 ｒｈＴＮＦ－α,总回收率为４０．６％。     

抗肿瘤药物Antineoplaston A10新合成方法研究

报道了以１－谷氨酸为起始原料，经甲基化得１－谷氨酸－γ－甲酯，再经苯乙酰化，氨化和环合合成抗肿瘤药Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｏｎ Ａ１０的新方法，以１－谷氨酸－γ－甲酯计，总收率为４３％。产品经元素分析，红外光谱，核磁共振氢谱和质谱确证．     

丁基苯酞对局灶型脑缺血再灌大鼠脑hsp70mRNA和c-fos时相表达的影响

用原位杂交法和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹法，研究ＮＢＰ对暂时性大脑中动脉阻断大鼠不同再灌期脑内ｈｓｐ７０ｍＲＮＡ和ｃｆｏｓ的时相表达的影响。发现缺血后再灌１ｈ，在缺血侧有较明显的ｈｓｐ７０ｍＲＮＡ表达。再灌３ｈ，６ｈ和１２ｈ，表达逐渐加强。在缺血前１０ｍｉｎ和再灌即刻ｉｐＮＢＰ１０ｍｇ·ｋｇ－１和２０ｍｇ·ｋｇ－１均能明显降低再灌６ｈ和１２ｈｈｓｐ７０ｍＲＮＡ的表达。ｃｆｏｓ基因在再灌０５ｈ在缺血侧有清晰表达，再灌３ｈ达峰值，再灌６ｈ表达降低。ｉｐＮＢＰ１０ｍｇ·ｋｇ－１（缺血前１０ｍｉｎ）可明显降低再灌１ｈ和３ｈ时ｃｆｏｓ的表达。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹法显示了同样的结果。提示ＮＢＰ降低基因表达的作用可能是通过减轻缺血再灌引起的组织损伤来实现的。     

原发性中枢神经系统恶性淋巴瘤bcl—2基因产物的表达

运用免疫组化标记方法，观察１６例中枢神经系统Ｂ细胞淋巴瘤ｂｃｌ－２蛋白的表达。结果表明：１２例滤泡中心性淋巴瘤ｂｃｌ－２蛋白阳性，１例淋巴瘤细胞淋巴瘤ｂｃｌ－２蛋白阳性，总阳性率８１．２５％。其中以裂细胞表达为主。阳性细胞呈弥漫性分布或围绕血管呈袖套状分布，阳性者中１０例ｂｃｌ－２蛋白表达为Ⅱ－Ⅲ级。     

人胰岛素样生长因子Ⅰ基因的半合成及其克隆表达

目的 将人胰岛素样样生长因子Ⅰ（ＩＧＦ－Ⅰ）基因克隆到ｐＥＴ１１Ｃ中，构建成ｐＥＴＩＧＦ－Ⅰ表达载体，完成人ＩＧＦ－Ⅰ基因大在大肠杆菌中的表达。方法 利用固相亚磷酸三酯法化学合成人ＩＧＦ－Ⅰ基因的２条寡核苷酸片段，通过互补配对和Ｋｌｅｎｏｗ酶促补平成完整的ＩＧＦ－Ⅰ双链ＤＮＡ片段，然后经酶切克隆于ｐＴＶ１１８Ｎ载体中，构建ｐＴＶＩＧＦ－Ⅰ克隆载体并测定ＤＮＡ序列后，构建ｐＥＴＩＧＦ－Ⅰ表达载体。结     

人胎盘TRAIL基因的克隆和大肠杆菌中的表达

从人胎盘中提取总RNA，利用RT－PCR技术扩增了可溶性TRAIL（凋亡素配体2）基因片段。序列分析表明该基因序列与国外发表的可溶性TRAIL基因片段的序列完全相同。将该基因片段插入到含T7启动子的质粒pET-28c( )上，构建表达质粒pET-28c( )TRAIL，转化大肠杆菌BL21（DE3），筛选获得表达菌株BL－pET-28c( )TRAIL。表达菌经1mmol/L的IPTG诱导表达4h后，产生大量的重组人TRAIL蛋白，SDS－PAGE扫描计算机灰度分析表明，表达的重组蛋白占菌株可溶性蛋白的40％ 以上。     

卵巢肿瘤组织中P—糖蛋白的表达及临床意义

目的研究Ｐ－糖蛋白（Ｐ－ｇｐ）在卵巢组织中的表达及其临床意义。方法用免疫组化的方法测定４０例卵巢恶性肿瘤及１０例卵巢良性肿瘤组织中的Ｐ－糖蛋白表达及其与组织学类型和分级，临床分期及术前化疗的关系。结果Ｐ－ｇｐ在良性肿瘤中无阳性表达。在恶性肿瘤中Ｐ－ｇｐ表达阳性率为３７．５０％，Ｐ－ｇｐ表达与组织学类型、临床分期、术前化疗无关。Ｐ－ｇｐ生表达在低分化癌中占５８．３３％，高于高、中分化癌（１４．２８％