阿奇霉素耐药淋球菌菌株的耐药机制分析和分子流行病学特征

目的 探讨阿奇霉素耐药淋球菌菌株的分子流行病学特征,分析耐阿奇霉素淋球菌的耐药机制.方法 对36株耐阿奇霉素淋球菌[最小抑菌浓度(MIC)≥1 mg/L]的核糖体23SrRNA、mtrR基因及核糖体蛋白L4/L22基因进行PCR扩增测序分析,寻找可能的突变位点,比较耐药基因突变在中度耐药组(MIC 1~64 mg/L)和高度耐药组(MIC ≥256 mg/L)间的差异.采用NG-MAST对基因序列进行分型,获得阿奇霉素耐药菌株的基因型别及分布特征.结果 高度耐药淋球菌菌株核糖体23SrRNA的4个等位基因均有A2143G的突变,中度耐药菌株中有3株(8 mg/L≤MIC≤32 mg/L)核糖体23SrRNA 4个等位基因为C2599T突变.36株阿奇霉素耐药菌株中鉴定出28个不同的序列型别(ST),其中16个为新发现的ST,2个未分型.结论 淋球菌核糖体23SrRNA基因不同位点突变可能与阿奇霉素不同程度的耐药相关,A2143G突变可能导致高度耐药,C2599T可能与中度耐药有关,mtrR基因G45D的突变可能参与阿奇霉素耐药.通过NG-MAST分型显示阿奇耐药菌株的基因型具有多样性,且覆盖范围也较为广泛;经过系统进化树推断por581基因型有较大可能影响阿奇霉素高度耐药.     

海南地区2011年四环素高度耐药淋球菌terM基因分型

目的了解海南地区四环素高度耐药淋球菌（TRNG）的分子流行病学情况。方法采用琼脂稀释法检测TRNG菌株,PCR方法对TRNG菌株鉴定并进行term基因分型;纸片酸度法测定产β-内酰胺酶菌株（PPNG）,PCR方法鉴定B-内酰胺酶质粒并行TEM-1基因分型。结果2011年检测101株淋球菌,检出TRNG54株（53．47％）,其中22株（40．74％）对四环素和青霉素耐药;tetM基因分型结果显示52株为荷兰型,有2株为美国型。22株对四环素和青霉素耐药株的TEM-1基因分型21株为亚洲型,1株非洲型且合并美国型;未见多伦多型、里约型。结论海南地区TRNG流行株以荷兰型tetM基因为主（96．30％）,美国型偶见。     

青岛地区丙型肝炎基因分型的研究

目的 探讨青岛地区丙型肝炎基因型的分布状况,发现丙型肝炎病毒（HCV）流行优势株,分析丙型肝炎基因型与病人性别、感染途径、炎症活动度、病毒载量等的相关性。方法 应用RT-PCR方法,对46例青岛地区丙型肝炎病人的血清RNA提取物NS5B区和（或）CORE-E1区进行扩增,扩增片段进行基因测序,根据测序结果在PUBMED网站中获得基因分型结果,分析不同丙型肝炎基因型与病人性别、感染途径、肝病程度、HCV RNA含量及谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）水平的关系。结果 46例血清标本,HCV RNA均为阳性,44例可以分型,分型率为95.65%,其中基因1b型28例（63.64％）,2a型14例（31.81％）,3b型2例（4.55％）。丙型肝炎基因型的分布与病人性别、感染途径、肝病程度、HCV RNA含量及ALT、AST水平均无关（P〉0.05）。结论 青岛地区HCV流行株为基因 1b型和2a型,基因1b型为优势株,同时发现3b基因型。基因型与丙型肝炎的疾病进展程度及炎症活动度无关。     

淋球菌RAPD分型的引物筛选与应用

目的为了研究不同淋球菌菌株的基因多态性,了解不同菌株之间的亲缘关系,选择适当的随机引物。方法以淋球菌基因组DNA为模板,对淋球菌进行RAPD扩增,选择多态性好、重复性好、稳定性强的随机引物,并用S38号引物对不同淋球菌基因组DNA进行指纹图谱区分。结果从Sagon公司50条RAPD随机引物中筛选出8条扩增效果良好的引物,经RAPD扩增出的淋球菌指纹图谱间有明显不同的DNA多态性,可对不同菌株进行聚类分析。结论利用RAPD技术对淋球菌进行随机引物的筛选,可为今后淋球菌的分子流行病学研究奠定基础。     

185株白念珠菌25S rDNA基因型分布特点

目的：研究临床不同来源白念珠菌25S rDNA基因型分布特点,探讨白念珠菌不同基因型与感染部位或不同感染类型之间的联系.方法：特异性扩增不同来源的185株白念珠菌25S rDNA基因Ⅰ型内含子序列,再经过琼脂糖凝胶电泳方法对扩增条带进行基因分型,并对不同感染部位、不同感染类型的白色念珠菌的基因型进行比较.结果：185株白念珠菌中,A型122株（65.9％）、B型35株（18.9％）和C型28株（15.1％）,未发现D型与E型菌株;外阴阴道念珠菌病（VVC）来源与深部组织来源的白念珠菌25S rDNA基因型差异具有统计学意义（P=0.000）;深部组织来源菌株中,艾滋病相关性和非艾滋病相关性白念珠菌基因型差异无统计学意义（P=0.680）.结论：VVC来源和深部组织来源的白念珠菌25S rDNA基因型不同,而深部组织来源的艾滋病相关性和非艾滋病相关性白念珠菌25S rDNA基因型相同.     

RFLP基因分型在动态监测乙型肝炎病毒基因变异中的应用

目的探讨基因分型结合克隆后测序方法在动态监测ＨＢＶ基因变异中的价值。方法分析１例重型肝炎患者发 病后血清,用 ＰＣＲ扩增血清中 ＨＢＶ ｐｒｅＳ／Ｓ基因片段并克隆,２份标本各随机挑取 ３个阳性克隆进行测序;同时用 ＲＦＬＰ方法分析２份血清中ＨＢＶ毒株的基因型。结果ＰＦＬＰ分析２份血清为Ｂ基因型为主的Ｂ／Ｃ基因型混合毒株感 染;６个克隆中仅１株为Ｃ基因型。比较２份血清ＨＢＶ ｐｒｅＳ／Ｓ克隆核酸序列,有１７０个点位的差异,剔除Ｃ基因型株 后,仅５４个位点差异。结论克隆后测序结合ＲＦＬＰ对ＨＢＶ基因型测定有助于更准确地对ＨＢＶ基因变异进行动态分 析。     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MLST 联合SCCmec 基因分型与耐药性分析

目的 了解滨州医学院附属医院MRSA 菌株多位点序列分型（MLST）联合SCCmec 基因型分布 和各种基因型的耐药特征。方法 采用聚合酶链反应（PCR）对MRSA 菌株进行MLST 联合SCCmec 基因分型； 采用WalkWAY96PLUS PC33 药敏板检测MRSA 抗菌药物敏感性。结果 SCCmec 基因分型结果以Ⅲ型为 主（63/67 株，占94.03%），MLST 分型共检测出6 种基因型：ST 88、ST 121、ST 221、ST 82、ST 239 及ST 399， 其中以ST 239（61/67，91.04%）为主，耐药性分析显示SCCmec Ⅲ型MRSA 菌株表现为多重耐药。结论 ST239-MRSA-SCCmec Ⅲ型菌株为鲁北地区MRSA 主要流行菌株，该型菌株对多种抗生素呈多重耐药； MLST 联合SCCmec 基因分型方法是MRSA 遗传背景研究简便快速的方法。     

淋球菌mtrR启动子区域中回文序列基因突变与多重耐药的关系

目的：探讨淋球菌mtrR启动子区域中回文序列基因突变与多重耐药之间的关系。方法：① 纸片扩散法检测56株淋球菌对5种抗生素的敏感性;② PCR扩增mtrR启动子区域中包含有13个碱基回文序列在内的157个碱基,并进行SSCP（单链构象多态性）分析;③根据SSCP的结果,选取12株标本进行测序分析,将其核苷酸序列与标准敏感株ATCC19424进行比较。结果：56株细菌中有5株对5种抗生素都敏感;对1种抗生素耐药的有22株;对2种抗生素耐药的有19株,其中有2株mtrR启动子区域中回文序列基因发生了突变;对3,4和5种抗生素耐药的株菌分别是7株、2株和1株,它们的mtrR启动子区域中回文序列基因均发生了突变。并且这12株突变的类型一致,在13个碱基的回文序列中发生了单个A/T碱基的缺失。结论： mtrR启动子区域中回文序列基因突变介导淋球菌的多重耐药;回文序列单个A/T碱基的缺失与淋球菌多重耐药的关系密切。     

中国镇江地区幽门螺杆菌vacA基因型状况及其与胃十二指肠疾病关系的研究

目的：调查中国镇江地区幽门螺杆菌（H．pylori）vacA基因型状况及其与胃十二指肠疾病关系。方法：在微氧环境下取胃黏膜标本中分离培养出H．pylori共36株,以聚合酶链反应（PCR）方法检测其基因组DNA中vacA基因型。结果：36株H.pylori临床株中vacA信号序列类型中sla、s2所占比例分别为83．3％、13．9％,未发现slb型。vacA中间序列类型中m1、m2所占比例分别为16．7％、75％。分别有1株和3株vacA信号序列和中间序列未能分型。基因型组合sla／m2、sla／m1、s2／m2所占比例分别为61．1％、19．4％、8．3％。Hpylori菌株vacA各基因型在胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡和胃癌四组疾病中的分布差异均无显著性（P〉0．05）。结论：sla、m2和sla／,m2分别是中国镇江地区Hpylori菌株vacAs、m区及其组合的优势基因型。但本研究未能证实H．pylori菌株vacA基因型与胃十二指肠疾病的相关性。     

慢性乙型肝炎患者HBV基因型及其临床意义

目的 了解广东地区慢性乙型肝炎患者HBV基因型特点及其临床意义。方法 用特异性引物扩增乙型肝炎病毒S基因区,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)基因分型方法,对该地区55例慢性活动性乙型肝炎(CAH)患者感染的HBV进行基因分型,并与其临床生化结果、病毒定量和肝组织病理进行相关性分析。结果 B基因型28例(51.0%),C基因型18例(32.7%),D基因型4例(7.3%),B+C型4例(7.3%),未分型1例(1.8%)。其中年龄大于30岁的26例患者B和C基因型的丙氨酸转氨酶水平分别为(190.9±270.3)IU和(141.0±83.0)IU(t=0.532,P>0.05),肝脏病理炎症分级的平均秩次为10.4和11.8(Z=0.561,P>0.05),肝脏病理纤维化分期的平均秩次为10.5和11.7(Z=0.483,P>0.05),HBVDNA含量分别为106.8±1.4和108.5±1.1(t=2.989,P<0.05),HBeAg阳性数分别为2/12和8/9(Fisher’s精确概率P=0.002)。结论 广东地区HBV基因型主要为B型和C型;两种基因型感染者丙氨酸转氨酶水平、病毒复制水平、HBeAg表达水平以及肝脏病理炎症和纤维化程度无显著性差异;然而在年龄大于30岁的CAH患者中,感染C基因型的HBV病毒复制水平和HBeAg表达水平比感染B基因型者显著增高。     

Genotyping of hepatitis B virus and its clinical significance in patients with chronic hepatitis B]

OBJECTIVE: To investigate the distribution of hepatitis B virus (HBV) genotypes in Guangdong and explore its clinical significance. METHODS: Fifty-five patients with chronic active hepatitis (CAH) from Guangdong province were included in this study. HBV surface gene amplified by PCR was analyzed by restriction fragments length polymorphism (RFLP) for HBV genotyping, and the relationship of HBV genotype with clinical, serological and histological data of the patients was analyzed. RESULTS: Twenty-eight out of 55 patients were infected with HBV strains of genotype B (51.0%), 18 with genotype C (32.7%), 4 with genotype D (7.3%), 4 with HBV classified as genotype B+C (7.3%), and 1 (1.8%) with HBV that did not conform to any of the genotypes from A to G. No significant differences in clinical, histological, or serological data of HBV DNA loading were detected between genotypes B and C. But in patients older than 30 years, the genotype C was accompanied by significantly higher HBV DNA loading and serum HBeAg level than genotype B (Fisher's exact test, P=0.002). CONCLUSIONS: HBV genotype B and C are the major genotypes prevalent in Guangdong Province. Genotype C is associated with the longer duration of HBeAg and higher HBV DNA level in patients older than 30 years, suggesting the higher risk of HBV genotype C infection to progress into chronic liver disease.     

男性淋病患者奈瑟球菌57株药敏分析

目的：了解男性淋病患者奈瑟球菌对抗生素的药敏情况。方法：纸片扩散法检测57株淋病奈瑟球菌对7种抗生素的药敏。用头孢硝噻吩纸片法检测产青霉素酶淋病奈瑟菌（PPNG）,以对四环素药敏纸片抑菌圈直径≤19 mm推测为高水平耐四环素淋病奈瑟球菌（TRNG）。结果：淋病奈瑟球菌对青霉素、四环素、环丙沙星敏感性分别为12.3%、17.5%、28.1%;对头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松耐药性分别为5.3%、3.5%、5.3%;无大观霉素耐药株。57株中检出14株PPNG菌株（24.6%）,16株（28.1%）疑为TRNG。结论：淋病奈瑟球菌对青霉素、四环素、环丙沙星耐药性严重,这些药物已不再适合用于淋病治疗;第三代头孢菌素和大观霉素仍是一线用药,但应重视中介株,否则导致严重耐药性。     

淋病奈瑟菌PCR检测的临床应用研究

为评价淋病奈瑟菌ＰＣＲ检测的临床效果,建立了对标准淋病奈瑟菌的ＤＮＡＰＣＲ检测技术。结果显示,ＮＧ ＰＣＲ技术的灵敏度约为３个菌的基因组拷贝。对８种菌株进行ＮＧ ＰＣＲ,只有标准淋病奈瑟菌显示阳性,其余７株非淋球菌菌株均阴性,说明有很好的特异性。对４９例淋病患者同时进行涂片镜检法、细菌培养法和ＰＣＲ法检测的比较,其阳性检出率分别为７６．６％、５２．２％和９５．９％。提示ＮＧ ＰＣＲ方法比涂片和培养法更为敏感,且特异性强,在淋病的诊断,特别是早期诊断中有重要参考价值。     

250株质粒介导的耐药淋球菌株的流行趋势分析

目的了解7年来广州地区质粒介导耐药淋球菌株的流行趋势。方法用琼脂稀释法测定最低抑菌浓度(MICs),筛选出质粒介导四环素耐药淋球菌(TRNG),以及用纸片碘量法测定质粒介导的产青霉素酶的淋球菌(PPNG)。结果846株淋球菌检出PPNG131株(15.5%)、TRNG184株(21.8%),7年来,PPNG、TRNG流行率经μ检验,P<0.01,有显著性差异。结论PPNG和TRNG流行率呈逐年上升趋势,持续监测质粒介导耐药淋球菌株的流行趋势是十分必要的。     

多重耐药淋病奈瑟菌耐药基因研究

目的:探讨淋病奈瑟菌多重耐药表型与耐药基因型之间的关系。方法:应用K-B法检测临床分离到的40株淋病奈瑟菌对8种常用抗生素的敏感性。用煮沸法提取细菌的DNA,用PCR法检测随机抽取其中20株分离株的TEM、tetM、ermF和mefA基因。结果:淋病奈瑟菌的多重耐药现象明显,对氧氟沙星和环丙沙星的耐药率均高达92.5%;TEM、tetM基因的检出率均为75.0%,ermF和mefA基因未检出;本组菌株对青霉素的耐药表型与TEM基因密切相关(Kappa=0.733,P<0.01)。结论:淋病奈瑟菌的多重耐药表型与耐药基因之间密切相关。     

淋球菌外膜蛋白NspA基因重组子的构建与表达

目的构建淋球菌标准株外膜蛋白NspA基因重组子,在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达外膜蛋白NspA。方法提取淋球菌标准株基因组DNA,PCR扩增其NspA基因,插入表达质粒载体pET-30c（＋）中,构建pET-NspA重组子,转化表达宿主大肠杆菌BL21（DE3）,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE和Western Blot检测表达蛋白。结果成功构建了淋球菌标准株的pET-NspA大肠杆菌表达重组子,经IPTG诱导表达后,该蛋白在大肠杆菌中高效表达。结论淋球菌外膜蛋白NspA在大肠杆菌中的成功表达,为研究该蛋白的免疫学性能、制备抗体和研制预防淋病的疫苗奠定了基础。     

240株淋球菌药敏测定分析

本文对240株淋球菌的药物敏感性进行了研究;结果表明,对青霉素的耐药率为86.7％;螺旋霉素为89.1％;氨苄青霉素为92.5％;林可霉素为88.3％;氟哌酸为3.3％,提示临床对淋病的治疗应注意药物的选择,以免给患者造成不必要的痛苦和经济上的浪费。同时还对性别、文化程度、职业特点作了分析。     

淋球菌MtrR基因调控区删除突变与淋球菌耐药的关系

目的分析淋球菌MtrR基因调控区删除突变与淋球菌耐药之间的关系。方法以临床收集的淋菌株为出发株,用制备的突变MtrR DNA片段进行转染试验,筛选并纯化MtrR基因调控区9bp片段删除的突变株,测定出发株和转染株对多种抗菌素的最小抑菌浓度(MIC)值和MtrCDE基因转录量。结果在18株临床株中,有15株被转染为目的突变株,其余3株始终不能被转染。转染株与出发株相比,对Triton-100的MIC值平均提升28.64倍,对脂溶性抗生素红霉素和四环素的MIC值平均升高8.55倍和5.53倍,差异均有统计学意义(均P<0.01);对氯霉素和链霉素的平均MIC值,两者差异无统计学意义(均P>0.05)。RT-PCR产物的凝胶电泳分析显示,所有转染株MtrCDE基因转录水平均有不同程度的升高,且与淋球菌对脂溶性抗菌试剂的耐药水平呈正相关。结论转染株MtrR基因调控区9bp片段的删除可通过阻断MtrR基因表达而提高MtrCDE基因的转录水平,从而诱导淋球菌耐药。     

重庆地区耐多药结核分枝杆菌基因分型特征分析

目的 对重庆地区耐多药结核患者结核分枝杆菌进行基因分型,明确该地区基因类型的特征和流行情况.方法 连续收集重庆市公共卫生医疗救治中心和重庆市第十二人民医院结核内科2013年7月至2015年3月753例临床诊断为耐多药结核患者的痰液或其他体液,采用液体培养法分离培养分枝杆菌,采用PCR方法对分枝杆菌分离株进行菌种鉴定,并使用多位点数目可变串联重复序列分析(multiple locus variable number of tandem repeat analysis,MLVA)方法进行基因分型.采用Bionumerics Version 3.0和phyloviz软件进行各基因位点的多态性和成簇分析.结果 共分离培养出538例耐多药分枝杆菌菌株,经PCR鉴定确认结核分枝杆菌有503例(95.8％),非结核分枝杆菌有35例(4.2％).北京家族型470例(93.4％,470/503),非北京家族型33例(6.6％,33/503).503例分枝杆菌菌株共分为348个基因型,其中267例患者分离株为单一基因型,其余236例菌株可归入81个簇,成簇率为30.8％.北京家族型有76个簇,成簇率为30.8％,成簇比例为35.9％,非北京家族型有5个簇,成簇率为30.3％,成簇比例为33.3％.不同特征的耐多药结核人群对结核分枝杆菌北京基因型菌株易感因素分析:感染北京基因型菌株与性别无显著性关联(x2=2.68,P ＞0.05);与年龄呈显著性关联(x2 =784.00,P＜0.05).结论 重庆地区耐多药结核分枝杆菌的基因型存在明显的多态性,北京基因型占绝对优势;不同特征耐多药结核人群感染北京基因型菌株与性别无关,与年龄相关.     

淋球菌外膜蛋白PI基因重组子的构建和表达

目的 扩增四株淋球菌外膜蛋白PI基因，构建pET30b-PI-NG重组子，在大肠杆菌中诱导表达外膜蛋白PI．方法 采集临床淋球菌四株，提取细菌基因组DNA，PCR扩增外膜蛋白PI基因，与克隆载体pBS-T连接，构建pBS-T-PI-NG重组子，测序，目的基因插入表达质粒载体pET30h中，构建pET30h-PING重组子，转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导蛋白质表达，SDS-PAGE初步分析．结果 成功构建了四株淋球菌的pET30b-PI大肠杆菌表达重组子，经IPTG诱导表达后，其中三株获得表达的目的蛋白PI。结论 本研究为PI蛋白免疫学特性的研究、抗体制备、以及预防淋病疫苗的研制莫定了基础。