shRNA干扰Rab9 GTPase表达对麻疹病毒野生株体外增殖的抑制作用

目的构建Rab9 GTPase短发夹RNA（shRNA）表达载体,观察其对Rab9 GTPase基因表达和麻疹病毒野生株体外增殖的抑制作用。方法参照GenBank中Rab9 GTPase基因序列设计合成2对Rab9 GTPase基因特异性shRNA,定向克隆人表达载体,构建重组表达载体,酶切鉴定和序列分析证实后脂质体法转染U937细胞,然后感染麻疹病毒野生株,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫印迹技术（Western blot）检测转染细胞内Rab9 GTPase mRNA和蛋白质的表达水平;标准蚀斑试验测定病毒滴度;流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化;RT-PCR检测转染细胞内双链RNA依赖蛋白激酶（PKR）和2′-5′寡腺甙酸合成酶（OAS-1）的mRNA水平。结果酶切和序列分析证实,成功构建了靶向Rab9 GTPase基因的shRNA表达载体。2个shRNAs均可特异性抑制U937细胞内Rab9 GTPase mRNA和蛋白质的表达,最高抑制率分别为（90.5±0.2）％和（92.1±0.3）％;蚀斑试验结果表明,shRNAs可以有效抑制麻疹病毒野生株体外增殖,其抑制率可达到90％以上;流式细胞仪检测转染后细胞的凋亡率无明显变化;RT-PCR检测PKR和OAs-1的mRNA水平转染前后无明显变化。结论成功构建Rab9 GTPase特异性shRNA表达载体。shRNAs通过特异性抑制Rab9 GTPase基因表达抑制麻疹病毒野生株体外增殖。     

靶向PCSK9基因shRNA慢病毒载体的构建及其对PCSK9基因表达的沉默

目的设计以PCSK9基因为靶点的短发夹状RNA（shRNA）,构建重组慢病毒载体并鉴定此RNA干扰体系对PCSK9基因表达的影响。方法将3条人PCSK9基因的shRNA片段插入至慢病毒载体pLentilox3．7,与pCDNA3-hPCSK9．FLAG质粒用Lipofectamine2000共转染293细胞,Western blotting法鉴定出最有效的shRNA。此重组质粒与pCre—VSV-G、pLoxp．CMV—R8．91经293细胞包装后,产生的重组慢病毒感染293细胞,48h后转染pCDNA3．hPCSK9-FLAG质粒,Western blotting法检测人PCSK9基因表达的情况。结果经双酶切鉴定,构建了PCSK9shRNA慢病毒载体pLentilox—hPC—SK9,鉴定出hshRNA-2为最有效的shRNA。重组的慢病毒能明显的抑制人PCSK9的表达。结论慢病毒介导的shRNA干扰技术可特异性的阻断PCSK9的表达,为进一步探讨PCSK9特异性的shRNA治疗脂代谢异常疾病奠定了基础。     

靶向SMAD3基因的shRNA重组慢病毒对大鼠肝再生的作用

目的:应用大鼠肝大部切除肝再生模型,将前期构建好的靶向SMAD3基因的shRNA重组慢病毒注射入大鼠体内,观察SMAD3 shRNA对大鼠肝再生的影响.方法:将60只♂Wistar大鼠随机分为3组:SMAD3 shRNA组(20只)、shRNA对照组(20只)、生理盐水对照组(20只),通过脾脏注射方法给药,慢病毒给药剂量为1.0×108TU/只,生理盐水对照组给予等体积500L生理盐水.给药96h后行2/3肝大部切除,构建大鼠肝再生模型;肝大部切除术后96h各组分别除死大鼠7只,剩余大鼠于144h处死,收集肝脏标本,Real-Time PCR、免疫组织化学检测肝组织SMAD3表达,免疫组织化学检测肝组织Ki67表达,测定大鼠肝质量/体质量,观察SMAD3 shRNA对肝再生的影响.结果:Real-Time PCR检测显示,通过脾脏注射慢病毒,在96、144h处死时间点,SMAD3 shRNA组SMAD3 mRNA分别较shRNA对照组平均下降73%、63%.免疫组织化学检测显示SMAD3蛋白表达明显下降.Ki67免疫组织化学结果显示,肝大部切除术后96、144h,SMAD3 shRNA组Ki67表达阳性细胞数均明显多于生理盐水对照组及shRNA对照组,表明抑制SMAD3表达后肝细胞增殖活跃.大鼠肝质量与体质量比值显示,SMAD3 shRNA组分别较生理盐水对照组及shRNA对照组有增加趋势(96h:4.50±0.43vs3.97±0.55vs3.98±0.40,144h:4.66±0.54vs4.15±0.51vs4.20±0.34),但没有统计学意义(P>0.05).结论:SMAD3 shRNA在大鼠体内可一定程度上促进肝细胞增殖,但对肝再生的促进作用尚弱.     

反基因及反义寡核苷酸抑制乙型肝炎病毒复制与表达的研究

目的 探讨反基因及反义寡核苷酸抗乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）作用。方法 设计合成针对ＨＢＶ核心启动子Ｓｐ１位点（１７３４ｎ－１７５４ｎｔ）及前Ｃ ＲＮＡ,前基因组ＲＮＡ５’端起始区（１８１４ｎｔ－１８３４ｎｔ）的２１聚硫代修饰反基因寡核苷酸（ＤＮａｎ２１）及反义寡核苷酸（ＯＤＮａｓ２１）。将各寡核苷酸与２２．１．５细胞温育。     

商陆抗病毒蛋白体外抑制乙型肝炎病毒复制的研究

商陆抗病毒蛋白（pokeweed antiviral protein，PAP）是从美洲商陆种子或叶子中提取的一种碱性蛋白，具有抑制流感病毒、脊髓灰质炎病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、HIV等多种病毒复制的作用。我们先前的研究发现：天然PAP种子体外直接作用于HepG2．2．15细胞，显示有较强的抗HBV作用，但在高剂量时对细胞有一定毒性。本研究旨在探讨PAP真核表达质粒体外对HBV的抑制作用。[第一段]     

靶向S100A4的shRNA对乳腺癌MCF-7细胞体外侵袭力及迁移力的影响

目的探讨靶向S100A4短发夹RNA（shRNA）对MCF-7细胞侵袭力和迁移力影响的作用机制。方法构建S100A4基因特异性shRNA表达载体,使用QRT-PCR和Westernblot检测转染后MCF-7细胞中s100A4的表达水平,经过脂质体介导将S100A4-shRNA表达载体转染人MCF-7细胞,G418筛选及克隆化培养。采用Trans-well小室法和划痕试验检测MCF-7细胞侵袭力和迁移力变化。结果经测序鉴定证实S100A4-shRNA表达载体成功构建。转染48h后,所构建的S100A4-shRNA-1表达载体能有效抑制MCF-7细胞中S100A4表达;MCF-7细胞形态无显著变化,但侵袭力和迁移力明显下降。结论S100A4在乳腺癌细胞侵袭和转移过程中扮演重要角色,通过沉默其表达可抑制MCF-7的侵袭力和迁移力从而抑制其转移。     

大鼠nelin基因干扰质粒的构建及其体外抑制效果研究

目的构建大鼠nelin基因干扰质粒并对其进行体外抑制效果验证,为研究nelin在心脏发育、心肌肥厚、心衰及其它心脏疾病中的作用提供有效的研究工具。方法提取大鼠心肌组织RNA,逆转录为cDNA,设计合成含BamHI和EcoRI酶切位点的引物,以大鼠cDNA为模板PCR扩增获得nelin基因,定向克隆入pEGFP-N1-3FLAG载体,测序验证。以克隆得到的大鼠nelin基因为模板,设计合成候选干扰序列,亚克隆至pGCSIL-U6载体,获得干扰质粒。以nelin基因干扰质粒和重组表达质粒共转染HEK293T细胞,WesternBlot方法检测干扰效果。结果成功克隆了大鼠nelin基因并构建了nelin基因重组表达载体pEGFP-N1-3FLAG-rNelin。设计构建的4个干扰质粒(靶位点分别为+370-388位,+376-394位,+545-563位,+1206-1224,命名为pGCSIL-U6-nelin/siteⅠ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ)均可显著降低nelin基因的表达,尤以靶向(+370-388位)位点即pGCSIL-U6/nelin-siteI质粒的干扰效果最佳。结论本实验构建的大鼠nelin基因特异性干扰质粒能从蛋白水平上高效特异地抑制ne-lin基因表达,为进一步开展其功能研究奠定了基础。     

靶向HBX基因小干扰RNA抑制乙型肝炎病毒复制的实验研究

目的探讨HBX特异性RNA小干扰抑制乙型肝炎病毒复制的作用。方法用脂质体转染法将干扰质粒pSilencer3.1-shHBX和通用阴性对照质粒分别转染HepG2.2.15细胞,并设立未转染的空白对照组。分别于转染后24、487、2 h收集细胞培养上清液和细胞总蛋白,Western blot检测HBx蛋白表达情况,ELISA检测3组细胞上清中HBsAg和HBeAg表达情况。结果 Western blot检测显示,干扰质粒转染组HBx蛋白表达量逐渐降低,各时间点的表达量与空白对照组和通用阴性对照组比较差异均有统计学意义(P0.01);ELISA检测显示,各时间点干扰质粒转染组细胞培养液上清中HBsAg和HBeAg的表达均下调,表达量与空白对照组和通用阴性对照组比较差异均具有统计学意义(P0.01)。结论 HBX特异性小干扰RNA可抑制HBV复制,为siRNA作为抗乙肝病毒感染制剂提供了实验依据。     

猪链球菌9型分离株的耐药性及耐药基因分析

目的 了解猪链球菌9型(Streptococcus suis serotype 9,SS9)的耐药性和耐药基因情况。方法 采用药敏纸片扩散法检测15株SS9菌株对9类21种不同抗生素的耐药性,并通过PCR方法检测其大环内酯类及四环素类耐药基因的携带情况。结果 被检菌株对大环内酯类及林可胺类耐药率都为100%,对四环素及链霉素的耐药率都为93.3%,对头孢类、氯霉素类、阿莫西林、糖肽类以及庆大霉素较为敏感。所有菌株均耐7种及以上抗菌药物,最高可耐16种,其中以8重耐药的菌株数量最多。不同地区SS9分离株对抗生素耐药情况不同,健康猪分离株耐药情况较病猪分离株更为严重。100%的菌株具有ermB基因,93.33%的菌株具有tetO基因,表明ermB和tetO分别可能是介导SS9对大环内酯类及四环素产生耐药性的主要原因之一。结论 本研究为猪链球菌9型的预防和临床治疗、耐药性及耐药机制的研究提供了参考依据。     

环孢素A对乙型肝炎病毒作用的体外实验

目的探讨环孢素A（CsA）在体外对乙型肝炎病毒（HBV）蛋白合成、DNA复制的影响。方法将不同浓度的CsA（0．6～20．0μg／ml）作用于HepG2．2．15细胞系，通过检测细胞培养上清液中乙型肝炎表面抗原（HBsAg）和乙型肝炎e抗原（HBeAg）水平；以及细胞内乙型肝炎核心抗原（HBcAg）mRNA水平和HBVDNA水平来评价HBV复制情况；通过检测细胞内PyK2激酶402位点酪氨酸（PyK2Y402）磷酸化水平来探讨CsA对HBV复制的作用机制。结果CsA对HBV复制具有抑制作用，随着CsA浓度的升高，对HBsAg和HBeAg的抑制率逐渐上升，细胞内HBVDNA复制水平下降。10．0μg／ml CsA作用4d时，对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为49．7％和34．3％，HBVDNA的表达量仅为对照组的34．9％。在2．0“g／ml CsA作用下PyK2 Y402的磷酸化水平下降。结论CsA对HepG2．2．15细胞HBsAg和HBeAg表达、HBVDNA复制均有抑制作用，并呈剂量依赖性。CsA可能通过降低PyK2 Y402的磷酸化水平抑制HBV的复制。     

Inhibition of hepatitis C virus infection and expression in vitro and in vivo by recombinant adenovirus expressing short hairpin RNA

Background and Aim:  We have reported previously that synthetic small interfering RNA (siRNA) and DNA-based siRNA expression vectors efficiently and specifically suppress hepatitis C virus (HCV) replication in vitro . In this study, we investigated the effects of the siRNA targeting HCV-RNA in vivo .
Methods:  We constructed recombinant retrovirus and adenovirus expressing short hairpin RNA (shRNA), and transfected into replicon-expressing cells in vitro and transgenic mice in vivo .
Results:  Retroviral transduction of Huh7 cells to express shRNA and subsequent transfection of an HCV replicon into the cells showed that the cells had acquired resistance to HCV replication. Infection of cells expressing the HCV replicon with an adenovirus expressing shRNA resulted in efficient vector delivery and expression of shRNA, leading to suppression of the replicon in the cells by ∼10⁻³. Intravenous delivery of the adenovirus expressing shRNA into transgenic mice that can be induced to express HCV structural proteins by the Cre/ lox P switching system resulted in specific suppression of virus protein synthesis in the liver.
Conclusion:  Taken together, our results support the feasibility of utilizing gene targeting therapy based on siRNA and/or shRNA expression to counteract HCV replication, which might prove valuable in the treatment of hepatitis C.     

小发夹RNA体外抑制乙型肝炎病毒X蛋白表达的实验研究

目的构建靶向乙型肝炎病毒X基因（HBX）的shRNA表达载体pSilencer3．1-shHBX,观察其体外抑制HBX在HepG2细胞中表达的作用,为应用RNA干扰技术进一步研究HBX基因的功能奠定基础。方法设计并构建靶向HBx的shRNA表达载体pSilencer3．1-shHBX,脂质体转染法将HBX表达载体pcDNA3．1-HBx与pSilencer3．1-shHBX共转染人肝癌HepG2细胞,培养72h后以RT-PCR检测HBX基因表达情况,以Western blot检测HBX蛋白的表达量。结果经酶切和测序鉴定,构建的重组质粒pSilencer3．1-shHBX与设计一致。该质粒使HBX基因mRNA表达量降低47．1％,使HBx蛋白表达量降低58．9％,而阴性对照质粒无此作用。结论成功构建靶向HBXshRNA表达载体pSilencer3．1-shHBX,该质粒可体外抑制HBX在HepG2细胞中的表达。     

HepG2 cells support viral replication and gene expression of hepatitis C virus genotype 4 in vitro

AIM: To establish a cell culture system with long-term replication of hepatitis C virus (HCV) genome and expression of viral antigens in vitro. METHODS: HepG2 cell line was tested for its susceptibility to HCV by incubation with a serum from a patient with chronic hepatitis C. Cells and supernatant were harvested at various time points during the culture. Culture supernatant was tested for its ability to infect naive cells. The presence of minus (antisense) RNA strand, and the detection of core and El antigens in cells were examined by RT-PCR and immunological techniques (flow cytom-etry and Western blot) respectively. RESULTS: The intracellular HCV RNA was first detected on d 3 after infection and then could be consistently detected in both cells and supernatant over a period of at least three months. The fresh cells could be infected with supernatant from cultured infected cells. Flow cytometric analysis showed surface and intracellular HCV antigen expression using in house made polyclonal antibodies (anti-core, and anti-El). Western blot analysis showed the expression of a cluster of immunogenic peptides at molecular weights extended between 31 and 45 kDa in an one month old culture of infected cells whereas this cluster was undetectable in uninfected HepG2 cells. CONCLUSION: HepG2 cell line is not only susceptible to HCV infection but also supports its replication in vitro. Expression of HCV structural proteins can be detected in infected HepG2 cells. These cells are also capable of shedding viral particles into culture media which in turn become infectious to uninfected cells.     

水甘油通道蛋白9短发夹RNA的构建与筛选及其对非酒精性脂肪性肝病细胞模型的作用

目的 构建人水甘油通道蛋白9 (AQP9)短发夹RNA (shRNA),筛选出沉默效果明显的重组质粒,检测AQP9的sh.RNA对非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)细胞模型的作用.方法 设计合成针对人AQP9的小干扰RNA,退火形成双链shRNA后插入pGenesil-1质粒中,并将其转染L02肝细胞,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot筛选出沉默效果明显的重组质粒.经油酸诱导L02细胞脂肪变性建立NAFLD细胞模型,通过油红O染色,测定甘油三酯、游离脂肪酸及甘油含量,检测重组质粒对NAFLD细胞模型的作用.数据比较采用方差分析.结果 经RTPCR及Western blot筛选,pshRNA-AQP9a转染组mRNA及蛋白质相对表达率为25.10％±1.19％及25.41％±1.96％,与未处理L02细胞组的39.33％±1.69％及35.08％±1.89％相比,均明显降低(P值均＜ 0.01);将重组质粒pshRNA-AQP9a转染NAFLD细胞模型能够降低其AQP9的mRNA及蛋白质表达量;油红O染色结果显示,油酸/pshRNA-AQP9a转染组细胞内脂质含量明显减少.油酸/pshRNA-AQP9a转染组细胞内甘油三酯、游离脂肪酸及甘油含量分别为(2.738±0.231) mmol/L、(1.182±0.168)mmol/L和(0.730±0.084) mmol/L,油酸组分别为(3.218±0.220) mmol/L、(1.538±0.193)mmol/L及(1.024±0.148) mmol/L,油酸/pshRNA-AQP9a转染组均明显降低(P值均＜0.05).结论 降低AQP9表达量能够减轻NAFLD细胞模型的脂肪变性程度,为进一步研究AQP9对NAFLD的基因治疗奠定基础.     

白细胞介素-1受体相关激酶-4短发夹RNA阻断库普弗细胞激活效应的实验研究

目的 探讨以白细胞介素-1受体相关激酶-4（IRAK-4）特异性短发夹RNA（shRNA）阻断内毒素诱导的库普弗细胞（KCs）激活效应的可行性。方法 构建两对表达IRAK-4-shRNA的阳性载体质粒（pSfIRAK-4-A，pSfIRAK-4-B）及一对阴性载体质粒（pSⅡRAK-4-C）。分离培养小鼠KCs，分为正常对照组，RNA干扰（RNAi）对照组（转染pSⅡRAK-4-C）与RNAi抑制组（转染pSⅡRAK-4-A，pSⅡRAK-4-B）。质粒转染后24h，加入0．1μg／ml脂多糖（LPS）。6h后，蛋白免疫印迹法及逆转录聚合酶链反应测定IRAK-4蛋白和mRNA表达水平；酶联免疫吸附法检测0、1、3、6、12h后KCs的核因子-κB（NFKB）活性及培养上清液中肿瘤坏死因子α含量。结果 RNAi抑制组IRAK-4表达水平，以及LPS刺激后NFKB活性、肿瘤坏死因子α峰值均明显低于正常对照组和RNAi对照组，t值分别为22．50，4．18及958．49，P〈0．01；尤其是pSⅡRAK-4-A组，抑制效果明显优于pSⅡRAK-4-B，t值分别为12．60，3．36及256．39，P〈0．01。结论 以IRAK-4为靶点的shRNA能有效的阻断内毒素诱导的KCs激活效应。     

Effect of oxymatrine on the replication cycle of hepatitis B virus in vitro

AIM:To determine the antiviral mechanism or target of oxymatrine against hepatitis B virus(HBV).METHODS:HepG2.2.15 cells were incubated with culture medium containing 500 μg/mL of oxymatrine for 2 and 5 d.The surface antigen of HBV(HBsAg) and e antigen of HBV(HBeAg) in supernatant were determined by ELISA.HBV DNA in supernatant,and intracellular covalently closed circular DNA(cccDNA),relaxed circular DNA(rcDNA) and pregenomic RNA(pgRNA) were quantif ied by specif ic real-time polymerase chain reaction(PCR) ...     

乙型肝炎病毒在异种动物原代肝细胞中复制与表达的研究

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)DNA复制和表达的跨种属特异性。 方法 分离培养原代大鼠肝细胞(PRH)与原代鸭肝细胞(PDH),电转HBV线性裸DNA(转染组每1×107PRH或PDH 1.19×1012拷贝),分别于转染后1～15d各时点,收集PRH或PDH培养上清液与细胞裂解液,分别以Southern杂交分析和斑点杂交法分析HBV DNA的复制中间体与复制型式;以全自动免疫荧光检测系统检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg),以western免疫印迹、免疫斑点印迹和免疫细胞化学法检测乙型肝炎核心抗原(HBcAg);用逆转录聚合酶链反应检测HBV S/X mRNA。以单纯电击PRH/PDH为对照组。 结果 Southern杂交分析显示:PRH/PDH转染组HBV DNA均为游离复制型,可见4.0 kb以下分子区带,包括松弛环状DNA、共价闭环形DNA和单链线形DNA等复制中间体;未见整合型HBVDNA-高分子(4.0～24.0 kb)区带。HBV DNA在PRH中表达蛋白产物水平,HBsAg于转染后各时点PRH裂解液中均可检测到(P/N值2.17～93.41,平均值为14.74±31.82,阳性≥2.1),峰值于1～3 d;仅转染后1d PRH培养上清液中检测到HBsAg,P/N值为6.66;HBcAg和HBeAg仅于转染后1～3 d时点内检测到低度表达;HBV S mRNA为阳性,而X mRNA为阴性。HBV DNA转染PDH组,转染后1、3、5 d各时点PDH裂解液中HBsAg分别为15.24、