中日产川芎的matK、ITS基因序列及其物种间的亲缘关系

目的分析中国产川芎Ligusticum chuanxiong Hort.及日本产川芎Cnidium officinale Makino的核基因组ITS和叶绿体基因组matK序列,为探讨中日产川芎物种间的亲缘关系提供分子依据.方法采用PCR直接测序技术测定川芎和日本川芎的ITS基因和matK基因核苷酸序列并作序列变异分析.结果川芎和日本川芎的matK序列长度均为1268 bp,编码422个氨基酸.ITS1-5.8S-ITS2序列长度均为699 bp,其中18S rRNA基因3′端序列54 bp,ITS1序列215 bp,5.8S rRNA基因序列162 bp,ITS2序列222 bp,26S rRNA基因5′端序列46 bp.根据排序比较,川芎原植物与其商品药材间的matK基因和ITS基因序列完全相同,而川芎与日本川芎间matK基因则仅有1个变异位点,即在上游959 nt处1个转换替代(T→C),反映在氨基酸序列则发生一个非同义取代V(GTG)→A(GCG);ITS基因也仅有1个变异位点,即在ITS1上游54 nt处1个转换替代(T→C).结论通过进化速率较快的基因序列同源性分析,基本可以认为中日所产川芎基原一致,日本川芎学名似应改为Ligusticum chuanxiong Hort..     

广藿香的基因序列与挥发油化学型的相关性分析

目的探讨“南药”广藿香Pogostemon cablin (Blanco) Benth.不同产地间的叶绿体和核基因组的基因型与挥发油化学型的关系，为广藿香道地性品质评价、规范化种植提供分子依据。方法用PCR直接测序技术对广藿香6个产地样本的叶绿体matK基因和核18S rRNA基因核苷酸序列进行测序分析研究。结果广藿香6个样本的matK基因序列长均为1 245 bp，编码415个氨基酸成熟酶。18S rRNA基因序列长为1 803～1 805 bp。根据排序比较，广藿香6个样本间的matK基因序列存在47个变异位点，18S rRNA基因存在17个变异位点，非加权组平均法构建的系统分支树表明广藿香基因序列分化与其产地、所含挥发油化学变异类型呈良好的相关性。结论结合挥发油分析数据，基因测序分析技术可作为广藿香道地性品质评价方法这一以及规范化种植过程关键技术“物种鉴定”的强有力工具。     

中日产川芎的matK、ITS基因序列及其物种间的亲缘关系

目的分析中国产川芎Ligusticum chuanxiong Hort.及日本产川芎Cnidium officinale Makino的核基因组ITS和叶绿体基因组matK序列,为探讨中日产川芎物种间的亲缘关系提供分子依据。方法采用PCR直接测序技术测定川芎和日本川芎的ITS基因和matK基因核苷酸序列并作序列变异分析。结果川芎和日本川芎的matK序列长度均为1268 bp,编码422个氨基酸。ITS1-5.8S-ITS2序列长度均为699 bp,其中18S rRNA基因3′端序列54 bp,ITS1序列215 bp,5.8S rRNA基因序列162 bp,ITS2序列222 bp,26S rRNA基因5′端序列46 bp。根据排序比较,川芎原植物与其商品药材间的matK基因和ITS基因序列完全相同,而川芎与日本川芎间matK基因则仅有1个变异位点,即在上游959 nt处1个转换替代(T→C),反映在氨基酸序列则发生一个非同义取代V(GTG)→A(GCG);ITS基因也仅有1个变异位点,即在ITS1上游54 nt处1个转换替代(T→C)。结论通过进化速率较快的基因序列同源性分析,基本可以认为中日所产川芎基原一致,日本川芎学名似应改为Ligusticum chuanxiong Hort.。     

鹿类中药材的位点特异性PCR鉴定研究

目的　建立一种简便、准确的鹿类中药材鹿茸、鹿鞭、鹿筋、鹿胎的DNA分子标记鉴定方法。方法　在对鹿类中药材的正品原动物梅花鹿、马鹿及其混伪品原动物的Cytb基因全序列分析的基础上 ,设计了一对专用于鉴定正品鹿类药材的位点特异性鉴别引物ILu0 1 L和ILu0 1 H。结果　在 6 4℃的复性温度下 ,用鉴别引物对原动物样品进行鉴别PCR ,仅正品能得到约 36 5bp阳性扩增带 ;对鹿茸、鹿鞭及鹿筋正、伪品药材进行PCR鉴定 ,结果表明 :3批鹿茸仅一批为正品 ,2批鹿鞭皆为伪品 ,鹿筋正、伪品药材PCR鉴定与形态鉴定结果一致。随机选取 2枚鹿茸及一个原动物做Cytb基因片段序列分析 ,其结果与PCR鉴定完全一致。结论　对市售鹿类商品药材需加强质量监督和管理。所设计的鉴别引物对梅花鹿、马鹿有高度特异性 ,可应用于以其为原动物的鹿类中药材的鉴定。     

金钱白花蛇及其伪品的DNA分子诊断鉴别

为建立金钱白花蛇品种的DNA分子标记鉴定方法,本文通过提取金钱白花蛇及其伪品药材和原动物样品的模板DNA,用通用引物扩增样品的Cyt b基因片断。PCR扩增所得产物纯化后直接测序,所得序列经对位排列和比较金钱白花蛇及其伪品的DNA序列,发现Cyt b基因片段的种间差异显著大于种内个体间变异,因此该基因片段是蛇类药材鉴定中一个很好的分子标记。基于所得DNA序列数据,设计了一对高度特异性的鉴别引物用于金钱白花蛇的PCR鉴定。用该对引物对金钱白花蛇进行PCR鉴定。在60℃－65℃的复性温度条件下,样品的误检和漏检率为0,能100％地正确区分出正品与伪品药材,此外该方法还能检测出混合粉末中是否含有正品金钱白花蛇成分。研究结果表明用本鉴定引物对金钱白花蛇的PCR鉴定方法简便、有效,实用性强,该方法还有可能成为中成药复方组分鉴别的一种新手段。     

鹿类中药材的位点特异性PCR鉴定研究

目的　建立一种简便、准确的鹿类中药材鹿茸、鹿鞭、鹿筋、鹿胎的DNA分子标记鉴定方法。方法　在对鹿类中药材的正品原动物梅花鹿、马鹿及其混伪品原动物的Cyt b 基因全序列分析的基础上,设计了一对专用于鉴定正品鹿类药材的位点特异性鉴别引物ILu01-L和ILu01-H。结果　在6 4℃的复性温度下,用鉴别引物对原动物样品进行鉴别PCR ,仅正品能得到约365bp阳性扩增带;对鹿茸、鹿鞭及鹿筋正、伪品药材进行PCR鉴定,结果表明:3批鹿茸仅一批为正品,2批鹿鞭皆为伪品,鹿筋正、伪品药材PCR鉴定与形态鉴定结果一致。随机选取2枚鹿茸及一个原动物做Cyt b 基因片段序列分析,其结果与PCR鉴定完全一致。结论　对市售鹿类商品药材需加强质量监督和管理。所设计的鉴别引物对梅花鹿、马鹿有高度特异性,可应用于以其为原动物的鹿类中药材的鉴定。     

基于ITS序列分析技术鉴定川牛膝与常见伪品麻牛膝

目的:比较川牛膝与其常见伪品麻牛膝之间的ITS序列差异及规律。为川牛膝与麻牛膝的DNA条形码鉴别提供适合的分子标记。方法:收集川牛膝及麻牛膝成品药材并提取纯化其基因组DNA,经PCR扩增得到ITS序列(包括ITS1、5.8S nrDNA、ITS2)并进行T-A克隆后测序,分析两者序列差异。结果:PCR扩增获得两者ITS序列,经多序列对比分析得出川牛膝与伪品麻牛膝的ITS序列存在明显差异。结论:ITS序列分析可以用作鉴定川牛膝与麻牛膝药材。     

重组人酸性成纤维细胞生长因子C-末端测序

目的：应用蛋白质N-末端序列分析仪测定重组人酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）C-末端氨基酸序列。方法：应用多肽分析软件选择合适的蛋白内切酶完全酶切aFGF，酶切后用RP—HPLC进行分离，收集软件预测C-末端肽段保留时间处的肽段峰，用蛋白质N-末端序列分析仪直接测得该肽段氨基酸全序列。结果：实测肽图图谱与软件预测理论图谱一致，所得到的肽段为aFGF C-末端肽段，经测序其结果与理论序列完全一致。结论：通过选择合适的蛋白内切酶，可运用RP—HPLC和蛋白质N-末端序列分析仪测定基因工程产品C-末端氨基酸序列。     

25份燕窝样品的线粒体细胞色素氧化酶I基因序列分析

目的 对多种燕窝进行DNA条形码鉴别，为确定燕窝的基原提供分子依据。方法 对25份燕窝样品的细胞色素氧化酶I（mitochondria cytochrome oxidase subunit I gene，COI）条形码序列进行PCR扩增和测序，分析燕窝正品来源的种内变异，与混伪品的种间变异，以及序列相似性和进化树研究，用Taxon DNA软件评估"Barcoding Gap"。结果 金丝燕种内COI序列变异小，种间存在较多的变异位点，种间的遗传距离显著大于种内的遗传距离。通过构建的系统聚类树图可以看出，燕窝不同来源个体均聚在一起，能够与其混伪品区分开。结论 基于COI序列的DNA条形码技术可以用于鉴定燕窝的正品来源及其混伪品。     

基于DNA条形码和特异性PCR技术鉴别蚂蟥及其常见伪品

目的：建立蚂蟥特异性PCR鉴别方法,能够快速准确地鉴别蚂蟥与其常见伪品。方法：通过分析蚂蟥与其常见伪品的细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ）序列,寻找蚂蟥SNP变异位点,设计特异性引物;通过对退火温度、循环次数、DNA模板量及Taq酶等关键因素的考察,确立最优反应体系及条件,并将特异性PCR方法应用到水蛭（蚂蟥）粉末中进行药材粉末的基原鉴别,同时为保证试验结果的准确性,将PCR扩增产物进行一代测序。结果：特异性PCR结果表明蚂蟥在400～600 bp有单一明亮条带,常见混伪品则无此条带,试验结果与一代测序结果一致,为蚂蟥。结论：该方法能够将蚂蟥与其常见伪品菲牛蛭、东北小水蛭、黑条、小黑条等区别,且能鉴别水蛭（蚂蟥）粉的基原,为提升中药监管力度,打击中药掺伪行为提供了强有力的技术支持。     

人再生肝脏蛋白磷酸酶-3基因的克隆与测序

目的:从人结肠癌肝转移病灶标本中提取染色体RNA,PCR扩增及克隆人PRL-3基因.方法:收集人结肠癌肝转移标本,提取总RNA,逆转录为cDNA,PCR扩增PRL-3序列,A-T克隆于pMD-18T载体中,转化大肠杆菌JM109株,提取质粒,对重组质粒进行酶切与测序鉴定.结果:通过酶切、PCR与测序三种方法证实所获得的基因片断为PRL-3基因.结论:克隆到序列正确的人源性PRL-3基因,为实现PRL-3基因的高效表达及制备相应抗体奠定了基础.     

花椒及其混淆品的rDNA ITS区序列分析与鉴别

目的研究不同居群的花椒及其混淆品的rDNA ITS区碱基序列的特征及其差异，为花椒的鉴别提供可靠的分子标记。方法运用PCR产物直接测序和克隆测序法对甘肃、陕西、四川、河北等7个花椒居群及3个混淆种的rDNA ITS区(包括ITS1，5.8S，ITS2)碱基序列进行序列测定。结果首次报道花椒ITS区的碱基序列，序列总长度为619-620 bp，长度变异较少，与混淆种长度仅相差4 bp。花椒各居群中，rDNA ITS区碱基序列有15个变异位点、12个信息位点、3个特异性识别位点。与混淆品间的碱基差异则较为显著，多达71个变异位点，有4个花椒特异性识别位点。结论依据花椒ITS区的序列特征可准确鉴别各居群的花椒及其混淆品；亲缘关系密切的花椒居群在地理位置上也非常靠近；rDNA ITS序列特征可作为花椒种内和种间鉴别的有效分子标记。     

人再生肝脏蛋白磷酸酶-3基因的克隆与测序

目的:从人结肠癌肝转移病灶标本中提取染色体RNA,PCR扩增及克隆人PRL-3基因.方法:收集人结肠癌肝转移标本,提取总RNA,逆转录为cDNA,PCR扩增PRL-3序列,A-T克隆于pMD-18T载体中,转化大肠杆菌JM109株,提取质粒,对重组质粒进行酶切与测序鉴定.结果:通过酶切、PCR与测序三种方法证实所获得的基因片断为PRL-3基因.结论:克隆到序列正确的人源性PRL-3基因,为实现PRL-3基因的高效表达及制备相应抗体奠定了基础.     

细茎石斛叶绿体全基因组序列特征及系统发育分析

细茎石斛是药用石斛的重要来源,也是正品枫斗的主要来源之一。本研究利用Illumina高通量测序技术对细茎石斛叶绿体全基因组进行测序,完成了其物理图谱绘制和基因组结构特征解析,并与近缘物种进行了比较和系统发育分析。细茎石斛叶绿体基因组全长为150 754 bp,两个反向互补重复区(IRs)长25 906 bp,大单拷贝区(LSC)和小单拷贝区(SSC)长度分别为84 818 bp和14 124 bp。共注释到123个基因,包括77个蛋白编码基因、38个tRNA基因和8个rRNA基因,其中17个基因含有内含子。生物信息学分析获得53个SSR位点,大多数位点具有A-T碱基偏好性。采用33条石斛属植物的叶绿体基因组序列构建系统发育树,结果显示细茎石斛复合种中的物种聚在同一个大支,说明其亲缘关系较近。本研究为细茎石斛的鉴定、细茎石斛复合种系统发育关系及其本草基因组学研究提供理论基础。     

覆盆子及其近缘混淆品的PCR-RFLP鉴别研究

目的 建立一种覆盆子特异性的分子鉴别方法。方法 通过对覆盆子及其混淆品的ITS序列进行测序分析,根据差异位点设计限制性内切酶,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法(polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)进行鉴别,建立并优化PCR鉴别方法,并对其稳定性和适用性进行考察与验证。结果 设计的引物可实现对覆盆子及其混淆品序列的扩增,扩增产物为800 bp大小的条带,通过对限制性内切酶MboI进行酶切后的片段长度进行分析,仅覆盆子的序列可被酶切形成2个片段,而混淆品的序列不能被切开,从而特异性鉴别是否为覆盆子。结论 本实验建立的PCR-RFLP方法可用于鉴别覆盆子。     

中国钩端螺旋体疫苗生产用菌种罗株分子遗传特性分析

目的:分析研究中国钩端螺旋体疫苗生产用菌种罗株的分子遗传特性,为钩体疫苗生产用菌种分子遗传质量控制方法的研究奠定基础。方法:通过对罗株16S rRNA基因片段进行PCR扩增、测序,并运用脉冲场凝胶电泳(PFGE)和多位点序列分析(MLST)等方法,对其进行分子分型。结果:16S rRNA基因序列比对结果显示钩体疫苗生产用菌种罗株基因种为致病性问号型;PFGE分析结果表明该疫苗株全基因组在酶切后共有100~1 000 kb大小不等的片段11个,与我国其他不同血清群代表株酶切片段的数量、大小和分布特征方面明显不同;多位点序列分析得出该罗株序列型为140。结论:本文对钩体疫苗生产用菌种罗株的分子遗传信息分析结果,可为后续的钩体疫苗生产用菌种分子遗传质量控制方法的研究提供参考。     

艾叶及其常见混伪品的分子鉴定

目的：对艾叶及其几种常见混伪品进行分子鉴定。方法：通过聚合酶链式反应（PCR）法直接测序,对艾及其8种混伪品进行核糖体DNA内转录间隔区片段2（ITS2）扩增并双向测序,所得序列经CodonCodeAligner拼接后,用系统发育软件MEGA4．0进行相关数据分析,同时利用邻接（NJ）法构建系统聚类树。结果：艾叶基原植物艾ITS2序列长度为225bp,种内平均Kimura．双参数（K2P）遗传距离（0．000）小于其与混伪品的种间平均K2P遗传距离（0．022）;由所构建的系统聚类树图可以看出,艾具有单系性,同时又与其他混伪品明显分开。结论：ITS2序列作为DNA条形码可以方便快捷地鉴别中药材艾叶及其混伪品,可为其质量评价及临床安全用药提供重要的分子鉴别依据。     

紫苏属药用植物的rDNA ITS区SNP分子标记与位点特异性PCR鉴别

目的分析单种属——紫苏属各变种间rDNA ITS区的序列以及存在的单核苷酸多态性(SNP)现象，设计出位点特异性PCR引物，用于紫苏属各变种间的分子标记鉴别。方法对紫苏属各变种多个体的rDNA ITS区全序列进行了准确测定，运用Clustral X 1.8，MEGA 3.0进行排序并进行SNP分析，从而设计出鉴别各变种的等位基因位点特异性PCR鉴别引物。结果紫苏属各变种(紫苏、白苏、鸡冠苏和耳齿紫苏等)的rDNA ITS区全序列共有615～618 bp的长度，ITS1为233～235 bp，5.8S为179 bp，ITS2为203～204 bp，GC含量为61.5%～61.9%。从rDNA ITS区碱基变异的整体情况来看，紫苏属各变种间不仅在非编码的转录间隔区ITS1和ITS2内存在非编码区单核苷酸多态性(ncSNP)，而且在保守的5.8S编码区内也存在3个位点的单核苷酸多态性，即编码区SNP(cSNP)，所有的SNP均只具2等位多态性。5.8S区cSNP的出现与产生该变异的变种出现的显著形态差异关联。本文还利用这些SNP位点设计出了鉴别紫苏属各变种的位点特异性PCR引物，无需测序即可对紫苏属的原植物及“苏子”、“苏叶”等药材进行有效准确的分子鉴别。结论紫苏属药用植物rDNA ITS区存在的SNP可用作紫苏属各变种鉴别的分子标记。     

hMSH2基因cDNA保守区域的T载体克隆及序列分析

目的：构建含限制性内切酶位点PstⅠ、KpnⅠ的hMSH2基因cDNA保守区域的pGEM-T-S载体,比较分析序列的变化,为以后的毒理学研究提供实验材料,方法：从人胚肺成纤维细胞HLF中抽提总RNA进行RT－PCR扩增,直接与T载体连接转化大肠杆蓖DH5α,用蓝／白斑试验筛选阳性克隆,抽提质粒进行酶切鉴定,再行序列分析。结果：经RT－PCR获得631bp含量制性内切酶位点的阳性产物,T载体克隆、酶切鉴定及序列分析后证实,克隆片段与genbank中该基因的序列同源性为99．5％。结论本文成功地构建了含hMSH2基因cDNA保守区域的T载体克隆,该克隆可为DNA错配修复缺陷与致癌关系研究提供工具。     

基于COⅠ与16S rRNA基因对广地龙的DNA分子鉴定研究

目的:建立一种快速、准确和标准化的广地龙DNA分子标记鉴别方法。方法:测定了5个不同居群广地龙的线粒体细胞色素酶亚单位(CO)Ⅰ和16S rRNA基因序列,采用CodonCode Aligner进行序列拼接,通过下载GenBank地龙原动物的COⅠ与16S rRNA序列,采用MEGA4.1计算广地龙及其伪品地龙的种内、种间的K2P遗传距离,并基于K2P模型构建NJ和MP树。结果:COⅠ变异位点、信息位点均高于16SrRNA,COⅠ基因无插入和缺失,16S rRNA存在4个插入和缺失。COⅠ和16S rRNA序列种间遗传距离均明显大于种内,COⅠ和16S rRNA基因均能将广地龙从其他地龙或蚯蚓物种鉴别开来。结论:获得的广地龙COⅠ和16S rRNA序列可为动物性中药材地龙的分子水平鉴定提供参考,为动物性中药材DNA条形码数据库积累了相关信息数据。