超抗原分子SEA在肝癌细胞的表达和HLA-Ⅰ分子递呈

目的　将超抗原葡萄球菌肠毒素A(staphylococcalenterotoxinA ,SEA)分子转入肝癌细胞以增强其免疫原性 ,开辟肝癌免疫排斥的新途径。方法　从产SEA标准菌株中获得SEA基因全长片段 ,构建SEA逆转录真核表达载体 ,通过病毒包装和滴度测定 ,最后转导肝癌细胞 ,并进行T细胞杀伤实验 ,同时利用抗体阻断的方法研究递呈途径。结果　成功的获得了表达SEA人肝癌细胞株HHCSEA。结果显示微量表达的SEA蛋白即可引发高效的免疫活性。将细胞表面的HLA I分子利用抗体阻断后 ,杀伤活性明显降低。结论　肝癌细胞表达的SEA分子具有较高的免疫激活能力 ,且有可能主要通过HLA Ⅰ分子递呈。     

超抗原分子SEA在肝癌细胞的表达和HLA—I分子递呈

目的 将超抗原葡萄球菌肠毒素A（staphylococcal enterotoxinA,SEA)分子转入肝癌细胞以增强其免疫原性,开辟肝癌免疫排斥的新途径。方法 从产SEA标准菌株中获得SEA基因全长片段,构建SEA逆转录真核表达载体。通过病毒包装和滴度测定。最后转导肝癌细胞,并进行T细胞杀伤实验,同时利用抗体阻断的方法研究递呈途径。结果 成功的获得了表达SEA人肝癌细胞株HHCSEA。结果显示微量表达的SEA蛋白即可引发高效的免疫活性,将细胞表面的HLA-I分子利用抗体阻断后,杀伤活性明显降低。结论 肝癌细胞表达的SEA分子具有较高的免疫激活能力。且有可能主要通过HLA-I分子递呈。     

NK细胞杀伤人骨髓瘤RPMI8226细胞的活性及其可能的机制

目的:研究同种异体NK细胞对人骨髓瘤RPMI 8226细胞的杀伤活性及其可能的机制。方法:LDH释放法检测NK细胞对RPMI 8226细胞和人白血病K562细胞的杀伤活性,流式细胞术和RT-PCR法分别检测K562和RPMI 8226细胞中NKG2D配体和HLA-Ⅰ类分子的表达;阻断K562和RPMI 8226细胞中NKG2D配体的表达后,检测NK细胞的杀伤活性。结果:NK细胞对RPMI 8226靶细胞的杀伤活性明显低于对K562靶细胞的杀伤(P<0.01)。K562细胞高表达NKG2D配体,不表达HLA-Ⅰ类分子;RPMI 8226细胞低表达NKG2D配体,高表达HLA-Ⅰ类分子,其HLA基因型为A 01,66;B 58,58;Cw 03,06。阻断NKG2D配体后NK细胞杀伤K562细胞的活性明显降低(P<0.01),而杀伤RPMI 8226细胞的活性无明显改变;阻断HLA-Ⅰ类分子,NK细胞杀伤K562细胞的活性无变化,而杀伤RPMI 8226细胞的活性明显提高(P<0.01)。结论:NK细胞杀伤RPMI 8226细胞的活性较低,其机制与RPMI 8226细胞高表达HLA-Ⅰ类分子、低表达NKG2D配体有关。     

骨髓瘤RPMI 8226细胞体外逃逸NK细胞免疫杀伤机制的初步研究

目的:探讨骨髓瘤细胞RPMI 8266逃逸NK细胞免疫杀伤的机制。方法:流式细胞仪检测K562和8266细胞表面MICA/B、ULBP1～3和HLA-Ⅰ类分子的表达。4hLDH释放法测定效靶比20∶1时阻断前后NK细胞对2种细胞杀伤活性变化。观察效靶比20∶1时NK细胞对药物处理后RPMI 8226细胞杀伤活性变化、RPMI 8226细胞表面NKG2D配体和HLA-Ⅰ类分子的表达及NK细胞对RPMI 8266细胞的克隆形成率的影响。结果:K562细胞高表达MICA/B和ULBP 1～3分子;RPMI 8266细胞表达HLA-Ⅰ类分子,2株细胞NKG2D配体表达差异有统计学意义,P<0.001。单抗分别阻断MICA/B、ULBP 1～3分子后,效靶比为20∶1时NK细胞对K562细胞的杀伤活性明显降低,P值均<0.05;对RPMI 8266细胞的杀伤活性基本无变化,P值均>0.05。抗W6/32单抗封闭8266细胞表面HLA-Ⅰ类分子后,NK细胞对K562细胞的杀伤活性无上升(P=0.721),而对RPMI 8266细胞的杀伤活性上升,P=0.000。1/2IC50的三氧化二砷处理后RPMI8226细胞ULBP...     

树突状细胞改变以及HLA-Ⅱ类分子表达在肠癌中意义

目的 研究肠癌组织中专职抗原递呈细胞树突状细胞数量以及兼职抗原递呈细胞肠癌组织中HLA-Ⅱ类分子表达强度改变,揭示肠癌组织中的抗原递呈功能改变,为肠癌免疫治疗提供理论依据.方法 用免疫组化的方法标记肠癌组织中的树突状细胞、HLA-Ⅱ类分子,以切端组织形态正常的黏膜组织(距离癌组织5 cm)作为对照,结合临床资料分析肠癌组织中的树突状细胞数量改变以及HLA-Ⅱ类分子表达情况.结果 相对于切端黏膜,肠癌组织中HLA-Ⅱ类分子表达下调,差异有统计学意义(P<0.05),树突状细胞数量减少,差异有统计学意义(P<0.05).肠癌组织HLA-Ⅱ类分子表达在肠癌不同分级、分期差异无统计学意义(P>0.05).树突状细胞的数量在肠癌不同分级、分期差异无统计学意义(P>0.05).结论 肠癌组织中HLA-Ⅱ类分子表达显著下降,树突状细胞数量显著减少,导致肠癌组织中的肿瘤抗原递呈功能下降,是肠癌组织逃避机体免疫监视的重要途径.     

肝癌细胞CD80表达与MHC-Ⅰ分子的关系

目的：研究共刺激分子CD80在肝癌细胞中的表达与MHC－I（Majorhistocompatibilitycomplex）分子相互关系,以探讨在肿瘤细胞所诱发的免疫排斥反应中共刺激分子对抗原提呈机制的影响。方法：通过逆转录病毒载体介导,将CD80基因转入肝癌细胞系HHCC,以流式细胞仪检测其表面MHC－I分子的表达情况。同时检测LAK细胞对转染前后的细胞的杀伤效果。结果：表达CD80的肝癌细胞其表面MHC－I分子表达明显增高（P＜0.01）,而γ－INF刺激对细胞表面MHG-I分子的表达情况并无影响（P＞0.05）。LAK细胞对转染后细胞的杀伤作用远远大于未转染组（P＜0．01）,而γ-INF刺激前后的细胞毒活性几乎无改变（P＞0．05）。结论：转染CD80后肝癌细胞高表达MHC-I分子,增强抗原提呈作用的同时又表达第二信号—共刺激分子CD80,从而可诱发更强的免疫排斥反应。     

HLA-Ⅱ类抗原与妇科恶性肿瘤的研究进展

HLA-Ⅱ类抗原主要表达于专职抗原递呈细胞表面,其生物学作用是将外源性抗原肽递呈给CD4 T细胞从而参与机体的免疫应答过程.HLA-Ⅱ类抗原的等位基因具有多态性从而导致其分子的抗原决定簇不同,可能与肿瘤的遗传易感性相关.HLA-II类抗原在恶性肿瘤组织中的异常表达,与肿瘤细胞逃避免疫监视形成肿瘤转移浸润相关.本文就HLA-Ⅱ抗原在妇科恶性肿瘤方面的研究作一综述.     

5-脱氧杂氮胞苷对肝癌细胞分泌exosomes及其免疫相关分子的影响

目的 探讨5-脱氧杂氮胞苷(5-Aza-Cda)对肝癌细胞分泌exosomes及其负载的肿瘤相关抗原和免疫相关分子含量的影响.方法 采用离心超滤联合蔗糖密度梯度离心方法,分离和纯化经5-Aza-CdR处理和未处理的HepG2和Hep3B肝癌细胞释放的exosomes,并对exosomes进行计数和蛋白定量测定.采用免疫电镜和Western blot技术,观察exosomes表达HSP70、HLA-Ⅰ和NY-ESO-1蛋白的变化;以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测5-Aza-CdR处理前后HepG2和Hep3B细胞野生型p53基因mRNA的表达.结果 经5-Aza-CdR处理后,HepG2和Hep3B细胞p53基因mRNA表达较未处理组均明显增加,exosomes数量和蛋白含量均较未处理组显著增加(P<0.05).经免疫电镜和Western blot鉴定,exosomes上均附载有HSP70、HLA-Ⅰ和NY-ESO-1蛋白,且两种细胞来源的exosomes经5-Aza-CdR处理后,HSP70、HLA-Ⅰ和NY-ESO-1蛋白含量均明显增加.结论 DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR可使肝癌细胞分泌更多数量的exosomes,增加exosomes中的免疫相关分子含量,其机制可能与p53基因上调和DNA去甲基化有关.     

反义IGF-I基因对人7402肝癌细胞肿瘤免疫原性影响的研究

本研究利用基因治疗方法中的反义技术,通过脂质体包裹反义胰岛素样生长因子-I(IGF-I)基因导入人7402肝癌细胞株,研究肿瘤细胞表面MHC分子的表达和其对LAK细胞杀伤的敏感性。结果表明,反义IGF-I基因转染的人7402肝癌细胞,经潮霉素筛选后,Northern Blot分析显示反义IGF-I RNA表达阳性,MHC Ⅰ类和Ⅱ类抗原的表达水平高于亲本7402细胞。LAK细胞对反义IGF-I基因转染的人7402肝癌细胞的杀伤活性明显高于亲本7402细胞组(P<0.05)。说明反义IGF-I基因转移至该肝癌细胞,可提高肿瘤的MHC Ⅰ类和Ⅱ类分子的表达,显示肿瘤细胞的免疫原性增强,并可提高LAK细胞对其杀伤的敏感性。     

大肠癌与人类白细胞抗原表达

大肠癌在欧美国家发病率很高，在我国是十大常见恶性肿瘤之一，许多资料表明我国大肠癌发病率有逐年增高的趋势。人类白细胞抗原(human leucocyte antigen)是细胞表面标志之一，参与抗原递呈和T细胞激活的关键分子，在免疫应答和免疫调节中具有重要的作用。越来越多的资料表明肿瘤细胞表面的HLA-Ⅰ类抗原分子表达下降而HLA-Ⅱ类抗原表达上升。但是不同类型的肿瘤其HLA表达的情况和机制并不相同。     

肝癌细胞CD80表达与MHC-I分子的关系

研究共刺激分子ＣＤ８０在肝癌细胞中的表达与ＭＨＣ－１（Ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）分子相互关系，，以探讨在肿瘤细胞所诱发的免疫排以应中共刺分子对抗的提呈机制的影响。方法：通过逆转录病毒载体介导，将ＣＤ８０基因转入肝癌细胞系ＨＨＣＣ，以流式细胞仪检测其表面ＭＨＣ－Ｉ分子的表达情况。同时检测ＬＡＫ细胞转染前后的细胞的杀伤效果。结果：表达ＣＤ８０的肝癌细胞基表达ＭＨ     

制备抗原肽所用宫颈癌细胞培养方法的建立及HLA表达的检测

目的 探讨制备抗原肽所用宫颈癌细胞的培养方法及检测其HLA的表达。方法 先利用CO2孵箱和普通培养瓶进行培养，测定其生长状况，然后流式细胞仪检测HLA-Ⅰ、Ⅱ类分子的表达，再用免疫荧光法检测不同浓度IFN-γ对Hela细胞HLA-Ⅰ、Ⅱ类分子的表达和IFN-γ对不同培养时间Hela细胞HLA分子的表达。结果 IFN-γ能够明显提高对数生长期的Hela细胞HLA-Ⅰ类分子的表达，而IFN-γ刺激前后Hela细胞HLA-Ⅱ类分子的表达均为阴性。结论 本方法可缩短细胞培养时间，利用IFN-γ诱导细胞提高HLA-Ⅰ类分子的表达，为提供制备抗原肽所用宫颈癌细胞奠定了基础。     

冷冻影响肝癌细胞HLA和B7分子表达的实验研究

目的：探讨冷冻治疗后机体免疫功能提高的机制。方法：应用流式细胞仪检测人肝癌细胞经0℃或－20℃冷冻后，HLA和B7分子表达率和平均荧光强度的变化。结果：0℃组与对照组比较，HLA－Ⅰ分子和B7－2分子的表达率和平均荧光强度均无明显变化；HLA－Ⅱ分子和B7－1分子的表达率增高，平均荧光强度增强。－20℃组与对照组比较，HLA－Ⅰ、HLA-Ⅱ、B7-1和B7－2分子的表达率均增高，平均荧光强度均增强。－20℃组和0℃组比较，HLA－Ⅱ和B7－1分子的表达率和平均荧光强度均无显著性差异；HLA－Ⅰ和B7－2分子表达率均增高，平均荧光强度均增强。结论：0℃和－20℃冷冻可增强人肝癌细胞HLA和B7分子的表达，这可能是冷冻治疗提高机体免疫功能的机制之一。     

顺铂对鼻咽癌细胞NKG2D配体表达和NK细胞杀伤活性的增强作用

 目的 研究顺铂(Cisplatin, DDP)作用前后人鼻咽癌细胞CNE2 NKG2D配体和HLA-Ⅰ类分子表达的改变及NK细胞杀伤活性的变化。 方法 MTT法测定DDP对CNE2细胞的50%抑制量（IC₅₀）;以此浓度DDP作用CNE2细胞24h,乳酸脱氢酶释放法检测效靶比20∶1时,NK细胞对DDP作用前后的CNE2细胞的杀伤活性;流式细胞仪检测DDP作用前后的CNE2细胞表面NKG2D配体(MICA/B、ULBP1、ULBP2、 ULBP3)和HLA-Ⅰ类分子表达的变化。 结果 DDP对CNE2细胞的IC₅₀为5mg/L。效靶比20∶1时,NK细胞对5mg/L DDP作用前后的CNE2细胞的杀伤活性分别为 （38.11±1.41）%,（47.71±1.53）%,差异有统计学意义（P＜0.05）,DDP作用后CNE2细胞表面MICA/B、ULBP1、 ULBP3表达显著升高,与作用前相比差异有统计学意义（P＜0.05）。ULBP2、HLA-Ⅰ类分子无明显变化(P＞0.05)。 结论 DDP能提高CNE2细胞NKG2D配体(MICA/B、ULBP1、ULBP3)的表达,从而增强CNE2细胞对NK细胞杀伤的敏感度。     

热休克蛋白在递呈肿瘤抗原多肽中的作用

化学致癌剂诱发的肿瘤特异性移植抗原(TSTA)与热休克蛋白(HSP)相关联。HSP本身不是TSTA,而是作为抗原递呈分子或抗原递呈辅助分子把TSTA递呈给T杀伤细胞(CTL)。HSP能广泛地与胞浆内多肽结合并表达在瘤细胞表面,直接激活γ/δ~ CD8~ 细胞,也能把多肽转运给经典MHC I(MHC Ia)类分子和类似I类(MHC Ib)分子,后两者分别激活α/β和γ/δ~ CD8~ T细胞,并使这两种CTL细胞发挥抗肿瘤效应。由于HSP在结合和递呈抗原时,不受MHC分子的限定性,因此用HSP-肿瘤多肽复合物作瘤苗,要比HLA-多肽瘤苗有更大应用价值。     

超抗原SEA增强PMLRARalpha多肽体外诱导特异性CTL杀伤活性的机制

 目的探讨超抗原SEA体外增强PML-RARα多肽诱导特异性CTL杀伤活性的机制。方法分别将SEA、PML-RARα多肽以及SEA联合PML-RARα多肽与正常人外周血单个核细胞共同培养,利用CCK-8比色法检测诱导后T细胞对NB4和K562细胞株杀伤活性,同时利用流式细胞术测定诱导T细胞表面CD4与CD8表达情况。结果诱导后第20天,SEA能明显增强PML-RARα多肽特异性杀伤NB4细胞株的作用。诱导后第5、10、20天动态检测表明,多肽及SEA联合多肽组CD4⁺/CD8⁺比值逐渐降低,其中SEA联合PML-RARα多肽诱导组降低最显著。结论超抗原SEA能明显增强PML-RARα多肽体外诱导特异性CD8+T细胞的增殖与特异性的杀伤作用。     

肿瘤生物治疗的新模式:分子靶向-过继性细胞免疫治疗

分子靶向－过继性细胞免疫治疗是分子靶向药物和过继性细胞免疫疗法有机结合的新治疗模式,该模式建立在NK细胞活化性信号通路(NKG2DNKG2DLs) 的生物学特性,尤其是受配体可调控性的理论基础之上。分子靶向药物在其中扮演双重角色,除了药物本身对肿瘤细胞的毒性作用外,还作为“刺激诱导”源,诱导肿瘤细胞表达免疫激活物NKG2DLs（natural killer group 2 member D ligands）,与NK细胞表面NKG2D（natural killer group 2 member D）结合,激活NK细胞的杀伤活性。NKG2D与NKG2DLs是NK细胞主要的活化性受、配体,在机体抗肿瘤免疫中起重要作用。NKG2D主要表达于NK、CD8+T、γδT和活化的巨噬细胞,参与适应性及固有性免疫应答。与NKG2D结合的配体(NKG2DLs)广泛低表达于多种肿瘤细胞,而在正常组织细胞几乎未见表达,靶细胞的NKG2DLs表达水平直接关系到免疫效应细胞（NK、DC、CTL细胞等）对其的杀伤活性。NKG2DLs的转录与表达可受多种因素影响,分子靶向药物可以诱导肿瘤细胞高表达NKG2DLs,NK细胞对高表达NKG2DLs的肿瘤细胞有较高杀伤活性,而对正常组织无杀伤作用,具有杀伤靶向性;NKG2DLs的高表达也增强了肿瘤细胞对其他免疫效应细胞的杀伤敏感性,具有良好的应用前景。分子靶向药物联合过继性细胞免疫治疗将使肿瘤患者获得更好的临床疗效,预示了肿瘤生物治疗新的发展方向——分子靶向-过继性细胞免疫治疗新模式的来临。     

MHCI类样分子(MICA)在部分肿瘤组织和肿瘤细胞系中的表达及临床意义

目的:探讨MHC Ⅰ类样分子(MICA)在肿瘤组织和肿瘤细胞系中的表达及其临床意义.方法:分别采用半定量RT-PCR和免疫组织化学技术检测肿瘤组织和肿瘤细胞系MICA表达,MTT法测定NK细胞细胞毒活性.结果:人红白血病细胞K562、喉癌细胞系Hep2、宫颈癌细胞系Hela、肝癌细胞系HepG2和结直肠癌细胞系HT29均有MICA mRNA和蛋白表达,而人Burkitt淋巴瘤Raji和高转移肺癌PG不表达MICA.MICA表达阳性的肿瘤细胞对NK杀伤敏感性明显高于MICA阴性者.多数肿瘤组织存在MICA mRNA和蛋白表达,但并非在所有肿瘤均有表达,癌旁组织均无MICA表达.结论:肿瘤细胞表达MICA可激发NK细胞对肿瘤的杀伤,NKG2D及其配体的相互作用在肿瘤免疫监视中起着非常重要的作用,肿瘤细胞分泌sMICA分子为肿瘤发生免疫逃逸的机制之一.     

联合B7-1分子、IL-2及LAK细胞治疗肝癌的实验研究

目的：研究共刺激信号在肿瘤免疫中的作用。方法：构建含人B7-1基因的真核表达载体PRCCMV-B7-1，脂质体介导DNA转移法将人B7-1基因转入人肝癌细胞株SMMC7721，建立新的细胞株SMMC-B7-1，PCR及逆转录PCR（RT-PCR），流式细胞仪检测，四唑卤（MTT）比色试验体外检测白细胞介素-2（IL-2）激活的LAK细胞（LAK-C），对两种肝癌细胞的杀伤活性，结果：PCR，RT-PCR法证实SMMC-B7-1细胞稳定表达B7基因，LAK细胞对SMMC-B7-1细胞的杀伤活性明显高于SMMC7721，结果有统计学意义。结论：B7基因可以体外转染人肝癌细胞，并表达有活性的B7分子，明显增强IL-2激活的LAK细胞的肿瘤杀伤作用。为进一步开展临床应用奠定基础。     

人类ARL-1重组蛋白特异性抗体的制备及鉴定

目的　制备ARL -1重组蛋白及其特异性抗体。方法　利用基因重组技术构建PQE -ARL -1原核表达载体 ,在M15大肠杆菌中进行表达 ,制备ARL -1重组蛋白 ,再将此蛋白免疫健康新西兰兔 ,制备ARL -1特异性抗体。结果　ARL -1在大肠杆菌中获得高效表达 ,经Ni -NTA (次氮基三乙酸 )琼脂柱纯化 ,获得纯蛋白 ,将此蛋白免疫健康新西兰兔 ,制备出抗人ARL-1特异性抗体 ,经环状沉淀试验及双琼脂扩散试验检测出抗体效价达 1∶2 0 0 0 0。结论　人类ARL -1重组蛋白及其特异性抗体的制备 ,为进一步研究ARL -1在肝癌早期诊断中的作用 ,并且探讨用此抗体携带放射性同位素或抗肿瘤药物对于肝癌细胞进行定向性杀伤提供了可能性