重组人canstatin表达产物的抗肿瘤活性鉴定

 目的　正确构建人canstatin原核表达载体 ,诱导表达重组人canstatin融合蛋白 ,并对其活性鉴定。方法　将人canstatincDNA亚克隆入 pQE30 ,构建重组质粒 pQE30 canstatin ;转化M 15 [pREP4] 中 ,IPTG诱导表达 ,纯化回收表达产物 ,复性后用Lewis肺癌移植瘤模型对其活性鉴定。结果　成功构建人canstatincDNA表达载体 ,纯化回收 ,获得高纯度canstatin重组蛋白。纯化产物在体内能抑制Lewis肺癌移植瘤血管的生成 ,从而抑制肿瘤生长和转移 ,抑瘤率 (% )为 6 0 .0 % ,转移抑制率 (% )为 74 .3%。结论　 (1)成功构建了原核表达载体 pQE30 canstatin。 (2 )重组人canstatin融合蛋白在原核表达系统中高水平表达 ,并获得高纯度canstatin重组蛋白。 (3)重组canstatin融合蛋白可抑制Lewis肺癌移植瘤血管的生成 ,从而抑制肿瘤生长和转移活性。     

人canstatin基因治疗人食管癌裸鼠移植瘤的实验研究

背景与目的：Canstatin是一种新内源性血管生成抑制剂,以往的研究显示canstatin能有效的抑制肿瘤的生长,作用甚至强于endostatin。本研究将探讨人canstatin基因对人食管鳞状细胞癌移植瘤模型的抑制作用。方法：应用人食管癌细胞株KYSE150建立移植瘤模型。将裸鼠随机分成3组：腺病毒携带的canstatin基因组（Ad—GFP—canstatin）、腺病毒携带的绿色荧光蛋白组（Ad—GFP）和磷酸盐缓冲液组（PBS）。治疗期间测量皮下移植瘤的长径和短径;30d后处死裸鼠,取下肿瘤行常规病理切片,观察药物的毒性反应;检测肿瘤组织中caspase-3、内皮细胞生长因子受体1（fetal liver kinase-1,Flk-1）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的表达和微血管密度（microvessel density,MVD）。结果：第二次注射病毒后3d,canstatin基因治疗组肿瘤体积显著小于其余两组（P〈0．05）,治疗第6天抑瘤率达到61％;HE染色显示：各组肿瘤组织中都有坏死．尤其在canstatin基因治疗组坏死更加明显;canstatin基因治疗组caspase-3表达高于空载体组和对照组（P〈0．05）;Flk-1的表达低于空载体组和对照组（P〈0．05）：VEGF的表达3组相比差异无统计学意义（P〉0．05）：canstatin基因治疗组MVD低于空载体组和对照组（P〈0．05）。结论：人canstatin基因对人食管癌移植瘤的生长具有抑制作用,作用机制可能是降低Flk-1的表达进而抑制肿瘤的血管生成,抑制肿瘤的生长。     

人血管能抑素抑制小鼠Lewis肺癌移植瘤生长、转移及血管新生

目的:探讨人血管能抑素(canstatin)对小鼠Lewis肺癌移植瘤生长、转移和血管新生的影响.方法:将pCMV-Script/canstatin及空载体pCMV-Script通过电穿孔的方法转染A549细胞,G418筛选获得阳性克隆.RT-PCR检测转染后细胞中canstatin mRNA的表达,Western blotting检测转染后细胞中canstatin蛋白的表达.建立Lewis肺癌小鼠移植瘤模型,观察pCMV-Script/canstatin组A549细胞培养上清对小鼠Lewis肺癌移植瘤的治疗作用,免疫组化检测各治疗组荷瘤小鼠移植瘤的微血管密度.结果:pCMV-Script/canstatin转染A549细胞在G418筛选后成功形成克隆,转染的A549细胞能有效表达canstatin mRNA和蛋白.pCMV - Script/canstatin治疗组小鼠肿瘤体积明显小于pCMV-Script组和NS组[(1.47 ±0.21)cm3 vs(2.43 ±0.15) cm3、(2.53 ±0.18) cm3,P ＜0.01);pCMV-Script/canstatin组、pCMV - Script组和NS组的肺转移结节数分别为(3.00±1.00)、(7.80±1.48)、(7.60 ±2.41)个,pCMV-Script/canstatin组肿瘤转移受到显著的抑制(P＜0.01);pCMV-Script/canstatin组小鼠的肿瘤组织微血管数明显少于pCMV-Script组和NS组[(84.40 ±8.83) vs (188.68 ±11.15)、(190.24±12.91)个,P＜0.01].结论:pCMV-Script/canstatin能在A549细胞中表达并分泌至细胞外,canstatin可明显抑制Lewis肺癌移植瘤的生长、转移和血管新生.     

重组人canstatin的克隆、表达及其活性鉴定

目的: 克隆并表达canstatin基因，初步检测其抑制血管生成的活性。方法: 采用RTPCR方法从人胚肝组织中钓取canstatin cDNA，克隆入pMD18T载体中，并测序鉴定。在QIA表达系统中表达，Ni柱亲和层析纯化。进行生物学活性鉴定。结果: 经序列分析所获684 bp人canstatin基因与报道一致，重组进pQE30表达载体，IPTG诱导表达并纯化成功，表达产物能明显抑制血管生成。结论: 成功构建人canstatin cDNA克隆和表达载体并在大肠杆菌M15中高效表达。纯化回收产物在鸡胚绒毛尿囊膜（chorioallantoic membrane,CAM）实验中具有明显抑制血管生成活性     

Canstatin分泌增强体系的建立及其抗肺癌作用

目的:评估canstatin分泌增强体系在不同氧条件下的生物学效应,观察其对裸鼠肺癌模型的抗肿瘤作用。方法:基因重组技术构建canstatin分泌型载体,将其转染肿瘤细胞观察其在不同氧条件下的canstatin mRNA表达量,稳定转染的肺癌细胞与人脐静脉内皮细胞混合培养,观察混合培养对内皮细胞增殖、凋亡的效应。建立裸鼠肺癌移植瘤模型,将此体系转染荷瘤裸鼠,观察其对裸鼠移植瘤血管生成的作用,及肿瘤体积重量等指标,评估其抗肺癌效果。结果:成功构建canstatin缺氧增强分泌体系。缺氧条件下其转染的肺腺癌A549细胞canstatin mR-NA的表达显著增加。其稳定转染的A549细胞与人脐静脉内皮细胞HUVEC混合培养可使HUVEC生长增殖缓慢并大量凋亡,此体系转染的裸鼠移植瘤生长缓慢,瘤重、瘤体积及血管生成均显著低于对照组。(P<0.01)。结论:canstatin分泌增强体系在缺氧条件下能显著增加目的基因表达量及其生物学效应,并具有显著抑制肺癌生长和血管生成的作用。     

肿瘤抑素的应用及研究进展

肿瘤的生长需要新生血管来为其提供充足的营养物质和氧气,因此通过抑制血管的生成能够抑制肿瘤的生长。在所有来源于Ⅳ型胶原的内源性血管生成抑制剂中,肿瘤抑素的研究最广泛。肿瘤抑素具有抑制血管内皮细胞增殖、诱导内皮细胞凋亡、直接抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡等多种功能。本文就肿瘤抑素的研究现状进行综述。     

重组人canstatin真核载体的构建及鉴定

目的 构荧光蛋白和canstatin融合蛋白基因的真核表达载体pEGFP-N1／canstatin，以深化研究血管生成抑制剂canstatin的生物学性能和用于肿瘤生物治疗的可能性。方法 提取人胚肝总RNA，RT—PCR扩增canstatin基因片断，T—A克隆到pGEM—T中，从pGEM—T／canstatin克隆载体中，将人canstatin cDNA亚克隆入真核表达载体pEGFP-N1，构建含人canstatin cDNA的重组质粒pEGFP-N1／canstatin，通过酶切鉴定出重组体并测序分析。结果 成功构建pEGFP—N1／canstatin真核表达载体，双酶切及测序鉴定显示canstatin基因片断正确插入载体，与Genebank中报道的序列一致。结论 pEGFP—N1／canstatin真核载体的构建为进一步进行canstatin蛋白表达和活性研究以及canstatin用于基因治疗奠定了基础。     

血管生成与肿瘤的生长及转移

新生血管既为肿瘤生长提供营养和氧气,也是肿瘤侵袭和转移的主要途径.宿主不能控制肿瘤血管生成,人为抑制血管生成能显著抑制肿瘤生长.血管生成抑制剂具有高效、低毒和不易产生耐药性的特点,抗血管生成疗法将成为不同于常规的新的肿瘤治疗策略.     

canstatin基因转染对肺癌A549细胞和血管内皮细胞增殖与凋亡的影响

背景与目的　肿瘤的生长和转移需要大量新血管的生成,人血管能抑素(canstatin)是新近发现的高效内源性血管生成抑制剂,其抑制血管内皮细胞的作用已引起人们广泛关注。本研究的目的是探讨can statin基因在人肺癌A549细胞和人脐静脉内皮细胞HUV ECC中的表达及意义。方法　将canstatin基因通过电穿孔的方法转染人肺癌细胞A549和人脐静脉内皮细胞HUV ECC,行G418筛选获得转基因细胞克隆。用SDS PAGE电泳检测canstatin蛋白在转基因细胞培养上清液中的表达,以流式细胞仪分析细胞周期,并比较转基因和未转基因细胞的生长特性。结果　canstatin在转染组A549 细胞和ECC细胞表达并分泌至上清液中。canstatin基因转染组ECC的凋亡率(16.04%)显著高于空载体组(0.43%)和亲代细胞组(2.92%)(P<0.01),转染细胞生长明显受抑(P<0.01)。而转染组A549细胞的凋亡率(0.19%)与空载体组(0.13%)及亲代细胞组(0.07%)比较无显著性差异(P>0.05),细胞生长也未受明显影响。结论　canstatin能特异地抑制内皮细胞增殖,并诱导内皮细胞凋亡。     

肿瘤停滞因子的功能与结构

引言美国哈佛医学院的Folkman医师1972年首先提出肿瘤的生长和转移与血管的新生有关[1,2],这观点随后得到了大量的基础研究和临床实验的证明[3]。迄今为止,在体内已发现了多种血管生成的促进和抑制因子,如vascular endothelial growthfactor(VEGF)、angiostatin、endostatin、throm-bospondin-1、canstatin和tumstatin等[4-7]。其中,很多血管生成抑制因子能通过作用于增殖和转移的内皮细胞来抑制肿瘤生长。Tumstatin(肿瘤停滞因子)就是其中一种,而且与其他的血管生成抑制因子不同的是它能选择性地作用于肿瘤血管的内皮细胞,而不影响到正常的内皮细胞。本文报道了肿瘤停滞因子的功能及其结构研究的结果。1肿瘤停滞因子与血管基底膜之间的关系在血管新生的过程中,内皮细胞必须依附于血管基底膜(vascular basement membrane)才能形成血管。血管基底膜是特化的细胞外基质,它不仅对内皮细胞提供了机械的支持,而且也影响细胞的生物学行为,如分化、增殖和迁移等[8]。对基膜的组成进行研究发现,IV型胶原蛋白是组成血管基底...     

溶瘤性腺病毒携带canstatin基因对肺癌A549细胞小鼠移植瘤的抑制作用

目的:研究溶瘤性腺病毒介导的canstatin基因表达对A549细胞的抑制作用。方法:将构建的溶瘤性腺病毒载体CRAd-canstatin感染A549细胞。Western blot方法鉴定canstatin基因在A549细胞中的表达;结晶紫染色法和MTT法检测重组病毒体外对细胞的生长抑制作用;将腺病毒注射入荷瘤的裸鼠体内,通过测量肿瘤体积,形态学观察等方法验证CRAd-canstatin对肿瘤的抑制效果。结果:体外结果显示腺病毒介导的canstatin基因在A549细胞中有效表达。体内结果显示相比对照组而言,肿瘤体积明显缩小。结论:初步的实验表明溶瘤性腺病毒介导的CRAd-canstatin基因有望用于肺癌细胞的治疗。     

CANSTATIN, A ENDOGENOUS INHIBITOR OF ANGIOGENESIS AND TUMOR GROWTH

Canstatin is a novel inhibitor of angiogenesis and tumor growth, derived from the C-terminal globular non-collageneous (NCI) domain of the α2 chain of type Ⅳ collagen. It inhibits endothelial cell proliferation and migration in a dose-dependent manner, and induces endothelial cell apoptosis. In vivo experiments show that canstatin significantly inhibits solid tumor growth. The canstatin mediated inhibition of tumor is related to apoptosis. Canstatin- induced apoptosis is associated with phosphatidylinositol 3-kinase/Akt inhibition and is dependend upon signaling events transduced trough membrane death receptor.     

The antitumor activity of exogenous and endogenous canstatin on colorectal cancer cells

Colorectal cancer is the third most common malignancy and the third-leading cause of cancer-related deaths worldwide. In the last several years, recombinant DNA technology has made cancer gene therapy feasible in the clinic. In our studies, we used both exogenous and endogenous canstatin, a type IV collagen genetically distinct product. We detected the effects of canstatin on colorectal cancer cells HCT-15 and HCT-116. DAPI staining, FCM and migration analyse were used to detect the apoptotic cells, cell cycle and mobility. As shown in the results, the apoptotic cell numbers (p<0.05) and G1 arrest cell numbers (p<0.05) were higher than in the non- treatment case. The mobility of the cells was also decreased obviously (p<0.05). Simultaneously, combination effects of exogenous and endogenous canstatin were identified.     

血管能抑素重组基因表达载体抗肺癌效应研究

目的:通过构建人血管能抑制素(Canstatin)真核表达载体,转染裸鼠肿瘤局部,探索其对肺癌治疗作用.方法:RT-PCR法获取Canstatin cDNA全长,定向克隆法构建Canstatin基因表达载体pCMV-Script-Cans.荧光定量PCR法检测转染细胞Canstatin mRNA的表达.台盼蓝拒染法、3H-TdR掺入法检测细胞生长增殖,TUNEL法检测细胞凋亡.基因枪转染重组载体到荷瘤裸鼠肿瘤局部,CD31单克隆抗体微血管记数检测抗血管生成效应.结果:成功构建pCMV-Script-Cans重组载体,并在转染的细胞株中检测到Canstatin mRNA的表达.人脐静脉内皮HUV-EC-C细胞株pCMV-Script-Cans质粒转染组比空载体组3H-TdR掺入量明显减低(P＜0.01),细胞凋亡率明显增加(P＜0.01),重组载体转染肿瘤生长缓慢,微血管数显著低于对照组(P＜0.01).结论:pCMV-Script-Cans重组载体能在转染的哺乳动物细胞中表达Canstatin,并抑制内皮细胞增殖,而且有很好的抗肺癌血管生成作用.     

血管能抑素诱导甲状腺癌细胞SW579凋亡和衰老及其机制

目的：检测血管能抑素（ canstatin）对甲状腺癌SW579细胞的增殖抑制、诱导凋亡与衰老作用及其机制。方法：利用软琼脂克隆形成实验检测细胞增殖。分别利用Annexin V-FITC/PI双染和β-半乳糖苷酶染色检测细胞凋亡和衰老。Western blot技术检测可能的机制。结果：Canstatin可以明显抑制SW579细胞增殖,诱导其凋亡和衰老。处理后细胞的p-AKT蛋白水平明显下降。而caspase 3和9蛋白水平升高。结论：Can-statin通过抑制p-AKT导致SW579细胞凋亡和衰老。