γ-H2AX分析电离辐射诱发小鼠神经元DNA双链断裂及修复

目的 观察临床剂量的电离辐射后小鼠神经元DNA双链的断裂及修复, 探讨γ-H2AX是否能作为衡量体内正常脑组织神经元DNA双链断裂(DSB)形成和修复的指标。方法 电离辐射诱导DSB形成试验,C57BL/6小鼠行0.1、0.5和1.0 Gy全身照射后10 min,收集脑组织进行分析;DSB修复试验,修复功能正常小鼠(C57BL/6)和修复缺陷鼠(BALB/c, A-T 和SCID)在全身照射2 Gy后0.5、2.5、5、24和48 h收集脑组织进行分析。未照射的小鼠作为对照组。γ-H2AX和NeuN免疫荧光双重染色和免疫组织化学染色分析脑组织神经元DSB形成和修复。结果 DSB形成试验,在对照组脑组织皮质区神经元的细胞核内仅有数目很少的γ-H2AX焦点,而受照射后细胞核内γ-H2AX焦点数目显著增加,并显示出明显的剂量相关。通过分析不同放射敏感性的小鼠电离辐射后脑组织皮质区神经元的DSB修复动力学,发现C57BL/6小鼠细胞核内γ-H2AX焦点随时间的延长迅速减少,在照射后24和48 h仅有很低水平DSB未修复;而免疫缺陷SCID鼠在照射后所有的时间点都显示出γ-H2AX焦点的明显增加,A-T小鼠表现出较低的修复缺陷,主要表现在较晚的时间点(≥5 h)γ-H2AX焦点的中度增加;放射敏感的BALB/c小鼠与C57BL/6小鼠相比γ-H2AX焦点数量轻度增加。结论 γ-H2AX焦点分析可以作为一项精确的量化指标,在体内衡量临床相关剂量电离辐射诱导的DSB形成和修复。     

Tip60基因沉默对细胞DNA双链断裂修复和辐射敏感性的影响

目的 探讨Tip60对细胞辐射敏感性的影响及相关机制。方法 采用siRNA和Tip60乙酰转移酶抑制剂漆树酸,抑制U2OS细胞中Tip60的表达或乙酰转移酶活性;用克隆形成率分析细胞对⁶⁰Co γ射线的敏感性;采用γ-H2AX原位免疫荧光集簇点法,检测DNA双链断裂损伤修复;用免疫共沉淀检测蛋白质的相互作用。结果 siRNA沉默Tip60表达明显提高了U2OS细胞对1、2 Gy中、低剂量γ射线的敏感性(t=3.364、3.979,P＜0.05),但对4 Gy大剂量照射的细胞存活率无明显影响。γ-H2AX集簇点检测结果表明,照射后1、4和8 h,Tip60失活导致细胞DNA双链断裂修复能力降低(t=3.875、3.183和3.175, P<0.05)。细胞在受到电离辐射损伤后,Tip60与DNA修复蛋白DNA-PKcs发生相互作用,漆树酸能抑制DNA-PKcs的T2609位点的磷酸化。结论 Tip60通过与DNA-PKcs相互作用,调控细胞DNA双链断裂修复机制,对细胞辐射敏感性产生影响。     

60Coγ射线诱导EJ细胞DNA损伤及γH2AX 表达的研究

目的 探讨不同剂量⁶⁰Coγ射线对EJ细胞DNA损伤的情况,不同剂量⁶⁰Coγ 射线照射EJ细胞后诱导磷酸化组蛋白H2AX焦点形成,以及与γH2AX表达量的关系。方法 单细胞凝胶电泳检测DNA链断裂损伤情况。免疫荧光法检测不同剂量γ 射线照射后立即、以及2 Gy γ 射线照射后不同时间的EJ细胞中γH2AX焦点的数量。流式细胞分析法检测不同剂量γ 射线照射后EJ细胞中γH2AX 蛋白表达量的变化。结果 单细胞凝胶电泳结果显示,γ射线照射后DNA损伤情况明显加重,随照射剂量的增加,细胞尾矩不断加大,0 Gy组尾矩为0.24,4 Gy照射组尾矩为5.26;免疫荧光结果显示,随着照射剂量的增加,γH2AX焦点数目及大小均明显增加,照射的剂量范围从0.1~4 Gy均可检测,且照射剂量和焦点形成数目之间存在剂量-效应关系,0.1 Gy照射组每个细胞中的焦点数平均达12.37个,4 Gy照射组每个细胞中的焦点数平均达46个;2 Gy γ 射线照射后24 h仍可检测到γH2AX焦点,随时间延长焦点数目减少、强度减弱,具有时间依赖性。流式细胞检测结果表明,γ 射线照射后γH2AX 蛋白表达量明显增加,呈现明显量效关系,0.1和4 Gy照射组γH2AX阳性细胞表达率分别为7.4%和29.2%。结论 免疫荧光法检测照射后γH2AX焦点数目比其他实验方法更能敏感、直观的反映DNA损伤及修复情况,有望成为检测辐射损伤的理想生物指标。     

X射线对人外周全血细胞nm23-H1基因表达的影响

目的 应用实时荧光定量反转录PCR的方法,分析不同剂量X射线对人外周全血细胞nm23-H1基因表达的影响,探讨运用nm23-H1基因表达变化作为电离辐射生物剂量计的可行性。 方法 采用X射线照射人外周全血细胞,于不同剂量(0～5 Gy)照射后不同时间点(0、6、12和24 h)收集细胞提取总RNA,并反转录为cDNA,利用实时定量PCR检测不同剂量照射后nm23-H1基因表达变化,分析其剂量-效应关系及时间-效应变化。结果 照后0 h,各剂量组之间nm23-H1基因表达变化差异无统计学意义(F=0.478,P> 0.05),照后6 h,在1～3 Gy照射剂量范围内,nm23-H1基因表达水平随剂量增加有增高的趋势(F=15.064,P<0.05),照后12 h,在1～5 Gy照射剂量范围内,nm23-H1基因表达水平随剂量增加而增高(F=3.435,P<0.05);照后24 h,各剂量组之间差异无统计学意义(F=0.444,P>0.05)。0、4 和5 Gy照射后,nm23-H1基因表达水平随时间的推移降低 (F=8.636、4.112、5.411,P<0.05);1 Gy照射后,不同时间点nm23-H1基因表达水平差异无统计学意义,仅12 h的 nm23-H1基因表达水平与0 h的表达水平差异有统计学意义(t=-2.527,P<0.05);2和3 Gy剂量照射后,nm23-H1基因表达水平均于24 h时降至最低点(F=12.517、6.622,P<0.05)。结论 电离辐射可诱导人外周血nm23-H1基因的表达改变,该基因的表达变化具有作为电离辐射生物剂量计应用于核辐射事故早期生物剂量估算的潜能。     

γ-H2AX用于辐射生物剂量计研究的动物模型评价

目的 通过比较γ射线照射诱导大鼠和人淋巴细胞DNA双链断裂(DSBs)修复动力学的变化,评价大鼠用于γ-H2AX焦点辐射生物剂量计动物模型的可行性. 方法 采用γ射线外照射Sprague-Dawley (SD)雄性大鼠和健康成人外周血淋巴细胞以及整体照射大鼠,分别于照射后不同时间采用免疫荧光技术检测DSBs分子标志物γ-H2AX焦点的变化,检测修复蛋白pATM(S1981)和pDNA-PKcs (T2609) 焦点的形成,以及它们与γ-H2AX焦点的共定位情况.结果0.5 Gy γ射线照射诱发大鼠和人淋巴细胞γ-H2AX焦点形成和消除动力学相一致,表现为受照后30 min,γ-H2AX焦点形成达到最大值(t_大鼠=62.64,t_人=28.52,P<0.05),6 h内快速下降 (t_大鼠=45.96,t_人=14.80,P<0.05),至受照后24 h残留焦点数为最大值的3%~8%.γ射线照射后30 min,大鼠和人淋巴细胞pATM (S1981)和pDNA-PKcs (T2609)焦点形成数较未照射对照组显著增加 (t_大鼠=21.05、25.80,t_人=11.07、29.52,P<0.05),分别与γ-H2AX焦点共定位比例亦显著升高 (t_大鼠=5.34、9.14,t_人=18.32、51.28,P<0.05),占26%~32%.离体照射和整体照射诱导大鼠淋巴细胞γ-H2AX焦点形成数相一致,而且γ-H2AX焦点形成与照射剂量之间呈良好的线性关系.结论 大鼠为γ-H2AX用于辐射生物剂量计研究提供了很好的动物模型,ATM与DNA-PKcs共激活在辐射诱导大鼠和人淋巴细胞DSBs的修复中发挥重要的作用.     

沉默Krüppel样因子5对电离辐射后大鼠小肠上皮IEC-6细胞生物学功能的影响

目的 探讨沉默Krüppel样因子5（KLF5）对电离辐射后体外培养的大鼠小肠上皮IEC-6细胞生物学功能的影响。方法 给予大鼠小肠上皮IEC-6细胞12 Gy照射,分别在照后0、0.5、1、2、3、5、7、24 h,检测KLF5的表达。给予IEC-6细胞0、2、4、8、12和16 Gy X射线照射,照后3 h收集细胞蛋白,采用Western blot法检测IEC-6细胞中KLF5的表达。设计并合成特异性针对大鼠KLF5基因的shRNA靶序列,构建到慢病毒载体中,通过感染人胚肾293T细胞,对慢病毒进行包装和滴度测定。使用包装好的慢病毒感染IEC-6细胞,荧光显微镜下观察转染效率,转染72 h后分别采用实时-PCR和Western blot方法检测感染后细胞中KLF5 mRNA及蛋白的表达。后续实验分为阴性对照组、shKLF5组、单纯照射组、照射+shKLF5组4组。采用CCK-8法观察8 Gy照射后KLF5沉默细胞的增殖活性,流式细胞术检测8 Gy照射后KLF5沉默细胞的周期分布和凋亡,免疫荧光染色观察2 Gy照射后KLF5沉默细胞中γ-H2AX焦点数量。结果 不同剂量射线照射后KLF5表达逐渐增加,呈现明显的剂量效应关系。12 Gy照射后KLF5表达呈现先升高后降低的趋势,照后5 h表达量最高。KLF5 shRNA慢病毒载体构建成功,感染的IEC-6细胞中KLF5 mRNA及蛋白水平均在转染72 h明显降低。照射+shKLF5组细胞在照射后24 h阻滞在G₂/M期现象显著（t=11.56,P<0.05）,细胞增殖明显受到抑制,其细胞凋亡率（12.49±0.63）%,明显高于单纯照射组（7.42±0.49）%,两组比较差异有统计学意义（t=10.98,P<0.05）,照射+shkLF5组细胞核中各时间点的γ-H2AX焦点数量明显多于同一时间点阴性对照组（t=22.07、23.89、11.24、59.97、20.85,P<0.05）。结论 成功构建KLF5 shRNA慢病毒载体,并建立KLF5敲低小肠上皮细胞株。下调细胞内KLF5表达,能够使细胞周期阻滞在G₂/M期,抑制照射后细胞的增殖,促进细胞的凋亡,DNA双链断裂水平增加,修复延迟。     

α-粒子诱发BEP2D细胞癌变系的DNA断裂重接修复缺陷与XRCCs修复基因mRNA表达研究

目的 研究α粒子诱发人支气管上皮细胞(BEP2D)癌变细胞系BERP35T-1和BERP35T-4的DNA断裂损伤修复能力,分析其DNA断裂修复基因XRCCs系列的mRNA表达。方法 脉冲电场凝胶电泳法检测DNA双链断裂,RT-PCR分析DNA修复基因的mRNA表达。结果 恶性转化细胞系BERP35T-1和BERP35T-4受0～150Gyγ射线照射后修复4h的DNA断裂残留损伤显着高于亲本BEP2D细胞,mRNA表达分析显示修复基因XRCC2、XRCC3和Ku80(XRCC5)表达下调2.5～6.5倍,而BERP35T4细胞中DNAPKcs(XRCC7)表达上调2.4倍。结论 α粒子诱发恶性转化细胞系的DNA链断裂修复机理缺陷,其中部分原因是DNA修复基因的表达抑制。DNA修复缺陷将导致细胞基因组不稳定性,α粒子诱发细胞恶性转化机理可能与此相关。     

γ-H2AX分析用于检测电离辐射致HepG2细胞DNA双链断裂的研究

目的 应用γ-H2AX分析检测电离辐射导致肝癌细胞株HepG2基因组DNA双链断裂的情况，并检测在不同细胞周期时相中的表达差异，从而了解不同时相HepG2细胞株的辐射敏感性。方法利用胸腺嘧啶核苷（TdR）阻断HepG2细胞于G1期末，于不同时间点分别得到同步化的S期和G2/M期细胞，用60Coγ射线照射细胞，建立DNA双链断裂模型，采用免疫荧光法和Westemblotting检测γ-H2AX的表达。结果TdR阻断后继续培养至34和40h，分别得到了较高同步化程度的S期和G2／M期HepG2细胞；受照后的HepG2细胞中Y-H2AX表达较照射前显著增高，处于S期的细胞γ-H2AX表达增加更为突出。结论不同周期时相的HepG2细胞受照后均检测出不同程度的DNA双链断裂，其中S期细胞尤为敏感。γ-H2AX对DNA双链断裂快速敏感的反应使γ-H2AX分析在检测早期DNA双链损伤中具有广泛的廊用前景。     

γ射线照射对IER5基因mRNA表达的影响

目的 应用实时PCR技术分析⁶⁰Co γ射线照射正常人淋巴母细胞(AHH1)、宫颈癌细胞(HeLa)与接种人肿瘤细胞的裸鼠后IER5基因表达的影响。方法 对于离体培养的AHH1 、HeLa与BALB/c-nu裸鼠,按照不同剂量(0.5、2、4、6、10、15 Gy)与照射后不同时间点(2、4、8、12、24 h)进行分组进行提取mRNA、反转录与IER5基因表达量测试。结果 在相同条件下AHH1对照射比HeLa更灵敏,其表达量的峰值对应的剂量比HeLa的要低。对于AHH1细胞,对2 Gy低剂量的照射反应比10 Gy的高剂量反应要快,而HeLa细胞,对于2 Gy的低剂量与10 Gy的高剂量的照射反应没有太大差异,在照射后2 h都出现基因表达的最大值。此外,人肝肿瘤的IER5基因对照射比较敏感,而人肺与脑肿瘤的IER5基因不敏感。结论 IER5基因有可能成为宫颈癌与肝肿瘤新的辐射损伤生物分子的一个标记物,对肝肿瘤放疗具有潜在的应用价值。     

应用脉冲电场凝胶电泳分析X射线诱发人骨肉瘤细胞DNA双链断裂与损伤修复效应

目的 研究电离辐射诱发人骨肉瘤肿瘤细胞DNA双链断裂与辐射损伤修复效应, 观察辐射损伤、损伤修复效应与肿瘤细胞辐射敏感性之间的关系。方法 选用强制均匀电场电泳, 分别测定经不同剂量X射线照射和相同剂量照射后培养不同时间, 人骨肉瘤Rho0和143.B肿瘤细胞株DNA双链断裂。结果 (1)X射线诱发人骨肉瘤肿瘤细胞的DNA双链断裂与辐射剂量呈线性正比关系; (2)培养后的人骨肉瘤肿瘤细胞对辐射诱发的DNA双链断裂具有一定修复能力; (3)Rho0比143.B细胞株具有更高的辐射敏感性; (4)脉冲电场凝胶电泳技术是分析人肿瘤细胞DNA双链断裂的敏感方法。结论 脉冲电场凝胶电泳是分析人肿瘤细胞DNA双链断裂的敏感方法; 电离辐射诱发人骨肉瘤细胞DNA双链断裂与损伤修复效应和肿瘤细胞的辐射敏感性有密切关系。     

α粒子照射诱发DNA双链断裂修复及其在染色质中的分布

目的 探索α粒子照射诱发人外周血淋巴细胞双链断裂（DSB）的修复特点及与染色质结构的关系,为其作为α核素内照射鉴定指标和生物剂量估算指标提供实验依据。方法 取4名健康成人外周血淋巴细胞,0.5Gyα粒子和γ射线照射,采用免疫荧光技术检测照射后10min~48hDSB分子标志物γH2AX焦点、同源重组（HR）修复蛋白Rad51焦点的形成及其消除过程,以及它们在染色质中的分布。结果 与未照射时相比,人淋巴细胞经0.5Gyα粒子照射后10min~2h,可见明显的线性γH2AX焦点径迹形成（t=11.12、14.40、16.56,P<0.05）,至照后6h基本消失;而γH2AX焦点形成数在α粒子照射后30min达到最大值（t=51.72,P<0.05）,6h内快速下降（t=29.83,P<0.05）,至照后24~48h残留焦点数约为16%;照后10min,约27%的γH2AX焦点位于DAPI亮染的异染色质区,可能降低了其修复效率。而0.5Gyγ射线照射后10min~48h,未见线性γH2AX焦点径迹形成,随机、散在分布的γH2AX焦点均位于DAPI淡染的常染色质区,焦点形成数与残留数均显著低于α粒子照射诱发的焦点数。修复蛋白Rad51焦点在α粒子和γ射线照射后30min~2h有升高趋势,但与本底值无明显差异,且与γH2AX焦点的共定位仅占3%~8%。结论 α粒子照射诱发人外周血淋巴细胞线性γH2AX焦点径迹形成可作为判断是否存在α粒子内照射的生物指标,其在照射后稳定存在一定时间的特性,为其作为生物剂量估算指标提供了可能。     

硫酸镁抑制经辐射后人脐静脉血管内皮细胞γ-H2AX的表达

目的 探讨不同浓度硫酸镁对照射后人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial,HUVEC)存活率及γ-H2AX表达的影响。方法 CCK-8法检测不同浓度的硫酸镁对HUVEC存活率的影响;激光共聚焦显微镜检测4 Gy X射线照射后不同时间HUVEC中γ-H2AX簇集点(foci)的数量;流式细胞术和Western blot检测γ-H2AX蛋白的表达情况。结果 CCK-8法显示,1.25 mg/ml浓度的硫酸镁能提高照射后的细胞存活率(t=-6.34,P<0.05);细胞免疫荧光结果显示,照射后0.5~1 h foci焦点数达到最高值,平均达45个,随着时间的延长foci点数变少,强度减弱,具有时间依赖性,而硫酸镁在照后0.5、1、2、6、12 h均可以明显减少foci的形成(t=12.62、6.36、11.93、5.75、9.43,P<0.05);流式细胞仪检测表明,硫酸镁在照后0.5、1、2 h可以抑制X射线照射后γ-H2AX蛋白表达量的增加(t=6.07、5.32、11.85,P<0.05);Western blot结果与细胞免疫荧光结果一致。结论 硫酸镁可以增加照射后HUVEC的存活率,降低X射线诱导的DNA损伤蛋白γ-H2AX的表达。     

DDX46基因对结肠癌细胞电离辐射敏感性的影响及机制研究

目的 探讨DDX46基因对结肠癌细胞的电离辐射敏感性的影响及其作用机制。方法 DDX46基因RNA干扰慢病毒转染的SW480细胞为实验组,空载质粒慢病毒转染的SW480细胞为对照组。两组细胞转染72 h后,分别进行0和4 Gy X射线照射,采用CCK-8方法检测两组的细胞活力;实验组联合4 Gy X射线照射24 h后,采用免疫荧光技术和Western blot法检测细胞γ-H2AX foci数量以及DNA损伤修复通路关键蛋白的表达水平,确定DDX46与辐射诱导的DNA损伤修复的关系。结果 4 Gy X射线照射24 h后,实验组的细胞活力比照射前降低（15.02±3.92）%（t=-4.696,P<0.05）,比对照组降低（17.43±1.83）%（t=4.844,P<0.01）;而对照组照射前后比较差异无统计学意义（P>0.05）。同时,实验组γ-H2AX foci数量相比于对照组增加了（43.03±17.6）%（t=-3.108,P<0.05）,ATM的蛋白水平显著升高（t=7.530,P<0.01）,而ATM的活性形式p-ATM以及ATM的下游靶蛋白Rad50的蛋白水平则明显降低（t=4.260、4.260、P<0.05）,同时γ-H2AX的蛋白表达水平也有一定程度的升高（t=-3.090,P<0.05）,DNA-PK在两组细胞内的蛋白水平变化不大。结论 沉默DDX46可以提高结肠癌细胞系SW480的辐射敏感性,其机制可能是DDX46表达沉默抑制结肠癌细胞系SW480中ATM的活化,从而抑制辐射诱导的DNA损伤的修复,提高SW480的辐射敏感性。     

60Co γ射线诱导人淋巴细胞线粒体基因表达效应的研究

目的 探讨电离辐射诱导正常人B淋巴细胞线粒体辐射敏感基因mRNA水平的剂量-效应关系。 方法 用0、0.5、1、3、5、8、10和15 Gy ⁶⁰Co γ射线分别照射指数增长期的人淋巴细胞永生化细胞株,24 h后用反转录PCR和实时荧光定量PCR方法检测7个相对辐射敏感基因,包括ND3、Cyt b、COXⅠ、COXⅡ、COXⅢ、ATPase6和ATPase8基因mRNA的表达水平,观察其剂量-效应关系。 结果 ⁶⁰Co γ射线照射后24 h,线粒体7个辐射敏感基因表达总体上调。线粒体呼吸链复合体Ⅳ亚基Ⅰ(COXⅠ)基因表达在受到8 Gy照射后增强最明显,为对照组的13倍左右。除COXⅠ和COXⅡ外,其余5个基因在受照后表现出一定的剂量-效应关系。其中,ND3、ATPase6和ATPase8这3个基因在3~15 Gy的范围内线性关系良好,而COXⅢ基因在3~10 Gy的范围内也有十分良好的线性关系。结论 ⁶⁰Co γ射线照射后24 h,线粒体基因表达水平总体上调,其中ND3、ATPase6、ATPase8和COXⅢ这4个基因在一定剂量范围内线性关系良好,可以作为联合辐射损伤生物标志物进一步研究。     

60Coγ射线离体照射诱导人线粒体COXI、ND1和ND6基因表达变化的研究

目的 探讨电离辐射诱导的人线粒体基因COXI、ND1和ND6表达的变化。方法 用⁶⁰Coγ射线(1、3、5、8和10 Gy)照射指数增长期的人淋巴细胞永生化细胞株,8 h后用反转录PCR(RT-PCR)和实时荧光定量PCR(Real-time PCR)的方法检测线粒体基因(COXI、ND1和ND6)的表达变化,分析剂量-效应关系;以5 Gy剂量照射后,于不同时点(0.5、4、8、12、24、48和72 h)分析3种线粒体基因的表达变化,观察时间-效应变化。结果 通过量效关系和时效关系方面的研究发现,COXI、ND1和ND6基因表达总体上调,但3种基因又具有其各自的特征:COXI基因除5 Gy外,其他剂量照射后与对照组相比表达增强(F=116.62, P<0.05);ND1基因经1、8、10 Gy剂量照射后,与对照组相比表达增强(F=25.13, P<0.05),5 Gy剂量照射后,除8和48 h两组外,其余各组的表达改变与对照组相比,表达增强(F=223.68, P<0.05);ND6基因经1、8、10 Gy剂量照射后与正常对照组比较,基因表达增强(F=18.51, P<0.05),5 Gy剂量照射后4、8、24、48和72 h与对照组相比表达,明显增强(F=138.91, P<0.05)。结论 电离辐射可以诱导人线粒体COXI、ND1和ND6基因表达的改变,总体表达是增强的。     

60Co γ射线对盐诱导激酶2的诱导表达作用

目的 探讨电离辐射对盐诱导激酶2（SIK2）蛋白和mRNA的诱导表达作用及细胞周期相关性。方法 HepG2细胞用⁶⁰Co γ射线照射,蛋白质印迹法和实时定量PCR法分别检测细胞的SIK2蛋白和mRNA的表达,胸腺嘧啶双阻滞法同步化细胞,流式细胞术测定细胞周期的变化。结果 HepG2细胞2 Gy照射后4、6、10 h,SIK2蛋白表达显著增加 （t=3.00、3.98、4.17,P<0.05）;10 Gy大剂量照射后,SIK2蛋白表达增加的趋势与2 Gy一致,但增加的幅度较前者低。2和10 Gy照射后SIK2基因 mRNA均在10 h出现了增加（t=4.54、2.74,P<0.05）。照后10 h出现了细胞G₂/M阻滞高峰。利用同步化细胞分析表明,细胞周期不同时相中SIK2 mRNA的表达无明显差别。结论 2和10 Gy照射均能诱导SIK2蛋白表达增加,2 Gy的作用更加明显。细胞照射后10 h,SIK2 mRNA的表达水平增加,但与辐射诱发细胞G₂/M期阻滞引起不同时相细胞的分布变化无关。     

肺腺癌细胞株表皮生长因子受体突变对射线诱导的DNA修复的影响

目的 探讨肺腺癌细胞株表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶区域突变对放射线诱导的DNA双链断裂后修复的影响。方法 对A549细胞株(wt EGFR)和H1975细胞株(mut EGFR)进行6 MV X射线照射。免疫荧光方法观察两种细胞株经4 Gy X射线照射后不同时间点细胞核中γH2AX焦点数。免疫共沉淀法检测EGFR与DNA-PKcs的结合情况。Western blot方法检测细胞核中RAD51表达以及EGFR核转运情况。结果 H1975细胞株(mut EGFR)经X射线照射后DNA双链断裂修复延缓,EGFR不进行核转运,细胞核中无EGFR-DNA-PKcs复合物形成,且不影响细胞核RAD51的表达。A549细胞株(wt EGFR)经射线诱导后EGFR发生核转运,并与DNA-PKcs结合,发挥非同源修复,同时RAD51进入细胞核,发挥同源修复作用。结论 EGFR酪氨酸激酶区突变的肺腺癌细胞株能减少X射线诱导的DNA双链断裂后非同源修复和同源修复,延缓DNA修复动力学,从而增加放射敏感性。     

DNA双链断裂残留损伤与癌细胞辐射敏感性研究

目的 了解不同组织来源癌细胞株和人体肿瘤组织原代细胞的DNA双链断裂损伤修复的个体差异性,探寻预测癌细胞辐射敏感性的生物指标。方法 ⁶⁰Co γ射线照射诱发DNA损伤,脉冲电场凝胶电泳检测DNA双链断裂损伤修复,细胞克隆形成能力法检测细胞辐射敏感性。结果 8个不同组织来源癌细胞株的辐射敏感性有较大的差异(D₀为0.65~2.15 Gy),不同细胞株20 Gy γ射线照射诱发产生的DNA双链断裂原初损伤有一定的差别,但与细胞辐射抗性无相关性。辐射敏感细胞SX-10的DNA双链断裂修复缺陷发生在早期快速修复相,而A2780细胞的修复缺陷是发生在晚期慢速修复相。20 Gy照射修复2 h后DNA双链断裂残留量与细胞辐射敏感性指标D₀或SF₂值有显著的相关性。不同个体患者脑肿瘤组织原代细胞之间,辐射诱发DNA双链断裂的修复反应存在明显差异,修复2 h后残留损伤的个体差异性分布类似于癌细胞株。结论 DNA双链断裂残留损伤与癌细胞辐射抗性有显著相关性,可作生物指标预测肿瘤组织细胞对放射治疗的反应性。     

单细胞凝胶电泳检测辐射诱导的DNA双链 断裂修复时效性研究

目的 探讨细胞DNA辐射损伤修复时效性,拟合修复曲线和修复平面模型,提高其在辐射生物剂量估算中应用的准确性。方法 通过对离体外周血淋巴细胞用不同剂量γ射线照射后3、24、48 和72 h进行中性单细胞凝胶电泳实验,检测辐射诱导的DNA双链断裂修复程度。结果 照射后不同时间点的剂量-效应曲线和不同剂量点的修复曲线拟合度均较高(r >0.98, P <0.01),将两者结合后,拟合的曲面光滑度较好。结论 不同剂量下的损伤修复呈线性关系,修复曲面模型可用于辐射原发损伤估算。     

miR-101对宫颈癌HeLa细胞辐射敏感性的影响和机制研究

目的 研究microRNA101（miR-101）对体外培养的人宫颈癌HeLa细胞辐射敏感性的影响及其作用机制。方法 实验设为3组,分别为空白对照组、阴性对照组和实验组。采用160 kVp X射线照射细胞,吸收剂量率为1.15 Gy/min。实时定量PCR（qRT-PCR）法检测miR-101的过表达情况;克隆形成实验检测miR-101对HeLa细胞辐射敏感性的影响;γ-H2AX免疫荧光法检测细胞DNA双链断裂,Western blot实验观察ATM和DNA-PKcs蛋白表达量变化。结果 转染48 h后,实验组的细胞与空白对照组相比,miR-101的表达量明显增加（t=14.16,P<0.05）。过表达miR-101的HeLa细胞存活率明显降低（t=10.75,P<0.05）。miR-101能增加HeLa细胞的辐射敏感性（F=7.72,P<0.05）,辐射增敏比为1.29。γ-H2AX免疫荧光显示,miR-101能抑制辐照后细胞DNA损伤修复。过表达miR-101的HeLa细胞与对照组相比,ATM和DNA-PKcs蛋白表达量明显减少。结论 miR-101 mimic对HeLa细胞的生长有抑制作用。miR-101过表达能增加HeLa细胞的辐射敏感性,miR-101通过抑制辐照后DNA损伤修复提高辐射敏感性。