Expression of rat brain-derived neurotrophic factor in COS-7 cells following its eukaryotic expression vector construction

目的:构建脑源性神经营养因子(BDNF)基因真核表达载体,检测其转染COS-7细胞后的表达.方法:从大鼠海马组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法获得目的基因片段,克隆至pGEM-T载体中.经测序确证后将BDNFcDNA片段与pEGFP-N1载体定向连接.将鉴定正确的重组体pEGFP-N1-BDNF以脂质体法转染至COS-7细胞中,用RT-PCR鉴定BDNF mRNA的表达,免疫印迹法检测BDNF蛋白质表达水平.结果:克隆了BDNF的cDNA,并构建了其真核表达载体pEGFP-N1-BDNF,经限制性内切酶酶切鉴定及测序分析证实了其序列的正确性;免疫印迹法分析显示,转染48 h时,COS-7细胞以分泌proBDNF-GFP融合蛋白为主,在96 h以分泌成熟BDNF-GFP融合蛋白为主.结论:成功构建pEGFP-N1-BDNF真核表达载体,并且在COS-7细胞中得到高效表达,BDNF前体及成熟体同时分泌到胞外,在不同时间点分泌组合不同.     

人类心发育候选基因ZNF569融合EGFP真核表达载体的构建及表达

目的:构建真核表达重组体pEGFP-ZNF569,并鉴定其在哺乳动物COS-7细胞系能否正确表达.方法:把ZNF569基因ORF定向克隆入带有EGFP报告基因的真核表达载体,构建真核表达重组体pEGFP-ZNF569,脂质体介导将pEGFP-ZNF569转染入哺乳动物COS-7细胞,以一步法RT-PCR检测其在哺乳动物COS-7细胞中的表达情况.结果:双酶切及测序鉴定表明成功构建真核表达重组体pEGFP-ZNF569,并在COS-7细胞中成功地表达了融合荧光蛋白.RT-PCR检测显示RT-PCR扩增产物与ZNF569目的基因片段大小相符,确实源于重组质粒转录后的mRNA.结论:真核表达重组体pEGFP-ZNF569的成功构建及在体外真核细胞中有效表达,为进一步研究ZNF569在心发育过程中的信号调控奠定了一定的实验基础.     

人幽门螺杆菌外膜蛋白18000 DNA疫苗的构建及表达

目的：构建含人幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H-pylori)18000外膜蛋白编码基因的真核重组载体，并在COS-7细胞中表达，为核酸疫苗的开发奠定基础。方法：从原核表达质粒pET32a( )／528中，酶切H-pylori 18000外膜蛋白编码基因片段，将目的基因与同样进行酶切、纯化的载体pcDNA3．1进行连接，而后转化并筛选含有目的基因的重组载体pcDNA3．1／528，并在COS-7细胞中表达，以RT-PCR，Western法检测其表达产物。结果：经单、双酶切证实插入的基因片段为H-pylori 18000外膜蛋白编码基因；采用RT-PCR方法，能够从转染的COS-7细胞中扩增出一条与目的基因大小一致的DNA片段，Western法等检测显示，该重组质粒能够在COS-7细胞中表达目的蛋白，而且具有生物活性。结论：成功地构建了核酸疫苗pcDNA3．1／528，并在COS-7细胞中表达，为H-pylori核酸疫苗的研制奠定了良好的基础。     

人OX40-Fc分子的构建、真核表达及活性研究

目的构建人OX40-Fc基因的真核表达质粒，并表达有生物学活性的纯化人OX40-Fc融合蛋白。方法从活化的人T细胞cDNA文库中以PCR方法扩增OX40膜外区cDNA编码基因，并导入真核表达载体pcDNA3中。测序证实后，进行酶切并与人IgG1Fc基因一起装入真核表达载体pcDNA3中，采用脂质体法稳定转染COS-7细胞，用夹心ELISA检测其表达情况，经蛋白A亲和纯化，用SDS-PAGE与Western blotting进行鉴定。检测其对活化后Jurkat细胞增殖的抑制活性。结果测序证实构建的OX40膜外区与OX40-Fc cDNA阅读框完整，连接部位序列正确；ELISA证实OX40-Fc蛋白的表达；SDS-PAGE与Western blotting证实其为OX40-Fc蛋白。增殖实验证明其对活化后的Jurkat细胞有抑制增殖作用。结论成功构建了人OX40-Fc真核表达载体，并使有生物学活性的OX40-Fc融合蛋白在COS-7细胞上获得了稳定表达。为进一步研究该蛋白在自身免疫性疾病治疗中的作用及调节免疫自稳机制中的地位奠定了基础。     

小鼠Ii分子的克隆表达及在COS-7细胞中的亚细胞定位

目的 获取BALB／c小鼠Ii链编码基因，构建真核表达载体并在真核细胞中表达。方法 RT-PCR获取BALB／c小鼠Ii链编码基因，插入pEGFP真核表达载体，脂质体转染COS-7细胞，荧光显微镜和激光共聚焦观察外源基因的表达。结果 外源基因在COS-7细胞中得到高效表达，激光共聚焦的结果显示，外源基因定位在细胞的内膜系统，并能够和I-A^d分子形成聚集体。结论 Ii链在真核细胞中表达后定位在细胞的内膜系统并能和I-Ad分子形成聚集体。     

大鼠β-防御素-2重组质粒的构建及转染表达

目的为开展防御素基因转基因以增强粘膜抗感染能力的实验研究,本实验构建真核重组表达载体pBK-CMV-rBD2以进行COS-7细胞转染表达实验.方法用RT-PCR法(引物含有EcoRI、HindⅢ酶切位点)从肺组织总RNA中扩增出rBD2基因全长cDNA片段,并克隆于pBK-CMV.通过脂质体转染法将pBK-CMV-rBD2导入COS-7细胞,采用RT-PCR法和琼脂糖弥散法分别从mRNA水平和蛋白质水平检测rBD2的表达及活性.结果所构建的真核表达重组载体pBK-CMV-rBD2转染COS-7细胞后呈现有效表达并具有活性.结论提示通过基因转染的方法把防御素基因导入宿主细胞可能增强宿主粘膜抗感染能力,进一步的整体动物转基因抗感染实验研究具有可行性.     

人细胞间黏附分子-1的真核细胞表达与鉴定

目的 构建人细胞间黏附分子-1(ICAM-1)真核表达载体PcDNA3.1(-)-ICAM-1,并在真核细胞COS-7中表达.方法 设计特异性引物,用PCR方法扩增ICAM-1全编码区基因片段,将其连接人真核表达载体pcDNA3.1(-),并通过酶切进行鉴定.用脂质体转染法将真核表达载体pcDNA3.1(-)-ICAM-1转染COS-7细胞,通过免疫荧光和Western印迹分析人ICAM-1蛋白在COS-7细胞中的表达情况.结果 PCR扩增得到人ICAM-1的cDNA片段大小为1800 bp,重组质粒经酶切鉴定和DNA序列分析确定得到真核表达载体peDNA3.1(-)-ICAM-1.荧光显微镜下可见转染重组质粒的COS-7细胞膜上存在荧光分布,而转染空质粒的细胞未见荧光分布.Western印迹检测发现转染重组质粒的细胞存在外源性的人ICAM-1表达,而转染空质粒的则未见ICAM-1表达.结论 成功构建了人ICAM-1真核表达载体,ICAM-1高效表达在转染的真核细胞COS-7表面,为进一步建立稳定表达ICAM-1的COS-7细胞株以及研究ICAM-1及其受体的生物学功能提供了条件.     

人VMAT_2基因RNA探针制备及其在COS-7细胞中的表达

本研究目的在于制备人 型囊泡单胺转运体 (VMAT2 )基因的反义和正义 RNA探针 ,以检测 VMAT2 基因能否在真核细胞表达。从携带 p GEM-Easy-T-VMAT2 克隆载体中通过限制性酶切反应得到 VMAT2 基因 ,与 p BK-RSV载体重组构建真核表达载体 p BK-RSV-VMAT2 ;分别以 T7和 T3聚合酶制备反义和正义探针 ,通过斑点杂交检测探针浓度。转染猴肾成纤维细胞COS-7,原位杂交及免疫荧光细胞化学检测 VMAT2 的表达。结果证明 ,反义和正义探针浓度分别为 80 ng/μl及 12 0 ng/μl;原位杂交及免疫组织化学证实重组的真核表达载体 p BK-RSV-VMAT2 在 COS-7的表达阳性率为 (10 .6± 1.2 ) %。本研究结果表明获得 VMAT2 基因反义链及正义链 RNA探针 ,并检测到 VMAT2 基因在真核细胞中表达     

pVAX1-IL-4/SYN-B融合质粒的构建及表达

目的构建含人白介素4(human IL-4,hIL-4)基因与人α-突触核蛋白(humanα-synuclein,hα-syn)B细胞表位基因的真核表达质粒,并研究其在COS-7细胞内的表达。方法RT-PCR扩增人IL-4基因后,通过基因重组技术将其与α-synuclein蛋白B细胞表位基因融合,在两者之间引入柔性短肽(GSGGGSG)。将融合产物克隆到真核表达载体PVAX1上,利用电泳和测序鉴定融合质粒的大小、方向和序列。采用脂质体转染法,将融合质粒转入COS-7细胞中,用Western blotting技术检测其表达。结果电泳和测序结果与预期一致,并命名为PVAX1-IL-4/SYN-B;质粒转染COS-7细胞株成功,并且能在细胞内高效表达。结论成功构建PVAX1-IL-4/SYN-B融合质粒,并在哺乳动物COS-7细胞中高效表达,为研究融合质粒在帕金森病动物模型中的免疫效果奠定了基础。     

抗TfR-scFv-EGFP融合蛋白的构建与表达

目的:抗转铁蛋白受体单链抗体(TfR-scFv)-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建与表达.方法:设计两对引物引入连接肽(Gly4Ser)3以及酶切位点HindⅢ和BamH Ⅰ,采用重叠延伸PCR扩增与构建具有前导肽的L-VH-Linker-VL单链抗体基因,亚克隆至pEGFP-N1,转染COS-7细胞,倒置相差荧光显微镜下观察荧光蛋白表达,流式细胞术(FCM)检测细胞分泌上清与乳腺癌细胞MCF-7及黑色素瘤细胞A375结合活性.结果:测序表明获得了正确的L-VH-Linker-VL单链抗体基因序列;亚克隆至pEGFP-N1后,表达载体转染COS-7细胞,经荧光显微镜观察转染细胞,及通过流式细胞术(FCM)检测细胞分泌上清,证实抗TfR-scFv-EGFP融合蛋白在转染细胞中分泌性表达,并能够与天然高表达TfR的细胞特异性结合.结论:抗TfR-scFv-EGFP融合蛋白真核表达载体构建成功,其表达产物具有与TfR阳性细胞结合的活性.     

人上皮细胞黏附分子融合蛋白真核表达载体的构建、表达及初步鉴定

目的 :构建pIg EpCAM及pEGFP EpCAM真核表达载体 ,并在COS7细胞中表达。方法 :用PCR扩增EpCAMcDNA ,酶切后分别与pIg及pEGFP两种载体连接 ,用脂质体法转染COS7细胞。用免疫沉淀法检测pIg EpCAM的表达产物 ;用荧光显微镜观察EpCAM GFP的表达。结果 :DNA序列测定的结果显示 ,pIg EpCAM及pEGFP EpCAM载体的构建正确。免疫沉淀的结果显示 ,转染pIg EpCAM的COS7细胞的培养上清中含有相对分子质量 (Mr)为 6 5 0 0 0的融合蛋白 ,该蛋白与抗人IgGFc段的mAb具有良好的免疫反应性。荧光显微镜观察可见 ,转染空载体pEGFP的COS7细胞中绿色荧光均匀地分布于胞质和胞核 ;而转染pEGFP EpCAM的COS7细胞中绿色荧光主要分布于细胞表面。结论 :成功地构建了两种EpCAM的真核表达载体 ,并在COS7细胞中表达 ,为EpCAM的功能研究创造了条件 ,并为制备抗EpCAM的mAb提供了免疫原     

pcDNA3.1/hIL-18真核表达载体的构建及表达

目的 :构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/IL 18,并在哺乳动物细胞COS 7和Rlc310中进行瞬时和稳定性表达。方法 :从含hIL 18基因的中介载体 pGEM TEasy( pGEM T/hIL 18)中 ,以限制性内切酶酶切方法获得目的片段 ,克隆入真核表达质粒 pcDNA3.1( )中。以脂质体法转染COS 7和Rlc310细胞 ,用RT PCR检测IL 18mRNA的水平 ,免疫组化染色法检测蛋白表达。结果 :构建了hIL 18基因的重组真核表达质粒pcDNA3.1/IL 18,并可在哺乳动物细胞中瞬时、稳定表达 ,获得了可稳定表达hIL 18基因的Rlc310细胞株。结论 :pcDNA3.1/IL 18的构建及表达 ,为IL 18抗肿瘤作用的研究奠定了基础     

杜氏利什曼原虫LACK基因真核表达重组质粒及其在真核细胞中的表达

利什曼原虫的 L ACK抗原是利什曼原虫活性蛋白激酶 C受体同源物 ,是一种新发现的抗原蛋白。我们以本实验室的重组质粒 T- L ACK为模板 ,PCR扩增获得 L ACK基因 ,与真核表达载体 pc DNA3.1( )定向重组 ,重组质粒经酶切和 PCR分析 ,含有约 95 0 bp的 L ACK基因 ,成功构建含有 L ACK基因的真核表达重组质粒 pc D-NA3- L ACK。将此重组质粒转染 COS- 7细胞 ,通过 RT- PCR及免疫荧光检测 L ACK基因在真核细胞中的表达。实验结果显示转染了重组质粒的 COS- 7细胞 ,其 RT- PCR及免疫荧光检测均呈阳性反应 ,证实重组质粒 pc DNA3-L ACK能在 COS- 7细胞中有效表达 L ACK蛋白。     

抗人肿瘤坏死因子α嵌合抗体的研制

目的：研制抗人肿瘤坏死因子(rTNF—α)嵌合抗体。方法：以具有中和TNF—α活性的鼠源性单抗(Z12)的轻、重链可变区基因，构建人—鼠嵌合抗体基因的表达载体，并转染COS7细胞。用RT—PCR、ELISA、免疫印迹及体外中和rTNF—α活性实验，分别对瞬时表达的抗rTNF—α嵌合抗体(CZ12)的细胞培养上清进行检测：结果：①瞬时转染后，细胞系经RT—PCR检测有人—鼠嵌合抗体mRNA的转录：②ELISA和Western blot检测表明，CZ12与TNF—α产牛特异性反应，并识别相对分子质量(Mr)为17000的TNF—α。③竞争抑制实验中，CZ12能竞争抑制Z12与rTNF—α的特异惟结合，④体外中和实验汪实，CZ12能中和TNF—α对L929细胞的毒性。结论：成功地研制具有中和活性的人—鼠嵌合抗体CZ12。     

抗阿尔茨海默病Aβ人-鼠嵌合抗体基因的真核载体构建和表达

目的 通过基因工程抗体技术构建和表达抗β-淀粉样多肽(Aβ)人-鼠嵌合抗体,减低鼠源单克隆抗体在临床应用中引起的人体免疫排斥反应.方法从分泌抗Aβ1-42鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株中提取总RNA,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增鼠源性抗体全长基因,并通过Blast对其序列进行分析;利用重组PCR技术拼接重轻链可变区及人IgG1的恒定区基因,并对重链Fc段进行定点突变以降低排斥反应;分别构建人-鼠嵌合基因重轻链表达载体,用脂质体法将其同时导入COS-7细胞中表达,并利用ELISA和免疫组织化学(SP法)对分泌的抗体功能和性质进行初步鉴定.结果 Blast比对分析结果显示克隆的基因序列符合小鼠抗体基因序列,将可变区基因与人IgG1的恒定区基因拼接以及Fc定点突变后,成功构建了嵌合抗体的真核表达载体,并实现真核表达;ELISA和免疫组织化学方法证实了所分泌抗体的人源性和与Aβ的结合特异性.结论成功地构建和表达了抗阿尔茨海默病Aβ人-鼠嵌合抗体,为其在阿尔茨海默病的临床诊治中应用和进一步改造奠定了基础.     

SEDL基因及其突变体真核表达载体的构建与鉴定

目的构建SEDL基因及其突变体与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体的融合表达质粒pEGFP-C3-SEDL并获得表达。方法分别提取X连锁迟发性脊柱骨骺发育不良(SEDT)患者和正常对照外周血淋巴细胞RNA,RT-PCR方法扩增SEDL基因cDNA,双酶切后克隆至pEGFP-C3空载体,构建表达质粒pEGFP-C3-SEDL。双酶切和DNA测序鉴定后,转染COS-7细胞,通过流式细胞仪和荧光显微镜观察重组蛋白表达情况。结果 DNA测序显示重组真核表达载体pEGFP-C3-SEDL构建成功,SEDL基因c.370-371ins A突变位点被成功克隆到突变体重组质粒中。荧光倒置显微镜观察证实重组质粒均能在细胞内进行蛋白表达。结论 SEDL基因及其突变体真核表达载体的成功构建为其进一步研究SEDL基因突变致SEDT的分子机制奠定了基础。     

大鼠热休克蛋白72基因真核表达载体构建及在COS7细胞中的表达

背景：体外克隆、表达热休克蛋白,尤其正常时少量或不表达,而应激时大量表达的热休克蛋白72对研究其缺血再灌注损伤中的作用尤为重要。 目的：构建热休克蛋白72基因真核表达载体并于COS7细胞内表达,为HSP72蛋白免疫调节功能的研究奠定基础。 方法：采用RT-PCR技术从BABL/C大鼠肝细胞中扩增出热休克蛋白72 cDNA,经限制性核酸内切酶消化后,插入真核表达载体pcDNA3.1(+)的相应酶切位点,并将重组质粒转染COS7细胞,进行基因表达鉴定。 结果与结论：重组质粒插入基因序列检测证实为热休克蛋白72 cDNA,并能在COS7细胞稳定表达。成功构建热休克蛋白72真核表达载体,并于COS7细胞中成功转录与表达。     

9.1C3胞内抗体基因的克隆及其对9.1C3 分子表达的抑制作用

目的 获得9．1C3胞内抗体基因的真核表达载体,观察胞内抗体对9．1C3分子表达的抑制作用,为进一步研究9．1C3分子对NK细胞功能的影响打下基础。方法 设计引物,以9．1C3 ScFv基因为模板进行PCR扩增,引入蛋白质内质网定位所需的信号肽、KDEL以及作为表达检测标记的Etag序列。回收纯化PCR产物,酶切后连接到pUC19载体上,并进行序列测定。序列正确后切下胞内抗体基因片段,重组到真核表达载体pRc/CMV中,酶切鉴定后用DEAE－dextran方法瞬时转染真核细胞COS7,用胞内染色和Western blot方法检测胞内抗体的表达。接着用Lipofectamine把胞内抗体基因转入9．1C3阳性的Jurkat细胞,用FCM观察胞内抗体对9．1C3分子表达的影响。结果 DNA序列测定证明,通过PCR成功地为9．1C3 ScFv引入了内质网定位所需的信号肽、KDEL及E－tag序列,成功地构建了胞内抗体真核表达载体,通过胞内染色方法和Western blot证明胞内抗体在COS7中得到表达。转入Jurkat细胞后发现胞内抗体能下调9．1C3分子的表达水平。结论 以9．1C3 ScFv基因为模板PCR扩增得到9．1C3胞内抗体基因,并构建了真核表达载体。     

人KIR2DL1-Ig融合蛋白在COS-7细胞的表达

目的：获得人KIR2DL1分子(killer lg—like receptor 2DL1)胞外区与人IgG Fc段的融合蛋白。方法：从人外周血单个核细胞中提取总RNA，通过RT—PCR扩增编码KIR2DL1胞外段cDNA，经Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后，定向插入真核细胞表达载体CD51negl中。构建的重组真核表达载体CD51negl—KIR2DL1。经酶切分析和测序鉴定后，通过DEAE—dextran／ehloroquine法转染COS—7细胞：瞬时表达后，取培养上清液经亲和层析、ELISA、SDS—PAGE及Western印迹，鉴定融合蛋白的表达及其免疫学活性。结果：序列测定证实，该重组表达载体含有正确的KIR2DL1胞外区基因序列。重组真核表达载体CD5lnegl—KIR2DL1转染COS—7细胞后，ELISA法检测细胞培养上清中有融合蛋白的表达。SDS—PAGE结果显示，该融合蛋白的相对分子质量(Mc)约为73000。Western印迹结果证实，该蛋白能被特异性单克隆抗体(mAb)EB6所识别。结论：KIR2DL1—Ig融合蛋白表达载体成功构建并在COS—7细胞中获得功能性表达，为KIR2DL1的功能及其配体MHC的研究奠定了基础。     

Ⅰ型人免疫缺陷病毒gag-gp120嵌合基因核酸疫苗的构建与鉴定

目的：构建含Ⅰ型人免疫缺陷病毒(HIV-1)gag—gp120嵌合基因核酸疫苗的表达质粒。方法：将gag和gp120连接后的嵌合基因插入到真核表达载体pVAX1中，构建真核表达质粒pVAXGE。用脂质体法将构建的重组质粒转染Hela细胞72h后，取转染的Hela细胞进行RT—PCR检测和和Dot—ELISA分析。结果：重组质粒转染细胞的总RNA中，可扩增出目的基因的转录产物。Dot-ELISA的结果显示，目的基因在Hela细胞内得到表达。结论：成功地构建了表达gag—gp120嵌合基因的核酸疫苗质粒，为HIV—1核酸疫苗的制备奠定基础。