热休克诱导小鼠肝细胞表达热休克蛋白70的研究

目的：研究热休克恢复期小鼠肝细胞热休克蛋白（ＨＳＰ７０）的表达。方法：小鼠分别为４０、４２、４４、４６℃热休克处理３０ｍｉｎ,恢复８ｈ;４６℃热休克处理３０ｍｉｎ,然后分别于热休克后２－７２ｈ取肝,以免疫组化方法观察ＨＳＰ７０的表达,并用体视学方法对阳性肝细胞体密度进行定量分析。结果：４２、４４、４６℃均能诱导肝细胞表达ＨＳＰ７０,以４６℃组小鼠阳性肝细胞密度最大;４６℃热休克后８－１２ｈ为ＨＳＰ     

人热休克蛋白70基因的原核表达

目的 表达人热休克蛋白70（HSP70）并进行鉴定。方法 用PCR方法扩增人HSP70基因片段，经T-A克隆法克隆到载体pUCm-T中，并进行DNA测序，将人HSP70基因片段从载体pUCm-T中酶切后，构建重组表达载体pGEX-4T-1-HSP70，并转化大肠杆菌JM109，用IPTG诱导，收集细菌，菌体裂解后进行SDS-PAGE及Western blot检测。结果 人HSP70基因的PCR产物约为1.9kb。序列测定结果证实，所获目的序列与文献[3]报道的相一致，经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切鉴定证实。人HSP70基因已成功地克隆到表达载体pGEX-4T-1中，构建的表达载体pGEX-4T-1-HSP70，能很好地在大肠杆菌中表达相对分子质量（Mr)为96000并具有抗原特性的融合蛋白，结论 成功地克隆并表达了HSP70基因，为研究HSP70的结构。功能与临床应用提供了必要条件。     

结核杆菌热休克蛋白70基因的克隆与原核表达

目的：克隆结核杆菌热休克蛋白70(TBhsp70)基因，并在大肠杆菌中表达。方法：利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Hsp70基因，并将其克隆到pUC19中，进行测序。将得到的Hsp70基因克隆到表达载体pGEX-4T-1中，构建重组表达质粒pGEX—TBhsp70，在大肠杆菌DH5α中进行表达。结果：成功地克隆了TBhsp70基因。DNA测序证实，与GenBank公布的序列一致。含pGEX-TBhsp70基因表达质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后，能够表达相对分子质量(MR)约为96000的融合蛋白。结论：获得了TBhsp70基因，成功地构建了原核表达质粒pGEX-TBhsp70，并在大肠杆菌得到表达，为其相关研究奠定了一定的基础。     

MAGE-1与结核杆菌HSP70融合基因的构建及原核表达

目的 构建结核杆菌HSP70与肿瘤抗原MAGE-1的融合基因，在大肠杆菌中进行表达，并通过GST纯化系统进行分离纯化。方法 利用PCR方法扩增TBHSP70基因，经测序后连入原核表达载体pGEX-4T-1，再通过PCR方法扩增MAGE-1基因片段(289～927bp)，测序后插入TBHSP70基因的5’端，构建MAGE-1与TBHSP70的N端融合基因原核表达质粒pGEX-MAGE-1-TBHSP70，含有该质粒的大肠杆菌DH5a进行诱导表达和分离纯化。结果 成功地扩增了TBHSP70基因与MAGE-1基因片段，测序结果表明与GenBank公布的序列一致；成功地构建了pGEX-MAGE-1-TBHSP70原核表达质粒，含有该质粒的大肠杆菌DH5α经IPTG诱导后表达一Mt约为125000的蛋白，经GST融合蛋白表达系统纯化，得到了MAGE-1与TBHSP70的融合蛋白。结论 成功地获得了MAGE-1与TBHSP70的融合蛋白，为研究MAGE-1-TBHSP70融合蛋白在肿瘤免疫治疗中的作用奠定了基础。     

热休克蛋白70与肝癌

热休克蛋白70(HSP70)广泛存在于细胞中,在应激刺激后过表达,可以参与蛋白质的合成及受损蛋白的修复。HSP70在肝癌治疗中的作用日益受到重视:利用其特异性和免疫原性,靶向治疗肝癌。并且可以利用其分子伴侣的特点,作为肝癌疫苗,诱发机体抗肝癌的免疫反应。HSP70在肝癌治疗中已初显成效,但也存在很多问题,需要更加深入的研究。总之,HSP70在肝癌治疗中有很大的应用前景。     

热休克蛋白70融合肿瘤抗原基因的DNA疫苗研究进展

在抗肿瘤免疫治疗中,已经发展了多种形式的热休克蛋白70(HSP70)相关治疗性疫苗,这些疫苗主要包括蛋白疫苗、肽疫苗、细胞疫苗及DNA疫苗等,其中HSP70融合DNA疫苗凭借其自身的优势引起人们的关注。它不但可诱导高效、持久的抗肿瘤免疫应答,而且可以维持免疫记忆。本文就HSP70在肿瘤治疗性DNA疫苗中的作用和应用作一综述。     

小鼠不同组织器官热休克蛋白70表达的研究

目的　研究热休克恢复期小鼠大脑、垂体、肾、肾上腺中HSP70的表达规律。　方法　昆明系小鼠随机分为对照组和实验组。实验组动物 :1 分别以 40℃ ,42℃ ,44℃ ,46℃热休克处理 30min ,恢复 2h和 8h ;2 以46℃热休克处理 30min ,恢复 2、4、6、8、12、2 4、48、72h ,以免疫组织化学结合图像分析技术观察HSP70的表达。　结果　 1 42℃ ,44℃ ,46℃均能诱导肾、肾上腺表达HSP70 ,44℃、46℃可诱导大脑、垂体表达HSP70 ,但均以 46℃组阳性免疫反应面积最大 (P <0 0 1) ;2 HSP70的合成高峰在大脑和垂体为热休克恢复期 4～ 8h(P <0 0 1) ,肾和肾上腺为 8～ 12h(P <0 0 1) ;3 HSP70阳性免疫反应定位于大脑神经膜和郎飞结 ,垂体神经膜 ,肾小管、肾上腺网状带和束状带细胞质 ,肾中HSP70阳性免疫反应肾小管较肾小球强 ,肾髓质较肾皮质强。　结论　热休克反应中不同组织器官HSP70的表达存在明显差异性 ;HSP70合成迅速且降解缓慢 ;大脑和垂体有较强的耐热能力     

热体克蛋白70在肝细胞癌中的表达及其意义

目的　探讨热休克蛋白 70 (HSP70 )在肝细胞癌 (HCC)中的表达及其意义。方法　采用免疫组化技术对 4 4例HCC和癌旁组织中HSP70的表达进行检测。结果　HCC中HSP70阳性率明显高于癌旁组织 (阳性率分别为 6 8.2 %和2 7.3% ,χ2 =7.3,P <0 .0 1)。HSP70表达与癌周淋巴细胞浸润 (χ2 =3.2 ,P >0 .0 5 )和转移 (χ2 =2 .3,P >0 .0 5 )无关 ,但与癌组织分化程度有关 (χ2 =4 .5 ,P <0 .0 5 )。结论　HSP70的异常表达与HCC的发生、发展有关 ,且可能是HCC发展、恶化的重要标志     

旋毛虫Hsp70与Ts87融合蛋白的构建表达及鉴定

本文构建并表达了旋毛虫热休克蛋白70（Ts－Hsp70）与排泄分泌抗原Ts87的融合蛋白,并对融合蛋白进行纯化和免疫学鉴定。本研究采用限制性内切酶EcoRⅠ酶切位点将目的基因Ts－Hsp70与Ts87相连接,插入pET28－a （＋）质粒,转入大肠埃希菌BL21（DE3）中诱导表达、纯化,获得的融合蛋白rTs－Hsp70－Ts87用Western blot的方法鉴定。经PCR、酶切鉴定、测序分析,结果显示,目的基因片段大小为2721 bp,构建的重组质粒与预期相符。经IPTG诱导表达,通过镍离子柱层析纯化复性后得到可溶的融合蛋白rTs－Hsp70－Ts87,其相对分子质量约为100 kDa; Western blot结果显示,该蛋白可被抗His标签单抗、 rTs－Hsp70免疫血清、 rTs87免疫血清识别。以上结果表明,本研究成功构建并表达了融合蛋白rTs－Hsp70－Ts87,为进一步研究rTs－Hsp70－Ts87的免疫保护性,开发新的有效抗旋毛虫病的疫苗奠定基础。     

细胞外热休克蛋白70及其生物学功能

热休克蛋白(HSP)一直被描述为一种细胞内蛋白质在胞内发挥一系列生物学作用,参与细胞内蛋白质的折叠、装配、降解和修复过程。近年来,有研究发现HSP70能被主动释放到胞外,成为细胞外HSP70(extracellular HSP70,eHSP70),但关于其功能尚不清楚。循环HSP70水平与多种疾病进程密切相关。有研究发现暴露于物理和心理刺激源作用下,HSP70可能通过脂筏或Exosome介导的分泌途径释放到细胞外,作为一种生物活性因子影响多种疾病的进程。     

重组共表达载体pSLC-IRES-IL-2的构建及在COS-7细胞中的表达

目的:构建共表达质粒pSLC-IRES-IL-2,并在COS-7细胞中表达。方法:根据人SLC和IL-2cDNA的序列分别设计、合成引物,构建以内部核糖体进入位点(IRES)相连的SLC和IL-2基因的真核表达质粒pSLC-IRES-IL-2,用电穿孔法以共表达质粒转染COS-7细胞。用Westernblot检测SLC和IL-2的表达。结果:Westernblot检测表明,以重组共表达质粒pSLC-IRES-IL-2转染的COS-7细胞能表达SLC和IL-2,表达产物的Mr同预期的结果相一致。结论:成功地构建SLC和IL-2基因的共表达质粒,以其转染COS-7细胞后,能分泌性表达SLC和IL-2,为肿瘤基因治疗的研究提供一定途径。     

抗人HBsAg单链抗体基因的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的：构建抗人HBsAg单链抗体基因，并分析其在COS—7细胞中的表达。方法：以从噬菌体抗体库中筛选的抗HBsAg的Fab抗体基因为模板，分别扩增其轻、重链可变区(VL、VH)基因，通过重组PCR方法将轻、重链可变区基因用连接肽(C1y4Ser)3的编码序列连接，并引入前导肽编码序列，构建具有L—VH—Linker—Vl结构的单链抗体基因。将所构建的单链抗体基因克隆入绿色荧光蛋白(GFP)融合表达载体pEGFP—N3，并转染COS—7细胞进行表达。结果：经测序表明，前导肽、连接肽、VL及Vh的序列正确。酶切鉴定证实，成功地构建了GFP基因融合表达载体。瞬时转染COS—7细胞后，通过荧光显微镜观察证实有ScFv融合蛋白的表达。转染细胞的培养上清浓缩后，进行SDS—PAGE及westem blot分析，可检出ScFv融合蛋白的分泌性表达。培养上清的间接ELISA检测证实，所表达的单链抗体具有与HBsAg结合的特异性。结论：成功地构建了抗人HBsAg单链抗体基因，并可在COS—7细胞中分泌性表达。     

hdll1ext-Fc融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的：构建人dlll^ext(human delta-likel extraeellular region)-Fe融合蛋白的真核表达载体pEF-BOSneo-hdlll^ext-Fc，并在COS-7细胞中进行表达。方法：从人脑cDNA文库中PCR扩增人delta-likel胞外段，通过DNA重组构建真核表达载体pEF-BOSneo-hdlll^ext-Fe。瞬时转染COS-7细胞，应用RT-PCR、细胞免疫荧光技术和双抗体夹心ELISA，检测融合蛋白的表达。结果：成功地构建了真核表达载体pEF-BOSneo-hdlll^ext-Fc。以重组载体转染COS-7细胞后，RT-PCR结果显示delta-likel胞外段与IgG1 Fe在mRNA水平正确拼接；细胞免疫荧光染色呈阳性反应；夹心ELISA法检测到细胞培养上清中有融合蛋白的表达。结论：成功地扩增了人delta-likel胞外段，构建了pEF-BOSneo-hdlll^ext-Fc真核表达载体，并在COS-7细胞中获得表达，为下一步研究奠定了基础。     

pEGFP-HSP70重组质粒的构建及其在大鼠神经干细胞中的表达*

 目的：构建重组pEGFP-HSP70质粒并观察其在神经干细胞中的表达。方法：采用RT-PCR方法从SD胎鼠肝组织中获取总RNA,扩增出热休克蛋白70（HSP70）基因的全序列cDNA,并克隆到含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的真核表达载体pEGFP-C2上, 经EcoRⅠ、BamHⅠ酶切及测序分析对重组质粒pEGFP-HSP70进行鉴定。采用Nucleofector转染技术将重组质粒pEGFP-HSP70转染至胎鼠神经干细胞中。结果：(1) 胎鼠HSP70 cDNA序列被正确地克隆到真核表达载体pEGFP-C2中, 成功构建重组大鼠pEGFP-HSP70质粒。荧光强度检测空质粒转染组（pEGFP-C2组）、pEGFP-HSP70组与对照组相比显著升高（P<0.01）;pEGFP-HSP70组内24 h的荧光强度与7 d（P<0.05）、14 d（P<0.05）和21 d（P<0.01）相比降低明显。(2) 转染后HSP70的表达在1 d（P<0.05）、7 d（P<0.01）和14 d（P<0.01）与对照组相比均明显升高。结论：神经干细胞可直接作为基因靶细胞, 能有效地表达重组质粒pEGFP-HSP70,且HSP70在神经干细胞中的表达与转染时间密切相关。     

人CD81的克隆及在COS-7细胞中的表达

目的 从人外周血淋巴细胞中克隆出CD81基因，构建真核表达质粒，并在COS－7细胞中进行表达。方法 分离外周血淋巴细胞，提取细胞总RNA，采用RT－PCR扩增CD81基因。将CD81基因克隆至载体pcDNA3.1( )中，进行酶切及测序鉴定。以质粒pcDNA3.1-CD81转染COS－7细胞进行瞬时表达，并用免疫细胞化学染色法和流式细胞术检测蛋白的表达。结果 RT－PCR产物已插入载体pcDNA3.1( )构建成真核表达质粒pcDNA3.1-CD81。经双酶切和测序鉴定表明，克隆出的人CD81全长编码序列同GenBank收录的序列一致，并且真核表达质粒的构建正确。以脂质体转染COS－7细胞后，用免疫细胞化学染色法和流式细胞术检测表明，细胞可表达人CD81。结论 成功地构建真核表达载体pcDNA3.1-CD81，为进一步研究HCV和CD81的相互作用，以及建立可能的HCV细胞感染模型打下了基础。     

人IL-24基因的克隆及在COS-7细胞中的表达

目的：克隆人IL-24基因，构建真核表达载体，在COS-7细胞中进行表达，并检测重组表达蛋白hIL-24的抗肿瘤活性。方法：分离人外周血单个核细胞，提取细胞总RNA，采用RT-PCR技术克隆人IL-24基因，将其重组于pUC19，双脱氧末端终止法测定其核苷酸序列，构建真核重组表达载体pcDNA3-hIL-24，进行双酶切和PCR鉴定，以质粒pcDNA3-hIL-24转染COS-7细胞进行瞬时表达，用RT-PCR检测mRNA表达，并用MTT法、TUNEL法和流式细胞术检测其诱导肿瘤细胞凋亡的活性。结果：成功获得621bp的人IL-24基因，测序正确，经双酶切和PCR鉴定真核表达质粒构建正确，以脂质体转染COS-7细胞后，用RT-PCR法、MTT法、TUNEL法和流式细胞术检测表明COS-7细胞可表达hIL-24，且所表达的人IL-24具有较强的诱导A549肺腺癌细胞凋亡的作用。结论：人IL-24基因的瞬时表达和凋亡效应的初步研究已获成功，为研究人IL-24抗肿瘤的分子机制和临床应用提供了实验依据．     

hdll1~(ext)-Fc融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的 :构建人dll1ext(humandelta like1extracellularregion) Fc融合蛋白的真核表达载体pEF BOSneo hdll1ext Fc,并在COS 7细胞中进行表达。方法 :从人脑cDNA文库中PCR扩增人delta like1胞外段 ,通过DNA重组构建真核表达载体 pEF BOSneo hdll1ext Fc。瞬时转染COS 7细胞 ,应用RT PCR、细胞免疫荧光技术和双抗体夹心ELISA ,检测融合蛋白的表达。结果 :成功地构建了真核表达载体 pEF BOSneo hdll1ext Fc。以重组载体转染COS 7细胞后 ,RT PCR结果显示delta like1胞外段与IgG1Fc在mRNA水平正确拼接 ;细胞免疫荧光染色呈阳性反应 ;夹心ELISA法检测到细胞培养上清中有融合蛋白的表达。结论 :成功地扩增了人delta like1胞外段 ,构建了 pEF BOSneo hdll1ext Fc真核表达载体 ,并在COS 7细胞中获得表达 ,为下一步研究奠定了基础     

人FL基因高效真核表达载体的构建及其在COS—7细胞中的表达

目的：构建人FL真核表达载体－pIRS1neo/hFL,观察其在COS－7细胞 中的表达。方法：采用RT－PCR方法自人白血病细胞系TF－1中克隆可溶型FL（Flt3-ligand)cDNA片段,测序鉴定正确后,插入真核表达载体-pIRES1 neo中的EcoR Ⅰ和BamHI位点,构建hFL真核表达载体－pIRES1neo/hFL。脂质体介质法将其转染COS－7细胞,72h以RT－PCR检测转染细胞中外源hFL基因的转录、ELISA法及脐血CD34^ 细胞增殖实验测定转染细胞上清上hFL的含量和活性。结果：酶切鉴定表明成功构建了重组真核表达载体－pIRES1neo/hFL;外源hFL基因能在转染细胞中有效转录;ELISA法测得72h后培养上清中的hFL含量为每24小时251ng/10^6 cells,并且分泌的hFL具有良好的生物学活性。结论：构建hFL真核表达载体在COS－7细胞中具有良好的表达活性。     

人Nanog基因的克隆及其在COS-7L细胞中的表达

目的 :克隆人Nanog基因 ,构建其真核表达载体 ,并观察其在哺乳动物细胞COS 7L中的表达。方法 :利用HE2 93细胞的人基因组DNA为模板 ,以LA PCR技术 ,扩增Nango的基因 ,定向克隆到带Flag标签的pCMV载体中 ,测序后 ,挑选序列正确的真核表达质粒pFlag Nanog转染COS 7L细胞。用抗Flag标签的抗体 ,进行Westernblot和间接免疫荧光染色法检测Nango蛋白的表达。结果 :从人基因组DNA中克隆到序列正确的Nanog全长编码序列。所构建的Nanog质粒在COS 7L细胞中获得高效表达。结论 :人Nanog基因的克隆、真核表达载体的构建及在COS 7L中的表达均获得成功 ,为进一步研究其功能 ,尤其是探讨其在神经干细胞中的作用奠定了基础。