siRNA干扰水通道蛋白3和磷脂酶D2表达对A431细胞株生长和凋亡的影响

目的 探讨水通道蛋白3（AQP3）和磷脂酶D2（PLD2）在人皮肤鳞状细胞癌细胞株A431细胞增殖和凋亡中的作用。 方法 针对AQP3和PLD2各设计3条siRNA,用脂质体转染法将siRNA导入A431细胞。用荧光定量PCR方法筛选出其中干扰效果最佳的AQP3-siRNA和PLD2-siRNA,Western印迹法检测转染后AQP3和PLD2蛋白的表达水平。将A431细胞分为5组：正常培养组（不加任何处理）,转染试剂组（加入转染试剂）,阴性对照组（转染阴性对照siRNA）,AQP3-siRNA组（转染AQP3-siRNA）,PLD2-siRNA组（转染PLD2-siRNA）。CCK8法检测AQP3和PLD2表达下调对A431细胞增殖的影响,膜联蛋白-V-异硫氰酸荧光素/碘化丙锭双染色后用流式细胞仪检测细胞凋亡。 结果 用脂质体转染法将siRNA导入A431细胞后,AQP3和PLD2的mRNA和蛋白表达均较阴性对照组明显下降。与阴性对照组比较,转染AQP3-siRNA后A431细胞增殖在24、48、72 h均受到明显抑制（t值分别为24.10、11.00、9.54,均P < 0.01）;转染PLD2-siRNA后,A431细胞增殖同样在24、48、72 h均受到明显抑制（t值分别为30.47、7.02、8.73,均P < 0.01）。与阴性对照组比较,转染AQP3-siRNA后,A431细胞凋亡在48 h和72 h均明显增加（t值分别为11.36、20.91,均P < 0.01）;转染PLD2-siRNA后,A431细胞凋亡在72 h明显增加（t值为4.86,P < 0.05）。 结论 siRNA下调AQP3或PLD2表达可抑制A431细胞增殖,诱导A431细胞凋亡。     

RNA干扰神经突起导向因子 Netrin-1表达下调对鳞状细胞癌SCL-1细胞的影响

目的 探讨神经突起导向因子 Netrin-1表达下调对皮肤鳞状细胞癌（鳞癌）SCL-1细胞增殖、凋亡和迁移的影响。方法 脂质体2000将Netrin-1 siRNA和对照siRNA转染皮肤鳞癌SCL-1细胞。将细胞分为对照1组（未处理组）、对照2组（siRNA对照组）、实验组（Netrin-1 siRNA组）。Western印迹检测转染Netrin-1 siRNA后SCL-1细胞Netrin-1蛋白的表达。人胆囊收缩素/缩胆囊素8肽（CCK-8）ELISA试剂盒分析细胞增殖的变化,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。Western 印迹检测caspase-3、caspase-9及MMP-2的表达。结果 Netrin-1 siRNA明显下调SCL-1细胞中Netrin-1蛋白的表达。Netrin-1表达下调明显抑制SCL-1细胞的增殖和诱导细胞凋亡,增加caspase-3和caspase-9的表达,同时可显著抑制MMP-2的表达。结论 Netrin-1表达下调可介导鳞癌细胞增殖抑制、增高细胞凋亡率和降低细胞迁移能力。     

下调αB-晶状体蛋白的表达对应激条件下人皮肤角质形成细胞存活和凋亡的影响

目的探讨下调αB-晶状体蛋白(αB-crystallin)对人皮肤角质形成细胞(Ha Ca T)在应激条件下的存活和凋亡的影响。方法设计并筛选特异性靶向下调αB-crystallin表达的siRNA;噻唑蓝法检测siRNA下调αB-crystallin表达对过氧化氢(H2O2)处理的细胞相对存活率的影响;流式细胞术检测siRNA下调αB-晶状体蛋白表达对H2O2诱导的细胞凋亡率的影响。结果筛选获得可有效下调αB-crystallin表达的siRNA(si-CRYAB-1);si-CRYAB-1下调αB-crystallin表达可降低H2O2处理后的Ha Ca T细胞存活率(P0.01),并明显增加H2O2诱导的Ha Ca T细胞凋亡率(P0.05)。结论下调αB-crystallin的表达后,人角质形成细胞在氧化应激条件下的存活能力明显减弱。αB-crystallin可能具有抗人角质形成细胞凋亡的作用。     

HPA-siRNA促进皮肤鳞癌A431细胞凋亡并抑制其增殖、侵袭和迁移的机制

目的探讨乙酰肝素酶(HPA)小干扰RNA(siRNA)对皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响及其机制。方法将体外培养的A431细胞分为空白对照组(未转染)、阴性对照组(转染NC-siRNA)和HPA沉默组(转染HPA-siRNA),RT-PCR检测各组细胞中HPA mRNA的表达,MTT法、流式细胞仪和Transwell分别检测细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移;Western blot检测细胞中HPA蛋白和PI3K/AKT信号通路相关蛋白PCNA、MMP-2、Bcl-2、p-AKT和AKT的表达。结果与空白对照组相比,HPA沉默组细胞在2～3 d生长过程中的A值明显下降,侵袭和迁移细胞数均明显减少,HPA mRNA和HPA、PCNA、MMP-2、Bcl-2、p-AKT蛋白的表达水平均明显降低,细胞凋亡率明显升高(P0.05);而空白对照组与阴性对照组间差异无统计学意义(P0.05)。结论 HPA siRNA可抑制A431细胞增殖、侵袭和迁移并诱导细胞凋亡,其作用机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路的活化有关。     

siRNA沉默肾上腺髓质素基因对黑素瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨小干扰RNA（siRNA）沉默肾上腺髓质素（ADM）基因对黑素瘤细胞系A375增殖和凋亡的影响。方法 实时荧光定量-PCR（qRT-PCR）检测干扰效果,并选出干扰效果最好的siRNA。用筛选出的最有效siRNA转染A375细胞为实验组;转染非特异序列的细胞为阴性对照组,未转染的细胞为空白对照组。免疫细胞化学法蛋白水平检测干扰效果;噻唑蓝法（MTT）分别测定沉默ADM基因 24、48 h后A375细胞增殖的变化;流式细胞仪（FCM）检测干扰ADM基因48 h后A375细胞的凋亡情况。结果 qRT-PCR显示ADM-siRNA-2干扰效果最好。免疫细胞化学结果显示转染ADM-siRNA-2后ADM蛋白的表达显著低于未转染组和阴性对照组。MTT结果显示,转染ADM-siRNA-2的细胞24、48 h吸光度A值为0.389 ± 0.0375,0.469 ± 0.0330,低于空白对照组 （ 0.574 ± 0.0733、0.685 ± 0.0154）和阴性对照组（0.548 ± 0.0376、0.676 ± 0.0374）,差异均有统计学意义（P值均 < 0.05）,空白对照组和阴性对照组比较,差异无统计学意义（P值均 ＞ 0.05）。FCM检测显示转染ADM-siRNA-2组的细胞早期凋亡率为（20.200 ± 6.046）%,高于空白对照组（1.667 ± 0.340）%和阴性对照组（4.587 ± 1.294）%,差异有统计学意义（P值均 < 0.05）,空白对照组和阴性对照组比较,差异无统计学意义（P值均 ＞ 0.05）。结论 siRNA沉默ADM基因对A375增殖有抑制作用;而对凋亡则有明显促进作用。     

尖锐湿疣角质形成细胞中陷窝蛋白1的表达与细胞增殖和凋亡的相关性

目的 探讨陷窝蛋白1在尖锐湿疣角质形成细胞中的表达及其与角质形成细胞增殖和凋亡的相关性.方法 免疫组化En Vision法和TUNEL技术检测40例尖锐湿疣皮损组织和10例健康人包皮组织中角质形成细胞陷窝蛋白1、增殖细胞核抗原的表达和细胞凋亡,计算陷窝蛋白1平均吸光度、增殖指数和凋亡指数,比较两组之间的差异,并分析尖锐湿疣组中陷窝蛋白1表达与增殖指数、凋亡指数的相关性.针对陷窝蛋白1基因设计3条siRNA,用脂质体转染法将siRNA导人HaCaT细胞,用荧光定量PCR方法筛选出于扰效果最佳的siRNA,转染HaCaT细胞为实验组,转染非特异序列的细胞为阴性对照组,未转染的细胞为空白对照组.Western印迹和免疫荧光检测转染48 h后陷窝蛋白1的表达水平;MTS法分别测定干扰陷窝蛋白1基因24、48、72 h后HaCaT细胞增殖的变化;流式细胞仪(FCM)检测干扰陷窝蛋白1基因48 h后HaCaT细胞的凋亡情况.结果 尖锐湿疣角质形成细胞中陷窝蛋白1的表达(0.042±0.021)显著低于正常包皮组织(0.181±0.075),差异有统计学意义(t=5.843,P＜0.001).尖锐湿疣皮损中角质形成细胞的增殖指数(65.63％±19.86％)和凋亡指数(24.12％±10.86％)均显著高于正常包皮组织(23.51％±4.00％,3.13％±1.12％),两组差异有统计学意义(t=12.440、11.970,均P＜ 0.001).尖锐湿疣组陷窝蛋白1表达与增殖指数呈显著负相关(r=-0.798,P＜0.05),与凋亡指数呈显著正相关(r=0.825,P＜ 0.05).荧光定量PCR显示siRNA-2在浓度25 nmol/L下抑制效果最佳.Western印迹和免疫荧光显示,转染siRNA 48 h后,实验组陷窝蛋白1的表达显著低于空白对照组和阴性对照组(P＜0.05).MTS结果显示,实验组细胞24、48和72 h时的A值分别为0.563±0.013、0.628±0.006和0.811±0.018,高于空白对照组(0.541±0.009、0.575±0.012和0.722±0.004)和阴性对照组(0.536±0.006、0.571±0.015和0.719±0.002),差异有统计学意义(均P＜0.05),空白对照组和阴性对照组间差异无统计学意义(P＞0.05).实验组HaCaT细胞凋亡率为(8.90％±0.06％),低于空白对照组(20.59％±0.87％)和阴性对照组(20.64％±0.09％),差异有统计学意义(均P＜ 0.05),空白对照组和阴性对照组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 尖锐湿疣角质形成细胞中陷窝蛋白1表达下降,可能与角质形成细胞增殖加快、细胞凋亡减少有关.     

黑素细胞中PINK1的表达及在氧化损伤中的作用

目的明确正常人黑素细胞PIG1中PINK1的表达,探讨PINK1在黑素细胞氧化损伤中的作用。方法 (1)采用逆转录实时定量PCR(RT-qPCR)及免疫印迹法(WB),检测PIG1黑素细胞中PINK1的mRNA及蛋白的表达水平;(2)不同浓度H2_O_2处理PIG1细胞24h,CCK-8法测定细胞增殖活力,确定H_2O_2最适浓度;(3)设计并合成3对PINK1干扰片段(siRNA)转染PIG1细胞,采用RT-qPCR法筛选干扰效率最高的siRNA;(4)实验分组:对照组、Mock组、NC组、转染组。细胞转染48h后,再加入H_2O_2处理24h,观察各组细胞形态,CCK-8法测定细胞增殖活力。结果 (1)在PIG1黑素细胞中检测到PINK1 mRNA及蛋白的表达;(2)黑素细胞增殖活力呈H2O2浓度依赖性降低,0.6mmol/L H_2O_2组降低至(49.02±2.40)%,接近IC50,故以此浓度作用24h建立氧化损伤模型;(3)与Mock组相比,PINK1-siRNA3转染48h干扰效率最高(90%);(4)与对照组相比,PINK1-siRNA3转染组树突回缩及变圆悬浮的细胞明显增多,转染组细胞增殖活力明显降低(P0.01)。结论本研究首次明确了PINK1在正常人黑素细胞中的表达,下调PINK1可加重H_2O_2所致的黑素细胞形态学改变及活力降低,表明PINK1对黑素细胞具有一定的保护性作用。     

小干扰RNA沉默KIAA0101的表达对皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞增殖和迁移的影响

目的 探讨KIAA0101蛋白表达下调对皮肤鳞状细胞癌（SCC）SCL-1细胞增殖和细胞侵袭能力影响的分子机制。方法 将KIAA0101 siRNA和对照siRNA分别转染SCL-1细胞,将SCL-1细胞分为3组：未转染组、对照siRNA组和KIAA0101 siRNA组。Western印迹检测3组细胞中KIAA0101蛋白的表达,CCK-8试剂检测细胞增殖,用Boyden小室检测细胞侵袭能力, Western印迹检测细胞增殖和细胞侵袭相关蛋白的表达。结果 KIAA0101 siRNA组中KIAA0101蛋白的相对表达量为0.062 ± 0.095,显著低于未转染组（0.359 ± 0.044）和对照siRNA组（0.379 ± 0.025）,P < 0.05,SCL-1细胞的增殖和侵袭能力亦降低（P < 0.05）。此外,与未转染组和siRNA对照组相比,KIAA0101 siRNA组中p21蛋白表达显著上升,而基质金属蛋白酶2表达显著下调（P < 0.05）。结论 KIAA0101表达下调介导的SCL-1细胞增殖抑制和侵袭能力降低与p21和基质金属蛋白酶2表达变化相关。 【关键词】 癌,鳞状细胞; 基因,KIAA0101; RNA,小分子干扰     

HDAC6siRNA对SCL-1细胞增殖和细胞凋亡的影响及分子机制

目的研究组蛋白去乙酰化酶6(histonedeacetylase6,HDAC6)siRNA对皮肤鳞状细胞癌(简称鳞癌)SCL-1细胞增殖和凋亡的影响及分子机制。方法将SCL-1细胞分为三组:A为未处理组;B为siRNA对照组;C为HDAC6siRNA转染组。利用脂质体2000分别介导HDAC6siRNA和对照siRNA至SCL-1细胞中,利用Westernblot研究HDAC6siRNA对SCL-1细胞中HDAC6蛋白表达的影响。采用CCK-8试剂和流式细胞术分别研究HDAC6siRNA对SCL-1细胞增殖和细胞凋亡的影响,进一步利用WesternBlot技术分析细胞增殖相关蛋白P21和细胞凋亡相关蛋白Bcl-2及Bax的表达。结果 HDAC6siRNA转染组中HDAC6蛋白表达显著低于未处理组和siRNA对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。与未处理组和siRNA对照组相比,HDAC6siRNA转染组中SCL-1细胞的增殖明显受到抑制(P<0.05)。HDAC6siRNA转染组中SCL-1细胞的早期凋亡率明显高于未处理组和siRNA对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。HDAC6siRNA转染组中Bcl-2表达明显下调,而P21和Bax表达显著上升。结论 HDAC6可能在皮肤鳞癌的发生发展中发挥重要作用,下调皮肤鳞癌中HDAC6的表达有望成为有用的分子治疗靶点。     

RNA干扰下调PLK1基因对恶性黑素瘤细胞侵袭和失巢凋亡的影响

目的 探讨RNA干扰技术下调PLK1基因对恶性黑素瘤细胞侵袭的影响和可能机制。 方法 用PLK1小干扰核糖核酸分子（siRNA）转染人恶性黑素瘤A375细胞后,分别用实时定量PCR和 Western 印迹法检测PLK1mRNA和蛋白表达,Transwell方法检测细胞侵袭能力,以平板集落形成方法了解癌细胞集落形成情况,分别用琼脂糖凝胶电泳和TUNEL方法检测癌细胞失巢凋亡情况。 结果 恶性黑素瘤A375细胞经PLK1 siRNA转染后,PLK1 mRNA和蛋白表达明显下调;siRNA转染组癌细胞生长明显受到抑制。与空白对照组和脂质体对照组比较,siRNA细胞转染组侵袭性明显下降。失巢凋亡检测发现,琼脂糖凝胶电泳出现明显的梯度图谱。TUNEL结果显示,PLK1 siRNA可诱导恶性黑素瘤A375细胞凋亡,siRNA细胞转染组较空白对照组和脂质体对照组凋亡指数明显升高［3.86% ± 0.35%（3.125 nmol/L siRNA组）,7.35% ± 0.36%（6.250 nmol/L siRNA组）,17.56% ± 0.38%（12.500 nmol/L siRNA组）比1.15% ± 0.25%和1.18% ± 0.22%）,均P < 0.01］。 结论 PLK1 siRNA可抑制恶性黑素瘤细胞的侵袭,其机制可能与诱导失巢凋亡有关。     

靶向生存素的小干扰RNA抑制人黑素瘤M14细胞系生长的研究

目的 探讨小干扰RNA（siRNA）对人黑素瘤M14细胞系生存素基因表达的抑制作用及对细胞凋亡、增殖和侵袭的影响。方法 构建靶向生存素的siRNA表达质粒,用脂质体法转染M14人黑素瘤细胞。RT-PCR检测M14细胞生存素mRNA的表达,Western印迹检测生存素蛋白的表达,流式细胞仪检测AnexinV标记的凋亡细胞,噻唑蓝（MTT）法分析细胞增殖,Transwell法分析侵袭能力。结果 与M14细胞和转染空载体的M14细胞比较,转染siRNA的表达质粒可以明显抑制生存素基因在转录和翻译上的表达。M14组和空载体组几乎无凋亡细胞,siRNA表达质粒组的凋亡率明显增加（χ2 ＝ 31.55,P < 0.01）。细胞增殖抑制率（63.6% ± 1.6%）也明显增加,同时Transwell细胞侵袭实验显示,siRNA表达质粒转染组抑制作用显著。结论 靶向生存素的siRNA表达质粒可以特异性抑制生存素的表达,显著抑制肿瘤细胞增殖和侵袭并诱导细胞凋亡。     

生存素小分子干扰RNA对皮肤鳞状细胞癌A431细胞生存素基因表达及生物学功能的影响

目的 探讨生存素小分子干扰RNA（siRNA）对皮肤鳞状细胞癌A431细胞生存素基因表达及细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭力的影响。方法 培养的A431细胞分为3组：生存素siRNA组、阴性对照组和空白对照组,分别用50.0 nmol/L脂质体包裹的生存素基因序列特异性siRNA、无关序列siRNA阴性脂质体及预制囊泡转染。实时定量反转录-聚合酶链反应（RT?PCR）、Western印迹法分别检测A431细胞生存素mRNA及蛋白的表达。采用MTT比色法检测细胞增殖,流式细胞仪膜联蛋白Ⅴ/碘化丙锭双染法检测细胞凋亡,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭力,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果 转染后48 h,生存素siRNA组、阴性对照组、空白对照组A431细胞中生存素mRNA水平分别为0.56 ± 0.15、0.88 ± 0.37、0.90 ± 0.43,蛋白表达水平分别为0.59 ± 0.04、0.86 ± 0.05、0.91 ± 0.07,差异均有统计学意义（F = 276.67、243.61,均P < 0.001）,且生存素siRNA组生存素mRNA和蛋白表达水平均显著低于阴性对照组和空白对照组,差异均有统计学意义（P < 0.05）,而阴性对照组与空白对照组间差异无统计学意义（均P > 0.05）。重复测量方差分析显示,转染生存素siRNA能抑制A431细胞增殖（F = 13.19,P = 0.004）,且生存素siRNA组A431细胞增殖抑制率明显高于阴性对照组和空白对照组（均P < 0.05）,而阴性对照组与空白对照组比较,差异无统计学意义（P > 0.05）。转染后24 h, 3组间A431细胞凋亡率差异有统计学意义（F = 83.97,P = 0.002）,且生存素siRNA组A431细胞凋亡率显著高于阴性对照组（P < 0.05）和空白对照组（P < 0.05）,而阴性对照组与空白对照组间差异无统计学意义（P > 0.05）。转染后48 h,生存素siRNA组G2/M期细胞比例显著高于阴性对照组（P < 0.05）和空白对照组（P < 0.05）,而生存素siRNA组A431细胞迁移数及侵袭数均显著低于空白对照组（均P < 0.05）和阴性对照组（均P < 0.05）。结论 生存素序列特异性siRNA能抑制A431细胞生存素基因表达和细胞增殖,促进细胞凋亡,抑制细胞迁移和侵袭,提示生存素可成为皮肤鳞状细胞癌基因治疗的靶点。     

翻译控制肿瘤蛋白在鳞状细胞癌和细胞株A431及SCL-1中的表达

目的 探讨翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)在人皮肤鳞状细胞癌(SCC)组织及其细胞株A431及SCL-1中的表达,观察其对SCC细胞凋亡及增殖的影响.方法 免疫组化法观察TCTP蛋白在SCC组织中的表达.Western印迹法检测TCTP蛋白在SCC细胞株A431及SCL-1中的表达情况.继而构建针对编码TCTP的基因TPT1的siRNA序列,通过脂质体转染法转入A431细胞中,RT-PCR法检测TPT1的表达,Western印迹法检测TCTP蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞凋亡率,MTT法检测A431细胞增殖情况.结果 免疫组化结果显示,在SCC中存在着TCTP的高表达,且其表达水平与癌组织的分级有着正相关关系(P＜0.05).Western印迹结果证实,在A431细胞及SCL-1细胞株中都存在着TCTP的表达,以A431细胞表达为最高.荧光检测siRNA转染效率可达到90％ ～ 95％.RT-PCR及Western-Blot结果显示合成的siRNA可以有效下调A431细胞中TPT1及TCTP的表达(P＜0.05).结论 合成的siRNA可以有效下调A431细胞中TP及TCTP的表达,这种下调可引起A431细胞凋亡率的上升和细胞增殖的抑制.     

HINT1对人黑素瘤细胞A375增殖和凋亡的影响

目的 探讨HINTl基因对人黑素瘤细胞A375增殖、凋亡的影响及其作用机制.方法 应用构建的peDNA.3.1/mye-His(-)A-HINTl真核表达载体,建立稳定转染且能高表达HINTI的A375细胞模型.用M1rr法检测细胞增殖活性变化,流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡率,TUNEL法检测细胞凋亡.分光光度法检测Caspase 3,Caspase 8及Caspase 9的相对活性.Western印迹法检测bcl-2、bax、细胞色素C及p53的表达.结果 与空载体-A375及未转染A375细胞相比,HINT1-A375细胞生长速度明显减慢(P<0.05);Gl期细胞增多(73.17%±3.99%,F=25.65,P<0.05),S期细胞减少(16.75%±1.62%.F=75.48,P<0.01),细胞出现明显的晚期凋亡(23.57%±9.58%,F=11.71,P<0.01). TUNEL法显示凋亡阳性细胞百分比(12%±1%)显著增高(F=358.02,P<0.01);Caspase 9(0.45±0.03,F=135.62,P<0.01)和Caspase 3表达(0.46±0.04,F=90.28,P<0.01)升高.凋亡相关蛋白bax、细胞色素C及p53表达增加,bel-2表达降低.结论 高表达H1NT1可抑制A375细胞的增殖,促进其凋亡,细胞周期出现G_1期阻滞,提示HINT1可能是人黑素瘤的抑癌基因.     

p21小干扰RNA对低浓度过氧化氢诱导的黑素细胞提前衰老和黑素传递的影响

目的:探讨小干扰RNA(siRNA)抑制p21表达对低浓度过氧化氢(H_2O_2)诱导的黑素细胞提前衰老的影响,以及黑素细胞提前衰老与黑素传递功能间的关系。方法:p21 siRNA序列转染黑素细胞,采用荧光显微镜、实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)及western blot检测抑制效率。将正常人黑素细胞分为对照组(阴性siRNA转染处理)、p21 siRNA组(p21 siRNA转染处理)、阴性siRNA+H_2O_2组(阴性siRNA转染24 h后加入400μmol/L H_2O_2处理)及p21 siRNA+H_2O_2组(p21 siRNA转染24 h后加入400μmol/L H_2O_2处理)。采用β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老;EdU细胞增殖检测细胞增殖能力;western blot检测各组p21和树突调节蛋白[RhoA、Rac1及细胞分裂周期蛋白42(Cdc42)]表达;免疫荧光检测细胞骨架蛋白和黑素小体分布。结果:p21siRNA转染黑素细胞后明显抑制p21 mRNA和蛋白表达(P0.05)。与阴性siRNA+H_2O_2组比较,p21 siRNA+H_2O_2组β-半乳糖苷酶染色阳性率降低、细胞增殖能力增加及p21蛋白表达降低(P0.05)。与对照组比较,阴性siRNA+H_2O_2组树突负性调节因子Rho A蛋白表达升高,而正性调节因子Rac1及Cdc42蛋白表达均降低,且细胞骨架蛋白及黑素小体荧光强度均降低(P0.05)。经p21siRNA预处理后,p21 siRNA+H_2O_2组较阴性siRNA+H_2O_2组Rho A蛋白表达降低,Rac1和Cdc42蛋白表达均增高,且细胞骨架蛋白及黑素小体荧光强度均增高(P0.05)。结论:低浓度H_2O_2诱导提前衰老的黑素细胞存在黑素传递功能障碍,p21 siRNA可改善低浓度H_2O_2诱导的黑素细胞提前衰老以及受损的黑素传递功能。     

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的表达抑制对A431细胞增殖和细胞周期的影响

目的研究葡萄糖?6?磷酸脱氢酶（G6PD）表达下调对皮肤鳞状细胞癌（鳞癌）细胞增殖和细胞周期的影响。方法正常培养人永生化上皮细胞HaCaT、皮肤鳞癌SCL?1和A431细胞,采用Western印迹法检测细胞中G6PD蛋白的表达。当A431细胞生长至85%~90%融合时,将siRNA对照（siRNA对照组）和G6PD siRNA（G6PD siRNA组）分别转染A431细胞,未转染的A431细胞则为未转染组。Western印迹法检测3组不同处理的A431细胞中G6PD蛋白及细胞周期蛋白D1、CDK4的表达,CCK?8法检测3组A431细胞的增殖情况,流式细胞仪分析3组A431细胞周期的变化。结果正常培养的2株皮肤鳞癌SCL?1和A431细胞中G6PD蛋白的表达水平（分别为0.308±0.023和0.643±0.046）均显著高于HaCaT细胞（0.100±0.019）,且A431细胞显著高于SCL?1细胞（均P<0.05）。A431细胞G6PD siRNA组G6PD、细胞周期蛋白D1和CDK4蛋白的表达（0.134±0.027、0.154±0.017、0.166±0.017）显著低于未转染组（0.425±0.029、0.344±0.024、0.330±0.020）和siRNA对照组（0.444±0.033、0.350±0.027、0.348±0.018）,差异均有统计学意义（P<0.05）。G6PD siRNA组在24~96 h各时间点的细胞增殖活性均明显低于siRNA对照组和未转染组（P<0.001）,而siRNA对照组与未转染组间细胞增殖差异无统计学意义（均P>0.05）。G6PD siRNA组G0/G1期A431细胞比例显著高于siRNA对照组及未转染组（P<0.001）,而G6PD siRNA组S期A431细胞比例又显著低于siRNA对照组及未转染组（P<0.001）。结论G6PD可能在调控皮肤鳞癌细胞增殖和细胞周期中发挥重要作用。     

靶向角蛋白17基因的小干涉RNA对角质形成细胞增生与凋亡的影响

目的利用RNA干涉技术诱导角蛋白17(K17)基因沉默,观察其对角质形成细胞(KC)增生和凋亡等生物学活性的影响。方法合成两条含有针对人K17mRNA序列的正义和反义寡核苷酸,退火后与表达载体psilencer3.1-H1neo相连接,经鉴定后转染人角质形成细胞系HaCaT,分别以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹法(W est-ern b lot)检测转染细胞K17 mRNA与蛋白水平的改变,用流式细胞仪检测转染细胞的细胞周期及凋亡情况,并通过透射电镜观察细胞的凋亡。结果成功构建了靶向人K17基因的siRNA表达载体psilencer3.1/K17,检测到瞬时转染的HaCaT细胞中K17的蛋白水平及mRNA水平均明显下降。流式细胞仪检测表明转染细胞的细胞周期发生了明显的G1期阻滞并证实凋亡的存在,电镜下观察到凋亡小体。结论对于增生活跃的角质形成细胞,K17的表达对其增生、分化和凋亡等生物学活性具有重要影响。靶向K17的siRNA能够抑制角质形成细胞增生,诱导其凋亡。     

MiR-29a通过调节MMP2参与前列腺癌DU145细胞的增殖和侵袭能力的研究

目的研究miR-29a是否调节MMP2的表达参与前列腺癌DU145细胞的迁移、侵袭和增殖过程。方法通过实时荧光定量(qRT-PCR)和免疫印迹法(WB)检测在正常前列腺上皮RWPE-1细胞和激素非依赖性前列腺癌DU-145细胞内miR-29a、MMP2 mRNA和蛋白的表达水平。采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-29a与MMP2 3′-UTR的调控关系。miR-29a mimics(模拟剂)、 miR-29a inhibitor(抑制剂)和miR-NC (对照)转染DU145细胞后分组为、miR-29a mi模拟组、miR-29a in抑制组和miR-NC对照组,检测各组细胞中miR-29a、MMP2 mRNA和蛋白的表达;细胞划痕实验和侵袭实验(Transwell小室)检测各组细胞迁移和侵袭;增殖实验(CCK-8)实验检测各组细胞增殖。结果与RWPE-1细胞相比,DU145细胞中miR-29a的表达减少、MMP2 mRNA和蛋白的表达增加。miR-29a模拟剂转染细胞后,miR-29a表达升高,MMP2表达降低;miR-29a抑制剂转染细胞后,miR-29a表达降低,MMP2表达升高。双荧光素酶实验验证了MMP2为miR-29a的靶基因。MiR-29a过表达能抑制DU145细胞的迁移、侵袭和增殖;MiR-29a抑制表达能促进DU145细胞的迁移、侵袭和增殖。结论在前列腺癌DU145细胞中,miR-29a调节MMP2的表达,进而参与细胞的迁移、侵袭和增殖过程。     

FGD4/细胞分裂周期蛋白42通路调控良性前列腺增生-1细胞增殖、凋亡的机制

目的 探讨FGD4/细胞分裂周期蛋白42(Cdc42)通路对良性前列腺增生(BPH)-1细胞增殖、凋亡的影响。方法 选取2017年8月至2018年8月空军军医大学西京医院收治的行尿道前列腺电切术的42例BPH患者的BPH组织作为前列腺增生组,选择同期同一医院收治的行膀胱癌根治术的25例膀胱癌患者的正常前列腺组织作为正常前列腺组;并体外培养BPH-1细胞,分为对照组、siRNA NC组(转染siRNA NC)、FGD4 siRNA组(转染FGD4 siRNA)、Cdc42 NC组(转染FGD4 siRNA+pcDNA3.1)和pcDNA3.1-Cdc42组(转染FGD4 siRNA+pcDNA3.1-Cdc42)。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测组织和细胞中FGD4 mRNA、Cdc42 mRNA的表达水平;采用CCK-8法检测细胞增殖情况;采用流式细胞仪检测细胞凋亡及周期分布情况;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测细胞上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素(IL)-6和IL-8水平;采用蛋白印迹(Western blot)法检测FGD4、Cdc42、B...     

CD147 siRNA转染对银屑病患者外周血T淋巴细胞CD147的表达及细胞增殖、活化的影响

目的 探讨转染CD147 siRNA对寻常性银屑病患者外周血T淋巴细胞中CD147的表达及细胞增殖、活化的影响。方法 将化学合成的CD147 siRNA通过电转染至寻常性银屑病患者外周血T淋巴细胞中，采用半定量RT-PCR方法检测细胞在转染96 h内CD147 mRNA的表达变化。采用噻唑蓝法检测转染CD147 siRNA对T淋巴细胞增殖的影响。采用流式细胞仪检测转染CD147 siRNA对T淋巴细胞活化标记分子CD25表达的影响。结果 与未转染组比较，转染CD147 siRNA 24 h后，T淋巴细胞的CD147 mRNA表达水平显著下降（P ＜ 0.05），至转染后48 h降低最为明显（P ＜ 0.01），而转染后96 h恢复至接近转染前水平（P ＞ 0.05）；转染CD147 siRNA 24 h、48 h、72 h后，T淋巴细胞的增殖水平显著下降，抑制率分别为（44.5 ± 3.13）％、（50.7 ± 3.5）％、（53.98 ± 4.15）％（P值均 ＜ 0.01），CD25的表达也明显降低（P值均 ＜ 0.01）。结论 CD147分子与银屑病外周血T淋巴细胞的增殖、活化能力相关，可能是一种新的银屑病治疗靶分子。