肿节风中落新妇苷及柚皮苷的HPLC分析

目的采用HPLC法测定中药材肿节风中黄酮类成分落新妇苷及柚皮苷的量。方法采用Diamonsil C18色谱柱(200 mm×4.6 mm,5μm);以乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)水溶液为流动相,采用梯度洗脱:0~10 min,A-B(10∶90);10~25 min,A-B(10∶90)→A-B(15∶85):25~35 min,A-B(15∶85)→A-B(20∶80)→B保留15min;体积流量采用程序控制0~10 min,0.5 mL/min;10~25 min,0.5→0.75 mL/min;25~35 min,0.7→0.8 mL/min;保留15 min;检测波长为290 nm;柱温:30℃。结果落新妇苷及柚皮苷的平均回收率分别为97.3%、95.6%,RSD分别为2.2%、2.3%;线性范围分别为0.028~0.27μg(r=0.999 6),0.030~0.29μg(r=0.999 5)。结论该方法简便、灵敏、快速、准确、重现性好,为肿节风药材的质量控制及合理开发利用提供了科学依据。     

HPLC．DAD法测定银屑优化颗粒中芍药苷、甘草苷、落新妇苷、迷迭香酸和甘草酸

目的建立同时测定银屑优化颗粒中芍药苷、甘草苷、落新妇苷、迷迭香酸和甘草酸5种成分的HPLC-DAD测定方法。方法采用高效液相色谱波长切换法。Lichrospher C18色谱柱（250mm×4．6mm,5μm）;流动相为乙腈-0．1％磷酸溶液,梯度洗脱;检测波长在230、254、290nm切换;体积流量为1mL／min;柱温为30℃;进样体积10μL。结果5种成分的线性关系良好。芍药苷在69．12~691．20ng线性关系良好,平均加样回收率为97．45％,RSD值为1．54％;甘草苷在39．02~390．20ng线性关系良好,平均加样回收率为97．10％,RSD值为1．90％;落新妇苷在30．03~300．30ng线性关系良好,平均加样回收率为99．98％,RSD值为1．22％;迷迭香酸在7．82~78．20ng线性关系良好,平均加样回收率为100．83％,RSD值为1．36％;甘草酸在31．09～310．90ng线性关系良好,平均加样回收率为97．52％,RSD值为1．49％。结论本方法具有方法简便、快速、准确等特点,可同时测定银屑优化颗粒中5种活性成分。     

大鼠口服芍苓消银片后血液中芍药苷、落新妇苷、迷迭香酸、异嗪皮啶、甘草苷的药物动力学研究

芍药苷、落新妇苷、迷迭香酸、异嗪皮啶和甘草苷为芍苓消银片中主要成分,为给其后期剂型及临床用药方案设计奠定基础,该文建立了这5种成分血药浓度含量测定方法并进行大鼠体内药物动力学的研究。血药浓度测定采用HPLC测定,菲罗门C₁₈色谱柱（4.6 mm×250 mm,5 μm）,甲醇-乙腈-0.05%甲酸梯度洗脱,流速0.8 mL·min^-1,检测波长275 nm。样品处理采用固相萃取法。大鼠灌胃芍苓消银片浸膏后分别于不同时间采血,测定血药浓度。实验结果显示5种成分可基线分离,芍药苷、异嗪皮啶、落新妇苷、迷迭香酸和甘草苷分别在2.48~248,0.213 6~21.36,0.531~53.1,0.704~70.4,0.253~25.3 mg·L^-1线形关系良好。5种成分均可吸收入血,均为快速吸收、快速消除的模式。该文建立的方法快速、准确,可用于含同类成分的制剂的体内分析,芍苓消银片中主要成分吸收消除较快,适合制备成缓控释制剂,普通制剂可能需要1 d服药4~6次。     

肿节风总黄酮对巨核系细胞体外扩增的作用研究

目的: 探讨肿节风总黄酮(ZJF-HT)对小鼠骨髓巨核系细胞扩增的影响。 方法: 采用液体培养和半固体集落培养,观察ZJF-HT及其含药血清对成熟巨核细胞及巨核系祖细胞集落扩增的作用。 结果: 与模型组相比,ZJF-HT≥125 μg·mL^-1能使成熟巨核细胞数和巨核系祖细胞集落数增多(P<0.05);ZJF-HT含药血清在0.39%~6.25%体积浓度范围能增加成熟巨核细胞数,在0.20%~6.25%范围内能显著增加巨核系祖细胞集落数(P<0.01)。 结论: ZJF-HT及其含药血清均能促进巨核系细胞的体外扩增。     

肿节风总黄酮促进巨核细胞增殖的效应动力学研究

目的 探讨肿节风总黄酮对体外培养巨核细胞增殖的影响及其效应动力学。方法 肿节风总黄酮（0.39 g·kg-1）单次灌胃给予正常SD大鼠,给药后不同时间点采血制备含药血浆。采用兔抗大鼠血小板相关抗体建立大鼠骨髓巨核细胞增殖障碍模型,并将不同时间点的含药血浆作用于该模型,以巨核细胞数、细胞上清液中血小板生成素（TPO）、转化生长因子-β1（TGF-β1）含量为效应指标,绘制时间-效应动力学曲线,计算相关动力学参数。结果 肿节风总黄酮含药血浆可以显著提升巨核细胞数,肿节风总黄酮对巨核细胞数、上清液中TPO及TGF-β1的效应半衰期分别为：495.52,665.13和537.46 min,达峰时间分别为：60,90和40 min,平均驻留时间分别为：224.60,242.37和231.10 min,其中巨核细胞数与TPO含量的效应曲线之间有较好的相关性,时间上稍有滞后现象。结论 肿节风总黄酮含药血浆可显著促进大鼠骨髓巨核细胞的增殖,可能与培养体系中TPO的浓度密切相关。     

土茯苓及其单体落新妇苷的免疫抑制作用

土茯苓性甘、淡,平和,归肝、胃经,有解毒、除湿、通利关节之功,在临床上应用广泛.近代药理研究表明土茯苓及单体落新妇苷具有选择性免疫抑制作用,这一特性对于细胞免疫依赖的自身免疫性疾病和变态反应性疾病的治疗具有重要意义.     

肿节风总黄酮对体外骨髓基质细胞-巨核细胞共培养体系的影响

目的:探索肿节风总黄酮对骨髓基质细胞-巨核细胞共培养体系中巨核细胞分化成熟,以及基质细胞状态的影响。方法:模拟骨髓微环境,建立KM小鼠骨髓基质细胞和巨核细胞共培养体系,实验分为空白对照组、阿糖胞苷模型组、二甲基亚砜(DMSO)对照组、肿节风总黄酮组7.80、3.90、1.95μg/ml剂量组,每组3个复孔。各组培养4天后分离巨核细胞进行涂片、染色、统计多倍体数目,流式细胞术分析巨核细胞CD61表达量,消化培养体系中贴壁的基质细胞,流式细胞术检测其凋亡情况,ELISA检测培养体系中TPO和SDF-1的含量。结果:与阿糖胞苷模型组相比,肿节风总黄酮7.80μg/ml和3.90μg/ml剂量组中多倍体巨核细胞数目显著增加,肿节风总黄酮7.80μg/ml剂量组巨核细胞CD61表达水平明显提高。肿节风总黄酮7.80μg/ml和3.90μg/ml剂量组显著降低基质细胞的凋亡率。肿节风总黄酮7.80、3.90、1.95μg/ml剂量组显著提高培养体系中TPO和SDF-1的含量。结论:肿节风总黄酮可能是通过抑制共培养体系中基质细胞凋亡促进"量"的增加,增进其分泌细胞因子TPO、SDF-1影响"质"的变化,改善骨髓微环境,促进巨核细胞分化成熟和产生更多的血小板。     

土茯苓及落新妇苷抗炎、镇痛、利尿作用研究

目的:探讨土茯苓及其有效成分落新妇苷除湿利关节作用.方法:采用利尿试验、炎症及疼痛模型进行药效学研究.结果:土茯苓时二甲苯所致小鼠耳肿胀、蛋清及角叉菜胶所致小鼠足肿胀均有明显抑制作用;落新妇苷能明显对抗尿酸钠所致大鼠痛风性关节炎,明显增加大鼠尿量,对醋酸所致小鼠扭体反应及热板引起的小鼠足痛有对抗作用.结论:土茯苓具有抗炎作用,落新妇苷具有利尿与镇痛作用.     

正交设计法优选土茯苓中落新妇苷及总黄酮的提取工艺

目的:研究超声法提取土茯苓中落新妇苷及总黄酮的最佳工艺条件。方法:采用正交试验法研究落新妇苷和总黄酮的提取工艺,其中落新妇苷含量用HPLC法测定,总黄酮含量用紫外分光光度法测定。结果:土茯苓中落新妇苷最佳提取工艺为加入甲醇30mL,超声提取15min,超声3次。总黄酮的最佳提取工艺为料液比1∶50,加入50%乙醇,超声提取60min。结论:所建立的方法简便、准确、重复性好,可用于土茯苓药材中落新妇苷及总黄酮的含量测定及其质量控制。     

土茯苓有效成分落新妇苷抑制PDGF-BB诱导的血管平滑肌细胞的增殖、迁移及表型转换

目的：探讨土茯苓有效成分落新妇苷对大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）的增殖、迁移及表型转换的影响及其可能的机制。方法：采用CCK-8法检测不同浓度（10、25、50μmol/L）落新妇苷对血小板衍生因子-BB（PDGF-BB）(20ng/ml)诱导的VSMCs增殖的影响;划痕实验用于检测落新妇苷对PDGF-BB（20ng/ml）诱导的VSMCs迁移能力影响;免疫印迹法检测落新妇苷作用后的PCNA、α-SMA、OPN、AMPK及其磷酸化蛋白表达水平;流式细胞术检测落新妇苷作用后对VSMCs凋亡的影响。结果：与对照组（NC）相比,落新妇苷显著抑制了PDGF-BB诱导的VSMCs增殖(^*P<0.05,^**P<0.01)、迁移、表型转换。此外,落新妇苷激活了腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信号。结论：我们首次发现落新妇苷可以显著抑制PDGF-BB诱导的VSMCs过度增殖和迁移,机制上,其可能与AMPK的激活有关。该研究为临床上血管介入术后再狭窄的防治提供了参考。     

肿节风总黄酮对免疫性血小板减少大鼠骨髓细胞微环境的影响

目的:通过建立免疫性血小板减少症(ITP)大鼠模型,研究肿节风总黄酮对模型大鼠血小板以及骨髓细胞微环境的影响。方法:将54只SD大鼠依据外周血小板数目随机均分为空白对照组、ITP模型组、肿节风总黄酮0.0945、0.0630、0.0315g/kg剂量组和阳性药物醋酸泼尼松龙组。除正常组外,每只大鼠于第1、3、4、6、7、8天腹腔注射兔抗大鼠血小板血清(APS)建立ITP大鼠模型,同时给予相应药物干预。第10天检测各组动物血小板数目,台酚蓝染色计算骨髓有核细胞活力,体外培养并观察骨髓基质细胞生长状况及形成集落数目。结果:与模型对照组比较,肿节风总黄酮0.0945、0.0630、0.0315g/kg剂量组和醋酸泼尼松龙组大鼠血小板数量均显著增加,肿节风总黄酮0.0945、0.0630、0.0315g/kg剂量组骨髓单核细胞活力、相同时间内基质细胞贴壁率均显著提高,肿节风总黄酮0.0945和0.0630剂量组成纤维细胞集落数目明显增多。结论:肿节风总黄酮可以提升ITP模型大鼠血小板数量,可能是通过影响骨髓基质细胞改善了骨髓细胞微环境,进而促进巨核细胞分化生成血小板。     

迷迭香酸对人结肠癌HCT-8细胞增殖和凋亡的影响及分子机制研究

目的研究迷迭香酸对人结肠癌HCT-8细胞增殖和凋亡的影响,并探究相关机制。方法采用CCK-8法检测不同浓度迷迭香酸作用不同时间后HCT-8细胞的增殖情况;根据CCK-8法结果确定迷迭香酸15、45、75μmol/L作用72 h,考察HCT-8细胞的凋亡和相关基因及蛋白的表达;通过流式细胞术检测HCT-8细胞的凋亡率;采用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)法检测p53、Bax和Puma基因的m RNA表达;通过Western blotting法检测p53、Bax、Puma和active Caspase-9的蛋白表达水平。结果迷迭香酸能够抑制HCT-8细胞的增殖,并呈时间和浓度依赖性。15、45μmol/L的迷迭香酸主要诱导HCT-8细胞早期凋亡(P0.01),75μmol/L的迷迭香酸主要诱导HCT-8细胞晚期凋亡(P0.01)。迷迭香酸可以使Puma的m RNA表达上调,并呈浓度依赖性;45、75μmol/L的迷迭香酸可以使p53和Bax的m RNA表达升高(P0.05)。迷迭香酸可以上调Puma、Bax和active Caspase-9的蛋白表达水平,并呈浓度依赖性;75μmol/L的迷迭香酸可以使p53的蛋白表达明显升高(P0.05)。结论迷迭香酸对HCT-8细胞具有明显的增殖抑制作用,并且是通过诱导凋亡实现的,促凋亡蛋白p53、Puma、Bax和active Caspase-9诱导了凋亡的发生。     

肿节风总黄酮对阿糖胞苷所致血小板减少动物模型骨髓基质细胞和巨核细胞的影响

目的:利用阿糖胞苷建立化疗所致血小板减少症小鼠模型,研究肿节风总黄酮对模型小鼠血小板以及骨髓微环境中基质细胞和巨核细胞的影响。方法:将60只小鼠依据外周血小板数目随机均分为空白对照组、阿糖胞苷模型组、肿节风总黄酮31.50、63.00、94.50 mg/kg剂量组和阳性药物醋酸泼尼松龙组。除正常组外,每只小鼠腹腔注射阿糖胞苷建立化疗所致血小板减少小鼠模型,同时给予相应药物干预。动态检测外周血小板数目,实验结束时检测骨髓有核细胞活力,观察体外培养骨髓基质细胞生长状况,观察统计骨髓石蜡切片中巨核细胞数目及多倍体比例,免疫组化检测骨髓中基质细胞TPO以及巨核细胞相应受体C-mpl的表达量。结果:与模型组相比,肿节风总黄酮63.00 mg/kg和94.50 mg/kg剂量组显著提升模型动物外周血小板数目,显著提高骨髓有核细胞活力和骨髓基质细胞体外生长贴壁情况,显著提高骨髓中巨核细胞数目,肿节风总黄酮94.50 mg/kg剂量组显著提高多倍体巨核细胞比例;肿节风总黄酮63.00、94.50 mg/kg剂量组极显著促进骨髓内巨核细胞周围基质细胞TPO以及巨核细胞中相应受体C-mpl的表达。结论:肿节风总黄酮能显著提升阿糖胞苷诱导血小板减少症动物外周血小板数目,可能是影响了骨髓基质细胞生长状况,以及促进其产生有利于巨核细胞增殖分化的细胞因子,经过TPO-C-mpl通路促进巨核细胞增殖、分化和形成血小板。     

槲皮素对骨髓间充质干细胞增殖和骨向分化的影响

目的:通过观察槲皮素对骨髓间充质干细胞增殖和骨向分化的影响,探讨其调控骨髓间充质干细胞及其防治骨质疏松症的作用机制。方法:运用全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,并通过形态学、流式细胞仪检测表面标志物及分化能力鉴定所取得的细胞;运用MTT法检测不同浓度槲皮素对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响,以确定其最佳促增殖剂量。实验分为空白组、槲皮素组、经典诱导组(地塞米松+β-甘油磷酸钠+维生素C),检测诱导分化过程中ALP活性和钙化结节数目,RT-PCR的方法检测BMP-2 mRNA的变化。结果:经MTT法检测,浓度为5μmol/L和10μmol/L的槲皮素组OD值较空白组明显升高;与空白组相比,槲皮素组与经典诱导组ALP活性及矿化结节均显著增加,并均可上调MSCs骨向分化过程中BMP-2 mRNA的表达。结论:槲皮素能促进骨髓间充质干细胞的增殖和骨向分化,可能是其促进骨折愈合、防治骨质疏松症的细胞学机制之一。     

Panax notoginseng saponins promotes proliferation and osteogenic differentiation of rat bone marrow stromal cells

Aim of the study

Panax notoginseng saponins (PNS) is the main effective component of Panax notoginseng, have various pharmacologic activities such as antioxidant, anti-inflammatory, and estrogen-like bioactivities, have been shown to be an effective agent on anti-osteoporosis. Bone marrow stromal cells (BMSCs) play a crucial homeostatic role in skeletal modeling and remodeling due to their capability to differentiate into osteooblasts. Whether PNS has effect on osteogenic differentiation of BMSCs are unknown.This study was designed to investigate the effects of PNS on the proliferation and osteogenic differentiation of BMSCs in vitro.

Materials and methods

When BMSCs cultivated in the basal medium or the osteogenic induction medium (OS with or without PNS), cell proliferation was analyzed using an MTT assay, the mineralization was assessed using Alizarin red S staining, the alkaline phosphatase activity was measured using a commercial kit, the mRNA level of osteogenic gene and PPARγ2 gene were determined using RT-PCR, the protein level of PPARγ2 was analyzed by Western blotting.

Results

BMSCs cultured in the basal medium with PNS caused a significant increase in proliferation. PNS treatment increased ALP activity, Alizarin red S staining and mRNA level of ALP, Cbfa 1, OC, and BSP, whereas decreased the mRNA level and protein expression of PPARγ2 during osteogenic induction. In addition, the effects of PNS treatment were dose-dependent relationship.

Conclusion

PNS could stimulate BMSCs proliferation and promote their osteogenic differentiation by up-regulation expression of osteogenic marker gene and down-regulation expression of adipogenic marker gene in a dose-dependent manner. Thus, PNS may play an important therapeutic role in osteoporosis patients by improving osteogenic differentiation of BMSCs.     

丹参多酚酸盐对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及血管内皮生长因子表达的影响

目的观察中药丹参多酚酸盐对SD大鼠骨髓间充质干细胞的增殖及血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响,以探讨其对促骨折愈合的可能机制。方法将0.5 mg/ml浓度丹参多酚酸盐与大鼠骨髓间充质干细胞共培养,对照组为无药物单位培养的大鼠骨髓间充质干细胞。培养48小时镜下观察细胞情况,1、3、5、7天行MTT检测细胞增殖情况。行实时荧光定量PCR检测方法,对培养7天的两组细胞的VEGF mRNA水平进行检测分析。结果共培养48小时后骨髓间充质干细胞生长密集程度明显优于对照组;MTT检测也显示实验组细胞增殖情况优于对照组;实验组VEGF mRNA表达高于对照组。结论丹参多酚酸盐能促大鼠骨髓间充质干细胞增殖,并提高其VEGF的表达。可能是其促骨折愈合的作用机制之一。     

松果菊苷含药血清诱导骨髓间充质干细胞成骨分化及BMP2表达的研究

目的:探讨松果菊苷含药血清促进大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的作用及可能的机制。方法:大鼠用松果菊苷(16mg/kg)灌胃4天后,取血清备用。采用全骨髓贴壁法培养大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代细胞分为8组:空白对照组、松果菊苷含药血清组(2.5%、5%、7.5%、10%、15%、20%)、经典成骨诱导组(10%FBS+10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠+10-8mol/L地塞米松+50μmol/L维生素C)。ELISA测定碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(BGP)的表达;免疫荧光细胞化学染色和Western blot检测BMP2蛋白的表达,RT-PCR检测BMP2mRNA的表达。结果:与经典成骨组相比,10%松果菊苷含药血清使BMSCs表达ALP(80.16U/L)和BGP(150.79 U/L)增强,BMP2免疫荧光、BMP2蛋白表达及BMP2mRNA的表达也明显增强。结论:松果菊苷含药血清可以诱导体外培养的骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,10%松果菊苷含药血清组的效果最佳,其作用机制与BMP2表达增加有关。     

大孔吸附树脂分离纯化草珊瑚总黄酮的工艺研究

目的研究大孔吸附树脂分离纯化草珊瑚总黄酮工艺,为草珊瑚总黄酮的工业化生产提供实验依据。方法以贵州产草珊瑚为原料,以草珊瑚总黄酮含量及回收率等为考察指标,选用大孔吸附树脂对草珊瑚总黄酮进行分离纯化,分别采用静态试验、动态试验等考察大孔树脂对草珊瑚总黄酮的分离纯化效果及影响因素。结果AB-8型大孔吸附树脂对草珊瑚总黄酮静态饱和吸附量为116.25mg·g-1(干树脂),洗脱率92.9%,动态饱和吸附量为94.5mg·g-1(干树脂),总黄酮回收率在96.1%、纯度在90%以上,是实验树脂中分离纯化草珊瑚总黄酮的最佳大孔吸附树脂。结论分离纯化草珊瑚总黄酮最佳工艺条件为:AB-8型大孔吸附树脂,洗脱剂为70%乙醇,洗脱剂用量为3倍树脂体积,流速3~4ml/min,上柱总黄酮量与树脂比为1∶10.5,上柱液总黄酮浓度为19.8mg/ml,流速2~3ml/min,冲洗杂质用水体积2~3BV,上柱液pH值4~5。     

迷迭香酸对大鼠肾小球系膜细胞增殖及白细胞介素-1β的影响

目的　探讨迷迭香酸对原代培养的大鼠肾小球系膜细胞增殖及其产生白细胞介素 - 1 β(IL - 1 β)的影响。方法　用四甲基偶氮唑 (MTT)法测定迷迭香酸对系膜细胞增殖的影响 ,酶联免疫吸附法 (ELISA)测定系膜细胞IL - 1 β蛋白水平。结果　迷迭香酸在 5～ 2 5mg/L浓度范围能明显抑制血清或脂多糖刺激的系膜细胞增殖 (与对照组比较 ,P <0 .0 1 ) ,在 1～ 2 5mg/L范围能明显抑制脂多糖诱导的系膜细胞IL - 1 β分泌 (与对照组比较 ,P <0 .0 1 )。结论　迷迭香酸对体外培养的系膜细胞增殖及IL - 1 β分泌具有抑制作用。