高灵敏度COLD-PCR法在CHB患者核苷(酸)类似物耐药突变监测中的建立与研究

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)基因突变是导致病毒耐药的基础,虽然测序技术已广泛应用于HBV耐药突变检测,但其较低的灵敏度大大限制了其临床应用价值;反向杂交的灵敏度较高,约为5%,但其价格较贵,操作不够简便,尤其在发展中国家无法全面推广;本研究建立了低变性温度共扩增PCR(Coamplification at Lower Denaturation Temperature Polymerase Chain Reaction,COLD-PCR)法并联合Sanger测序技术,将其应用于HBV已知和未知的基因型耐药突变检测。     

COLD-PCR/Sanger测序体系检测HBV耐药基因型突变的临床应用评价

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)基因突变是导致病毒耐药的基础~([1-3]),虽然测序技术已广泛应用于HBV耐药突变检测~([4]),但其较低的灵敏度大大限制了其临床应用价值~([5-6]);反向杂交的灵敏度较高,约为5%,但其价格较贵,操作不够简便,尤其在发展中国家无法全面推广;一些新的技术,如质谱分析、超深度测序和高通量测序~([7])等技术逐渐得以应用,但是这些技术存在价格昂贵、操作繁琐、数据分析工作量大、存在碱基错配等缺点,较适合于研究目的,不太适合于临床应用。为了克服以上方法的缺点,建立高灵敏度、简便、价廉和实用的HBV耐药突变检测方法,本研究建立了低变性温度共扩增PCR(coamplification at lower denaturation temperature polymerase chain reaction,COLD-PCR)法~([8-9])并联合Sanger测序技术,将其应用于HBV已知和未知的耐药突变检测。     

Fast COLD-PCR/Sanger测序法对乙型肝炎患者不同耐药基因突变类型检测的应用研究

(1)Fast COLD-PCR/Sanger测序法对不同突变类型的检测浓度有所不同,对突变株DNA的最低检出限可从5.0 E+01 IU/m L-1.0 E+03 IU/m L不等;Full COLD-PCR/Sanger测序法对单一突变类型的检测浓度大致相同,突变DNA浓度约≥5.0 E+02 IU/m L时即可检出,对混合突变类型时最低检出限可提高至1.0 E+02 IU/m L。(2)常规PCR/Sanger测序对所有类型突变株的检出灵敏度均为10%(突变型:野生型比例为1:10,下同)。对于单一位点的突变类型,当发生熔解温度(melting temperature,Tm)下降的突变(如C:G→T:A等)时,Fast COLD-PCR对突变株的检出灵敏度达1%,Full COLD-PCR则为2%;对Tm不变或升高的突变(如C:G→G:C或T:A→C:G等),仅有Full COLD-PCR可提高对突变株的灵敏度为2%。对于多位点突变类型,Fast COLD-PCR与Full COLD-PCR法检出突变的灵敏度可进一步提高为0.5%和1%。     

COLD-PCR/Sanger法检测非小细胞肺癌患者外周血EGFR和KRAS基因突变的价值

目的评价COLD-PCR/Sanger法检测晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者外周血EGFR和KRAS基因突变的价值。方法采用COLD-PCR/Sanger对67例晚期NSCLC患者外周血中EGFR及KRAS基因突变进行检测,同时采用普通PCR/Sanger法进行平行检测。结果 67例样本中,COLD-PCR/Sanger检测EGFR的突变率高于普通PCR/Sanger法(43.3%比26.87%,P<0.05),主要表现在外显子19、21的突变,二者的一致性较好(Kappa=0.582);COLD-PCR/Sanger检测KRAS的突变率高于普通PCR/Sanger法(16.4%比5.97%,P<0.05),二者的一致性较好(Kappa=0.49)。结论 COLD-PCR/Sanger是一种高灵敏度检测肺癌患者外周血EGFR和KRAS基因突变的方法。 更多还原     

肝豆状核变性中ATP7B基因复合突变的研究

目的通过对肝豆状核变性(Wilson’s disease,WD)患者ATP7B基因测序,探讨其突变率及与WD的关系,分析WD中ATP7B基因复合突变的意义。方法提取67例临床确诊的WD患者口腔黏膜细胞的基因组DNA,应用PCR技术对ATP7B全部外显子5′端→3′端扩增,运用DNA直接测序法检测突变。结果在67例患者中,发现WD中ATP7B基因突变患者52例,检出率为77.61%,其中16例纯合子突变(12例Arg778Leu纯合子突变和4例Arg919Gly纯合子突变),5例复合突变,31例单纯杂合子突变。5种ATP7B基因复合突变国内罕见报道。结论本研究发现5种ATP7B基因的复合突变,这些复合突变可能与WD的发生发展相关,值得进一步深入研究。     

杂合突变的PCR产物中包含异源双链DNA片段的研究

目的:验证杂合突变的PCR产物中包含异源双链DNA片段.方法:采用PCR、PAGE电泳和变性高效液相色谱分析的方法,对中国人表皮松解性掌跖角化症致病基因KRT9第1外显子的杂合的碱基插入/缺失突变(497delAinsGGCT)进行实验验证.结果:KRT9基因第1外显子碱基插入/缺失突变(497delAinsGGCT)杂合子的PCR产物,本身包含2种异源双链DNA片段和2种同源双链DNA片段,不需要经过额外的变性、退火处理.结论:在用DGGE、TGGE、DHPLC和HA等需要形成杂合双链体的基因突变检测技术进行突变检测时,如果突变为杂合子,则PCR产物可以直接进行突变检测,不需要预先加热/冷却等预处理以形成异源双链DNA分子.     

中国人两种常见G6PD基因突变型的酶活性研究

目的研究中国人两种常见G6PD基因突变型G1388A和G1376T的酶活性。方法应用聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)、变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)技术和DNA测序技术确定标本的基因型。通过G6PD/6PGD比值法检测酶活性。结果34例男性G1388A突变组G6PD活性显著高于41例男性G1376T突变组(P<0.01)。结论G1376T突变比G1388A突变更能影响G6PD酶活性,G1376T突变组酶活性较G1388T组更低。     

应用悬浮点阵和变性高效液相色谱技术检测β地中海贫血基因的比较

目的比较悬浮点阵技术(suspension array,SA)及变性高效液相色谱技术(DHPLC)在β-地中海贫血及基因分型诊断中的应用。方法通过分析100例正常人标本和69例经PCR反向斑点杂交技术(PCR-RDB)确认的β-地中海贫血患者外周血DNA标本,经PCR扩增并分别运用SA及DHPLC两种方法对其进行基因分型诊断。结果100例正常人标本结果为阴性,69例β-地中海贫血标本经两种方法检测其缺失和突变的基因型别完全一致,其中单位点基因突变65例,多位点基因突变4例。结论两种检测技术在β-地中海贫血基因分型诊断中准确性完全一致,具有快速、高效、检测平台的通用性的共同点;但悬浮点阵技术在临床标本检测具有更高的优势,变性高效液相色谱技术则可检测未知突变,在基础研究方面具有优势。     

PCR-DGGE技术检测β珠蛋白外显子Ⅰ及相邻片段突变的研究

目的 建立用于分析β珠蛋白基因外显子1及相邻片段突变的变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术。方法 应用巢式PCR扩增20例β地贫病人的β珠蛋白基因外显1及相邻片段，通过垂直DGGE及time—travel DGGE确定并优化平行DGGE条件，然后对样本进行平行DGGE分析。结果 20例样本β珠蛋白外显子1及相邻片段上的三种突变均能被检出。结论 所建立PCR—DCGE技术可用于准确检测β珠蛋白基因外显子1及相邻片段突变。     

建立高分辨熔解曲线分析法检测SF3B1基因突变

目的:建立高分辨熔解曲线分析法(high-resolution melting analysis,HRMA),检测骨髓增生异常综合征(my-elodysplastic syndrome,MDS)患者中SF3B1基因的突变。方法:针对SF3B1基因热点突变位点(密码子E622、H662、K666和K700)设计PCR扩增引物,建立带有温度内标校准品的PCR扩增反应体系,对30例初诊MDS患者的骨髓标本进行PCR扩增,应用HRMA对相应PCR产物进行突变检测,并对HRMA检测结果进行DNA测序验证。结果:HR-MA检测发现2例MDS患者存在异常的熔解曲线,经DNA测序验证1例为K666M杂合子突变,另1例为K700E杂合子突变。所建立的HRMA技术检测SF3B1基因突变的灵敏度为0.05(5%)。结论:成功建立检测SF3B1基因突变的HRMA技术,可快速筛查MDS标本中的SF3B1基因突变。     

家族性腺瘤性息肉病患者APC基因胚系突变的初步研究

目的:探讨国人家族性腺瘤性息肉病(FAP)患者APC基因胚系突变的特点.方法:对我院2004年3月至2005年3月收治的6例FAP患者运用PCR变性高效液相色谱技术检测APC基因,对可疑突变者进行测序.结果:变性高效液相色谱检测共发现3个可疑突变片段,经DNA测序证实3个片段均存在突变.其中,15号外显子2例,14号内含子1例.结论:国人FAP患者相同基因型APC基因突变可有不同表现型.     

应用DHPLC进行线粒体异质性突变分析

目的:检测人类线粒体DNA异质性从而建立有效的筛查低水平异质性DNA的方法.方法:选择包含Ⅱ型糖尿病高突变位点的人mtDNA 3083～3339 nt片段进行PCR扩增,以不同比例混合相差一个碱基的两种DNA片段的PCR扩增产物,建立不同比例异质性DNA模型.确定最佳检测条件后分别用变性高效液相色谱技术(DHPLC)和DNA测序技术进行分析和比较.结果:应用DHPLC检测mtDNA 3083～3339 nt(257 bp),最低可检测出该区域含量为5%的异质性样本,而DNA测序技术只能检测出异质性含量大于20%的样本.结论:成功建立分析mtDNA 3083～3339 nt片段异质性突变的方法,该方法可用于检测低水平的mtDNA异质性.     

简化聚合酶链反应在检测血清HBV-DNA中的应用

自Saiki首先应用聚合酶链反应(Polsamerase Chain reaction,PCR)检测镰状红细胞贫血病人以来,PCR技术在临床检测中得到日趋广泛的应用。PCR利用变性、退火及延伸的反复循环,可在体外将目的DNA片段迅速扩增百万倍,极大提高了检测方法的敏感性及特异性。近来PCR技术不断改进。我们采用简化PCR反应步骤,合并退火及延     

PCR在肺炎支原体特异性诊断中的应用

支原体是介于细菌和病毒之间的病原微生物,肺炎支原体为儿童及青少年呼吸道感染常见的病原体之一[1],它不仅可引起严重的肺炎,还可引起严重的并发症和持久的后遗症[2]。肺炎支原体的检测方法有多种,本文综述近几年来PCR技术在肺炎支原体特异性诊断中的研究进展。1　PCR概述聚合酶链反应(Palymerasechainreaction,简称PCR)是1985年美国Cetus公司人类遗传研究室MullisK,B等人创立的一种DNA体外扩增技术,此技术是将扩增模板在高温下变性,在适合温度下使引物与变性NDA的两条链两端分别复性,在适合温度下使DNA聚合酶催化引导DNA的合成…     

变性高效液相色谱检测IRS-2基因3′-非翻译区单核苷酸多态性

目的 :探讨变性高效液相色谱 (DHPLC)在胰岛素受体底物 2 (IRS 2 )基因 3′ 非翻译区单核苷酸多态性 (SNP)检测中的应用。方法 :采用聚合酶链式反应 (PCR) ,DHPLC ,单链构象多态性 (SSCP)和DNA序列分析对 30例正常对照和 30例 2型糖尿病患者IRS 2基因 3′ 非翻译区进行SNP和突变检测。结果 :PCR DHPLC检测出 4例PCR SSCP分析未能发现的 2型糖尿病患者IRS 2基因 3′ 非翻译区的SNP ,并得到测序验证。结论 :DHPLC是一种快速、自动化程度高、操作简单、检测片段长、准确率高的SNP检测技术。它为进一步研究IRS 2基因 3′ 非翻译区的变异与 2型糖尿病的关系奠定了基础。     

一种新的HBV DNA rtA181T耐药突变检测方法

目的:通过巢式PCR及特异引物,建立一种新的乙肝病毒(HBV) DNA rtA181T耐药突变的PCR直接扩增检测方法?方法:巢式PCR方法第1轮扩增HBV DNA 逆转录酶rt活性域片段,第2轮PCR上游引物3′末端碱基设计为与HBV DNA rtA181T突变碱基相同的碱基,扩增出的目的基因片段,即为突变片段?利用该方法,本文检测了43例HBV DNA rtA181T变异标本,分析该方法检测的灵敏性;并比较分析低拷贝HBV DNA水平与高拷贝HBV DNA水平下,该方法与PCR-Sanger测序法检测HBV DNA rtA181T突变的一致性?结果:产物经测序证实,突变检测引物巢式PCR法能扩增出HBV DNA rtA181T耐药突变?在HBV DNA水平为24 U/?滋L?rtA181T突变株含量低至10%时,该方法仍能较好检测出rtA181T变异片段?对43例不同拷贝水平的HBV DNA rtA181T耐药变异临床标本检测显示,该方法检测灵敏性达100%,常规PCR-Sanger测序灵敏性为74%,差异有统计学意义(P < 0.05)?结论:基于巢式PCR及突变引物为基础的HBV DNA rtA181T耐药突变PCR直接检测法能较好地检测HBV DNA rtA181T耐药变异发生;对HBV DNA低拷贝水平下的rtA181T耐药变异检测,该方法灵敏性优于Sanger测序法,且有较好的特异性?这对早期发现HBV DNA耐药突变?及时更改抗HBV治疗策略具有重要临床指导意义?     

聚合酶链式反应介导的定点突变方法探索

定点突变是研究蛋白质结构与功能关系以及确认结构域或特定氨基酸所处位置的重要手段 ,可以利用定点突变调节基因表达和对DNA分子 (载体 )进行修饰[1,2 ] 。关于这一技术在分子克隆技术成长发展过程中陆续报道了很多方法[3,4 ] ,但这些方法或必须以单链DNA (ssDNA)作为模板 ,或操作繁琐 ,成本高 ,技术上也会有很多困难。本文介绍的是目前应用较普及、较经典的聚合酶链式反应 (poly merasechainreaction ,PCR)介导的定点突变方法 ,即应用PCR技术 ,对DNA链上特定部位的氨基酸置换 ,插入某几个或消除某几个特定氨基酸。这里主要介绍重…     

应用等位基因特异性PCR检测血管紧张素原基因突变

目的:建立检测血管紧张素原(angiotensinogen,AGT)基因2种常见突变的等位基因特异性PCR技术。方法:应用针对AGT基因T174M和M235T这2种常见的突变位点设计的等位基因特异性PCR技术,对海南汉、黎族人群中AGT基因突变类型进行了检测,同时对经上述等位基因特异性PCR检测的样本进行序列测定。结果:在海南汉、黎族人群中,T174M突变位点可检测出TT、TM、MM 3种基因型,M235T突变位点可检测出MM、MT、TT 3种基因型,用等位基因特异性PCR鉴定的AGT基因突变的基因分型结果与序列测定结果完全符合。结论:等位基因特异性PCR技术操作简便,重复性和稳定性好,可作为鉴定AGT基因突变类型的可行方法。     

应用等位基因特异性PCR检测胆固醇酯转运蛋白基因突变

目的:建立检测胆固醇酯转运蛋白(cholesterol ester transfer protein,CETP)基因6种常见突变的等位基因特异性PCR技术。方法:应用针对CETP基因TaqIB(G→A)、I405V(A→G)、D442G(A→G)、R451Q(G→A)、A373P(G→C)和I14A(G→A)这6种常见的突变位点设计的等位基因特异性PCR技术,对海南汉、黎族人群中CETP基因突变类型进行了检测,同时对经上述等位基因特异性PCR检测的样本进行序列测定。结果:在海南汉、黎族人群中,TaqIB(G→A)突变位点可检测出GG、GA、AA3种基因型,I405V(A→G)突变位点可检测出AA、AG、GG3种基因型,D442G(A→G)突变位点可检测出AA、AG2种基因型,但在海南汉、黎族人群中未检测到R451Q(G→A)、A373P(G→C)和I14A(G→A)3种突变类型,用等位基因特异性PCR鉴定的CETP基因突变的基因分型结果与序列测定结果完全符合。结论:等位基因特异性PCR技术操作简便,重复性和稳定性好,可作为鉴定CETP基因突变类型的可行方法。     

改良Blocker PCR检测EGFR-TKI耐药后非小细胞肺癌血浆EGFR T790M突变的价值

 目的   探讨改良PCR(Blocker PCR)方法在晚期非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)患者血浆游离DNA(cell free DNA,cfDNA)中检测继发EGFR T790M突变的应用价值。方法   采用Blocker PCR方法对127例表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)耐药后肺癌患者的血浆标本行EGFR敏感突变和T790M突变检测,统计T790M突变的检出率;为验证Blocker PCR 血浆检测的可靠性,部分患者血浆标本行二代测序(next generation sequencing,NGS)和Blocker PCR配对比较;获得配对血浆和组织的病例行Blocker PCR配对检测。结果   在127例采用Blocker PCR方法检测的EGFR-TKI耐药NSCLC患者中,T790M耐药突变的检出率为40.15% (51/127),其中21.56% (11/51)为单纯T790M耐药突变,78.44% (40/51)为T790M合并原有EGFR敏感突变。组织与血浆配对检测中,EGFR-TKI耐药后二次活检组织标本T790M的检出率为54.54% (6/11),血浆T790M的检出率为43.75% (14/32)。在同时行Blocker PCR 和二代测序基因检测的18例患者中,敏感突变位点及T790M突变位点在两种检测方法中的一致率均为100%。结论   在EGFR-TKI耐药后的NSCLC患者中使用Blocker PCR 检测血浆T790M突变是对组织活检的重要补充。