金银花HQT基因变异类型与其绿原酸含量相关性

目的揭示金银花HQT基因的变异情况,并阐述HQT基因变异类型与绿原酸含量的相关性。方法以不同产地及品种的金银花为材料,通过RT-PCR法扩增其HQT基因编码区,直接测序,通过多重比对进行HQT基因变异类型分析,进而对其与绿原酸含量之间的相关性进行分析。结果 HQT基因编码区变异包括碱基置换突变、插入/缺失突变,部分变异会引起HQT蛋白的改变,并影响绿原酸的表达量。结论金银花HQT基因编码区具有丰富的变异,与忍冬种间分类及绿原酸含量之间具有一定的相关性。     

甘草3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因多态性与甘草酸含量的相关性分析

目的:揭示甘草3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因的多态性,并阐述HMGR基因多态性与甘草酸含量的相关性.方法:以甘草酸含量差异显著的甘草个体为材料,通过RT-PCR法扩增其HMGR基因编码区;与载体pMD19-T连接后克隆测序;通过多重比对进行HMGR基因多态性分析,及与甘草酸含量之间的关联分析.结果:HMGR基因编码区多态性包括整码突变、碱基置换突变、拷贝数多态性及等位基因杂合;HMGR编码氨基酸序列中存在以下4种类型变异,即-HSL,-HSV,GALLV,GALSV,其中-HSV型为甘草中普遍存在类型,-HSL型为甘草酸低含量甘草的特有类型,GALSV型为甘草酸高含量甘草特有类型.结论:甘草HMGR基因编码区具有丰富的多态性,和甘草酸含量之间具有相关性.     

红白忍冬SABATH甲基转移酶基因克隆及其生物信息学分析

目的: 克隆红白忍冬SABATH甲基转移酶基因(rLjSABATHMT),比较忍冬和红白忍冬SABATH甲基转移酶同源基因表达量和基因内含子序列的差异,为金银花的活性成分形成及调控机制研究提供基础。方法: 根据cDNA文库提供的基因片段设计特异性引物,从红白忍冬中克隆获得rLjSABATHMT基因cDNA序列及基因组序列。通过生物信息学对该基因蛋白的特征进行分析,使用MEGA 5.0构建SABATH甲基转移酶系统进化树,利用RT-PCR分析SABATHMT同源基因在忍冬与红白忍冬的不同器官、不同花期的表达量,对忍冬和红白忍冬SABATHMT同源基因内含子区序列进行分析和比较。结果: 克隆获得的rLjSABATHMT基因cDNA序列全长为1 251 bp,具有完整编码框,编码365个氨基酸。该基因蛋白序列具有保守的SABATHMT结构域,系统进化树结果表明它可能是水杨酸/安息酸甲基转移酶。基因表达分析结果表明SABATHMT同源基因主要在花中表达。忍冬和红白忍冬SABATHMT同源基因内含子区序列具有丰富的多态性,且有2个SNP为红白忍冬的特有基因型;内含子区motif元件中碱基变异在2个同源基因间具有显著差异。结论: SABATHMT同源基因内含子区变异可能导致了忍冬和红白忍冬SABATH甲基转移酶表达差异,为金银花活性成分调控机制研究提供了重要研究基础。     

5S-rRNA基因间区序列变异用于金银花药材道地性研究初探

目的;研究金银花药材道地性形成的基因基础。方法：用SDS法提取金银花Lonicera japonica不同居群,外类群细毡毛忍冬L.similis和山银花L.confusa的总DNA,进行5S－rRNA基因间区的PCR扩增和测序,并用软件Mega进行分析。结果：Lonicera L.属植物5S－rRNA基因间区约210bp,其中G＋C含量较高,达70％左右,不同居群的L.japonica碱基序列有差别,通过测序可以进行鉴别。L.confusa与L.japonica间的遗传距离较大。结论：种间5S－rRNA基因间区的序列差异大于种内;道地药材之间的遗传距离较小;道地与非道地药材之间的遗传距离大于道地药材之间的遗传距离。     

应用cDNA-AFLP研究甘草不同变异类型特异表达的基因

目的:探讨生态环境和遗传背景相同条件下8种不同变异类型甘草在基因表达水平上的差异,旨在揭示甘草种内变异的分子机制.方法:采用cDNA-AFLP、生物信息学等方法,对不同变异类型甘草在生长旺盛期根部组织特异表达的基因进行分析和功能预测;采用反相Northern杂交对特异表达的基因进行验证.结果:共获得14条差异表达基因片段,有6个基因序列编码的蛋白功能未知,其余的基因片段编码的蛋白参与了植物的抗菌,调节生物体内代谢,增加植物的抗热(高温)性,提高植物体固氮能力等生物过程.结论:首次克隆了不同变异类型甘草特异表达的基因,为筛选优良变异类型、品种选育、功能基因组的研究奠定基础.     

鲤科鲌属药用鱼类线粒体COI基因的DNA条形码研究

目的:采用线粒体COI基因序列研究我国长江流域不同地区鲤科鲌属药用鱼类的遗传特征,探讨利用该基因片段作为鲌属药用鱼类鉴定条形码的适用性.方法:扩增鲌属药用鱼类的线粒体COI基因序列5′端并进行测序,分析不同药用鱼类种内和种间的遗传变异,构建聚类树,探讨该序列片段在鲌属药用鱼类中进行鉴定的可行性.结果:鲌属药用鱼类COI基因片段的碱基组成中A+T碱基量明显高于G+C量,96％的遗传变异均发生在编码区密码子第3位点,但所有翻译后氨基酸组成均相同,表明COI基因编码在鲌属鱼类中的保守性;鲌属药用鱼类的种内遗传距离均小于1％,种间遗传距离大于10倍的种内距离;NJ聚类树显示所有鲌属鱼类聚成独立的一支,其属内不同鱼种的个体又分别聚成独立的分支,不同分支具有较高的节点支持率.结论:鲌属4种药用鱼类的DNA分类与形态学分类结果一致,COI条形码序列能够对鲌属鱼类进行有效的区分.     

基于DNA条形码对凉山虫草及近缘物种和其混伪品的分子鉴定

目的：结合ITS基因和COI基因对《四川省中药材标准》收录的凉山虫草和近缘物种及当地市场上出现的混伪品进行分子鉴定,考察其方法的可行性。方法：对收集的28份样品通过DNA提取、PCR扩增,分别获得其ITS 序列和COI 序列。用Codon Code Aligner V3.7.1,Mega 5.0等软件进行比对分析,构建基于ITS 序列和COI 序列的样品的NJ 树,进行聚类分析。结果：凉山虫草和近缘物种及混伪品寄生真菌的ITS 序列种间最小K-2P距离大于各物种种内最大K-2P距离：种内变异小,种间差异较大,从而基于ITS序列的NJ 树能将凉山虫草与其他近缘物种及其混伪品很好地归属;凉山虫草和近缘物种及其混伪品寄主昆虫的COI序列种间最小K-2P距离大于各物种种内最大K-2P距离：种内变异小,种间差异较大,通过遗传距离及NJ树的分析能将凉山虫草与其他近缘物种其及其混伪品及其他近缘物种很好地区分。结论：结合ITS序列和COI序列的DNA条形码技术可以很好地鉴定凉山虫草与其近缘物种及其混伪品,并对虫草属的系统学和分类研究提供了技术支持。     

长柄石杉L-赖氨酸脱羧酶基因克隆及序列分析

目的在对长柄石杉Huperzia serrata、闽浙马尾杉Phlegariurus minchegensis、华南马尾杉Phlegariurus austrosinicus和有柄马尾杉Phlegariurus petiolatus 4种石杉科植物的L-赖氨酸脱羧酶(L-lysine decarboxylase,LDC)基因编码区进行克隆的基础上,对长柄石杉的LDC基因全长序列进行分析并预测其蛋白结构。方法采用RT-PCR技术,以石杉科植物叶片提取的总RNA为模板克隆得到LDC基因编码区序列,通过BLAST比对和MEGA5.0软件对克隆的序列进行分析。采用RACE技术获得石杉科广布种长柄石杉的LDC基因全长序列,并对其蛋白的二级结构及三维结构进行预测分析。结果克隆的4种石杉科植物LDC基因序列与数据库中被注释为编码LDC的基因序列保持高度的相似性,长柄石杉LDC蛋白与NCBI中的蛇足石杉LDC氨基酸序列相似度很高,与蕨类植物江南卷柏的同源性也较高。长柄石杉LDC基因编码区全长为1 266 bp,编码403个氨基酸,Gen Bank登录号KF040056。结论克隆得到4种石杉科植物的LDC基因,分析了长柄石杉LDC基因的全长序列并预测其蛋白结构,为进一步阐明石杉科植物石杉碱甲生物合成途径奠定基础。     

基于β-AS基因的甘草道地性形成机制研究

目的:对甘草道地性形成机制进行探索.方法:在GenBank中检索β-香树酯醇合成酶(β-AS)基因,进行序列比对并找出序列保守区,用primer premier 5.0软件设计引物,对3个不同产地甘草材料的β-AS基因进行扩增、测序,用MegAlign软件进行序列分析并构建系统树.在表达差异实验中,对来自3个产地的9份甘草材料进行总RNA提取,逆转录得到cDNA,以甘草18S基因为内参,PCR扩增后进行相对表达量分析.结果:在序列多态性实验中,9个样品的β-AS序列经比对分析共发现108处变异位点,内含子变异位点数高于外显子变异位点数两倍.在表达差异实验中内蒙组、甘肃组和宁夏组的甘草β-AS基因平均相对表达量有显著性差异.结论:不同产地甘草β-AS基因多态性的差异以及表达量的差异,可能是导致甘草道地性形成的原因之一.     

相近石韦叶绿体基因组学分析

目的:测定相近石韦Pyrrosia assimilis叶绿体基因组,分析其序列特征并探讨相近石韦本草基因组学研究。方法:应用高通量测序技术对相近石韦进行了叶绿体全基因组测序,利用生物信息学方法分析其结构特征和系统发育关系。结果:相近石韦叶绿体基因组呈环形双链结构,全长154 964 bp,鸟嘌呤和胞嘧啶(GC)总量41. 2%;共注释到131个基因,包括88个蛋白编码基因,35个转运RNA(tRNA)基因和8个核糖体RNA(rRNA)基因;共检测到43个散在重复序列和56个简单重复序列(SSR);编码亮氨酸的密码子使用频率最高,编码色氨酸的密码子数最少;叶绿体基因组全局比对分析筛选出5个高变异区(psb A,rrn16,pet A-psbJ,ndh C-trnM和psb M-petN);系统发育树显示相近石韦与波氏石韦P. bonii亲缘关系较近。结论:相近石韦叶绿体基因组中非编码区变异高于编码区,大单拷贝区(LSC)和小单拷贝区(SSC)变异大于反向重复区(IR),筛选出的5个高变区可作为石韦属物种鉴定的候选DNA条形码。相近石韦的叶绿体基因组学研究为其他石韦属药用植物在分子鉴定、遗传基因转化、抗性蛋白表达及次生代谢途径解析等方面的研究提供了参考。     

DNA条形码等分子鉴定技术与动植物类中药材的鉴定

中药材鉴定是控制中药质量、确保用药安全与效果的首要环节。DNA分子鉴定是从基因层面上进行中药材鉴别的手段,准确率高。DNA分子鉴定包括电泳技术、免疫技术、随机扩增多态性DNA(RAPD)、限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)、扩增片段长度多态性(AFLP)、简单重复序列(ISSR)及DNA条形码等,以DNA条形码应用最为广泛。DNA条形码是基因组中相对较短的、可用于物种鉴定的特异性基因片段。植物类中药材的条形码多选用核基因和叶绿体基因DNA片段,如叶绿体psbA-trnH基因、内转录间隔区(ITS)、叶绿体核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶大亚基(rbcL)和RNA转录体Ⅱ型内含子剪切酶基因(matK)等;动物类中药材的条形码多来自核基因和线粒体基因DNA,主要有线粒体细胞色素C氧化酶亚基1(COⅠ)、核糖体RNA(rRNA)和线粒体细胞色素b基因(CytB)等。综述动植物类中药材DNA分子标记与鉴定技术应用进展,并探讨DNA条形码在药用动植物类中药材鉴定中存在的局限性及发展前景,为中药质量控制提供参考。     

HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者HBV变异与中医分型的相关性研究

目的:探讨慢性乙型肝炎HBeAg阴性患者乙肝病毒变异状况与中医辨证分型的相关性。方法:将112例HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者中医辨证分为5种证型,采用基因序列分析的方法进行乙型肝炎病毒BCP区和前C基因终止变异检测。结果:HBeAg阴性慢性乙肝患者HBV突变类型与中医分型无明显相关性,但肝郁脾虚型与湿热中阻型、瘀血阻络型相比,有显著性差异;分为偏实证组和偏虚证组后,BCP区和(或)前C基因终止变异的发生率在2组间存在显著性差异,虚证组明显高于实证组;相同位点在不同中医证候中的变异率无显著性差异。结论:BCP区和(或)前C区变异与中医辨证分型存在相关性,实证组变异率低于虚证组。肝郁脾虚型发生变异率最高。     

山东产木贼科草药形态解剖学的研究

目的：为山东产木贼科草药经典分类提供属种间形态解剖学依据。方法：采用光镜和扫描电镜对山东产２属５种１变种木贼科草药进行了形态解剖学的研究。结果：木贼属和问荆属在气孔类型、气孔保卫细胞表面附属物及内皮层层数等方面有显著差异;山东木贼科植物维管束内均有侧生木质部。结论：依据茎的内部结构和表面特征可将它们进行属间分类,但属内种间差异较小。     

多叶勾儿茶叶绿体基因组比较分析及系统发育研究

目的 研究勾儿茶属药用植物多叶勾儿茶Berchemia polyphylla及变种光枝勾儿茶B. polyphylla var. leioclada叶绿体基因组成及结构特征,同时为勾儿茶属系统发育及进化研究提供参考。方法 基于Illumina平台对勾儿茶属药用植物多叶勾儿茶及变种光枝勾儿茶进行叶绿体基因组测序,利用生物信息学对其序列进行组装、注释和特征分析,与同科小勾儿茶属、枣属、枳椇属、鼠李属、冀核果属等的叶绿体全基因组进行比较分析,确定其在鼠李科植物中系统发育位置。结果 多叶勾儿茶和光枝勾儿茶叶绿体基因组具有典型环状四分体结构,全长分别为161 185、161 210 bp,注释得到131个基因,其中蛋白质编码基因86个,37个tRNA基因和8个rRNA基因。勾儿茶属与鼠李科其它药用植物比较基因组学分析表明,勾儿茶属叶绿体基因组具有较高的保守性,叶绿体基因组之间没有重排或倒置,IR区序列变异最低,LSC区的变异程度最高,其中ndhA、ycf1、ycf3、rpl16、clpP以及atpF等基因的编码区存在差异,这些位点为勾儿茶分子鉴定提供新位点。系统发育树表明勾儿茶属与鼠李属及翼核果...     

锁阳与寄主白刺的ITS2条形码特征及遗传关系

目的:采用ITS2条形码对寄生植物锁阳-白刺进行分子标记鉴定,并分析它们之间及它们近缘种的亲缘关系。方法:通过改良的CTAB法提取基因组DNA,通用引物扩增r DNA-ITS2的内转录间隔区,经DNAstar软件校对拼接,预测植物的ITS2二级结构图;利用MEGA 6.06软件计算种内、属间Kimura-2-parameter遗传距离;通过中药材DNA条形码鉴定系统比对和邻接法构建系统聚类树,分析属间、种间和种内遗传关系。结果:锁阳和白刺的ITS2序列长度分别为229 bp和232 bp,GC含量分别为48%和63%。锁阳和白刺的种内遗传距离分别为0~0.004 4和0~0.022;锁阳和白刺的属间遗传距离为2.234 0~2.443 3。结论:ITS2条形码可以很好地鉴定、区分锁阳、白刺及它们的近缘种之间的系统发生关系。     

ITS2条形码序列对茜草科黎药植物的鉴定

目的 利用DNA条形码技术通过ITS2序列对海南茜草科黎药植物进行快速鉴定.方法 对样本的核基因ITS2片段进行PCR扩增并双向测序,所得序列经CodonCode Aligner拼接后,利用MEGA5.0软件进行数据分析,并构建聚类树.从ITS2网站上获得ITS2二级结构信息,利用TAXON DNA软件分析序列种内、种间变异并作barcoding gap分析.结果 构建的系统树各个种不同样本均分别聚在一起,表现出单系性;各ITS2二级结构种内无明显差异;种间存在明显差异;基于ITS2序列的barcoding gap图显示种内变异和种间变异存在明显的barcoding gap.结论 ITS2序列可以作为DNA条形码对海南茜草科黎药植物进行快速鉴定.     

基于叶绿体全基因组的贝母属特异性DNA条形码的筛选

本研究通过对贝母属4个物种叶绿体基因组进行全局分析,分别查找基因区域和基因间区的高变异区域,筛选用于高效鉴别贝母属植物的新DNA条形码序列。相关研究发现贝母属植物的基因区域序列相似度极高,不适用于DNA条形码鉴定研究;共有7个基因间区可以作为潜在的贝母属植物鉴定的特异性DNA条形码。本研究所构建的DNA条形码筛选方法,为筛选用于难鉴定科属的新的DNA条形码提供了通用的方法体系。     

金银花种质资源DNA身份证构建及遗传相似性分析

利用22对SSR引物对20个产地58个金银花农家种进行扩增,从中筛选出7对多态性较强、扩增带型稳定的引物建立金银花种质资源DNA身份证。结果表明,7对核心引物可将58个金银花农家种区分。采用Pop Gene32(vesion1.32)软件包对58个金银花农家种进行遗传相似性分析,相似系数变异范围为0.366 7~0.916 7。依据相似系数,可反映58个金银花农家种之间的亲缘关系,并将58个农家种遗传一致性分为4类,为金银花的优良种质选育提供参考信息,为中药材道地性研究提供理论依据。     

中药材锁阳的ITS2条形码分子鉴定研究

目的：应用DNA条形码技术准确、快速鉴定中药材锁阳及其混伪品。方法：采用试剂盒法提取药材的基因组DNA,PCR扩增其核糖体DNA的内转录间隔区（internal transcribed spacer 2,ITS2）并进行双向测序,应用CodonCode Aligner V 3.7.1对测序峰图进行校对拼接,比较ITS2序列的GC含量,采用MEGA 5.0计算种内、种间 Kimura 2-parameter（K2P）遗传距离,通过中药材DNA条形码鉴定系统比对和构建NJ 系统聚类树进行鉴定分析。结果：锁阳药材的ITS2序列长度为229 bp,种内变异较小,平均K2P遗传距离为0.003,锁阳药材及其混伪品的种间平均K2P遗传距离为0.760,种间最小K2P遗传距离明显大于锁阳种内的最大K2P遗传距离。中药材DNA条形码鉴定系统比对和NJ树鉴定结果均表明ITS2 序列可区分锁阳及其混伪品。结论：ITS2条形码可有效鉴定中药材锁阳及其混伪品,且具有较好的稳定性和准确性,为保障临床安全用药提供了新的技术手段。     

根据基因探讨药用植物的变异和生药基原

以检测RFLPs进行各种药用植物种内或种间变异的分析,并把生药中残存基因的特定区域扩增克隆,根据检测其碱基序列的差异,来探讨用DNA鉴定生药的可能性。 1.三岛柴胡地理变异的分析:三岛柴胡(Bupleurum falcatum)在日本各地均有分布,为多态性强的种,由于产地不同其体细胞染色体数目、叶序、柴胡皂甙含量等形状和性质有差异,对日本8个产地野生的样品,在基因水平上进行了地理系统之间的遗传关系分析。首先选用御种植物,用RFLP图谱对个体变异进行探讨,但调查范围内同一种群未见个体变异。用各种限制酶进行RFLP的检测,在以Dra Ⅰ,Kpn Ⅰ,Taq Ⅰ进行限制酶酶切