福建省沙门菌病invA与spvB基因分布状况的研究

[目的]了解福建省沙门菌临床分离株invA与spvB基因的分布特点,为掌握我省沙门菌病分子流行病学特征提供依据。[方法]采集2006、2007年沙门菌临床分离株137株,煮沸裂解法提取DNA后对invA和spvB基因进行PCR检测。[结果]invA和spvB基因的阳性率分别为99.3%和24.8%;spvB基因在腹泻病例中的阳性率高于在发热病例中的阳性率,在非伤寒病例株的阳性率显著高于伤寒、副伤寒病例株的阳性率。[结论]invA基因可作为沙门菌病快速诊断基因,spvB基因在非伤寒、伤寒及副伤寒沙门菌血清型中均有不同程度地存在。     

应用PCR技术快速检测沙门菌

[目的]建立用于快速和特异检测沙门菌的PCR方法。[方法]将受试菌种按煮沸裂解法提取DNA,针对hns与invA基因序列合成2对PCR引物,对沙门菌标准菌株和其他菌属的菌株进行PCR检测,并用福建省2006—2007年沙门菌临床分离株137株进行验证。[结果]沙门菌标准菌株hns和invA基因均为阳性;137株沙门菌临床分离株hns和invA基因的阳性率分别为100％和99．3％,其他菌属的菌株无特异性条带。[结论]本研究建立的PCR方法可用于检测沙门菌属。     

12小时PCR技术快速检测沙门菌

[目的]本课题根据致痫性沙门菌的invA基因序列设计引物，进行PCR反应，扩增出389bP的特异性片断，从而检测出目标菌。[方法]将试验菌种BPw中非选择性增菌6h：45min沸水浴破细胞，释放染色体DNA制作模板：PC及扩增约3h(1：95℃ 5min预变性：2：95℃ 1．5min变性3：62℃ 1min退火：4：72℃ 45S延伸：5：72℃ 7min延长其中4至2步循环35次)。[结果]所得扩增产物经1．5％的琼脂糖凝放电泳约1h，紫外灯下可见扩增条带。[结论]通过调节Mg^2 浓度，引物浓度和模板量和纯化方法，优化反应条件，初步建立了一种12h内快速检测沙门菌的方法，灵敏度可达40-50cft/ml。     

实时荧光PCR检测沙门菌特异基因

目的：建立一种灵敏、快速检测沙门菌的实时荧光PCR方法.方法：针对沙门菌特异性基因invA设计引物、探针,在实时荧光PCR仪上进行扩增、检测和结果分析.结果：应用该实时荧光PCR方法,30株沙门菌检测结果均为阳性,19株非沙门菌结果均为阴性,96个肛门拭子样本增菌前后的PCR结果一致;检测灵敏度达到4 cfu/test,定量结果与培养计数无显著差异.结论：该方法检测沙门菌具有灵敏度高、快速方便的特点,且可用于定量检测.     

fliC基因在快速分型鉴定伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌的应用

目的:探讨沙门菌1相鞭毛蛋白抗原fliC基因在快速分型鉴定伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌的应用。方法:根据伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌1相鞭毛蛋白fliC-d和fliC-a基因以及菌体抗原rfbS基因的核酸序列,设计针对fliC-d、fliC-a及rfbS基因的3对特异性引物,采用多重PCR法进行检测。结果:实验结果显示,伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌分别在750 bp和329 bp处扩增出2条特异性目的条带,在258 bp处扩增出1条相同条带,非伤寒沙门菌株和甲型副伤寒沙门菌株均为阴性。结论:fliC基因检测可用于伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌的分型鉴定,而rfbS基因则无助于分型鉴定。     

环介导核酸恒温扩增结合试纸条技术快速筛查沙门菌的方法

[目的]探讨环介导核酸恒温扩增(LAMP)结合试纸条技术(LFD)快速筛查沙门菌的可行性.[方法]从GenBank上下载沙门菌invA基因序列,用DNAMAN软件同源性比对后,在其保守区设计LAMP扩增引物,建立LAMP-LFD恒温扩增快速检测技术,优化反应条件,用荧光聚合酶链反应(PCR)法平行检测加以验证.[结果]...     

沙门菌invA基因荧光定量PCR检测

沙门菌是引起食源性感染的常见致病菌^[1],常规检测方法有分离培养、生化鉴定、血清学试验等.由于沙门菌有2 000多种血清型,因而监测工作多繁琐、费时、费力.实时荧光定量PCR检测技术是近年来的新方法,已经愈来愈多地用于病原体诊断^[2].研究表明,沙门菌侵袭基因invA高度保守,几乎存在于沙门菌所有血清型中,其编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白,决定沙门菌对肠粘膜细胞的侵袭力,与其致病性显著相关^[3].根据这一特点,为探讨快速、敏感、稳定的沙门菌检测方法,本研究应用沙门菌侵袭基因invA设计引物和探针序列,建立沙门菌荧光定量检测方法并研制沙门菌检测试剂盒.     

利用CHROMagarTM沙门菌显色平板快速分离3株普顿沙门菌

于2005年8～10月间在从业人员肛拭体检中分离到3株非A—F群沙门菌，经CHROMagar^TM沙门菌显色平板分离培养和特征菌落、形态、生化、O-I噬菌体裂解试验、血清学试验证实均为沙门菌普顿血清型（Salmonella ser putten，13，23：d：1，W），为本地区首次检出。     

生化快速检测法鉴定沙门菌和志贺菌

1 材料与方法，1．1 材料，1．1．1 沙门菌、志贺菌两用增菌液，SS琼脂，麦康克琼脂，三糖铁琼脂，动力靛基质尿素(MIU)琼脂，赖氨酸培养基及对照，氰化钾培养基及对照，ONPG，山梨醇、水杨素、苯丙氨酸脱氨酶培养基，葡萄糖铵培养基，0．7％～0．8％半固体琼脂，以上试剂均购自浙江天和微生物有限公司。均在有效期内。     

LAMP技术快速检测沙门氏菌方法的建立及其应用

目的 建立和评价一种适合国境口岸及基层检验部门使用的沙门氏菌快速检测方法,在2010年上海世博会保障期间开展应用研究.方法针对沙门氏菌agfA基因,运用环介导等温扩增技术(loop mediated isothermalamplification,LAMP),设计引物进行检测,在65℃恒温条件下、60 min特异性扩增...     

应用LAMP同时快速检测沙门菌和志贺菌的效果评价

目的探讨环介导等温扩增（LAMP）方法同时快速检测沙门菌和志贺菌的应用价值。方法通过通用增菌培养,应用LAMP方法和分离培养法分别对76份食堂从业人员粪便标本进行沙门菌和志贺菌检测。结果LAMP方法检出1份标本沙门菌阳性,阳性率为1．32％;分离培养法检出1份都柏林沙门菌,阳性率为1．32％;2种方法的检测结果一致。LAMP方法可在3h内检出沙门菌、志贺菌,而分离培养法需要3-5d,鼠伤寒沙门菌LAMP方法的灵敏度为170CFU／ml,福氏志贺菌LAMP方法的灵敏度为190CFU／ml,与常见的食源性致病菌均无交叉反应。结论与分离培养法相比,LAMP方法特异性高,灵敏度高,不需要特殊仪器,能够在简易的实验条件下,快速、简便地同时检测沙门菌和志贺菌,LAMP方法适用于基层疾病控制实验室开展沙门菌和志贺菌的快速筛查检测。     

嗜肺军团菌环介导等温扩增检测方法的建立及应用简

目的建立一种灵敏、快速、安全、方便适合口岸现场应用的嗜肺军团菌检测方法。方法分析嗜肺军团菌基因组序列,选择特异性基因片段设计引物,建立环介导等温扩增（loop mediated isothermal amplification,LMAP）方法,并优化反应条件。结果建立的方法特异性好,灵敏度可达103cfu/ml,检测能力与荧光定量PCR法相当。结论应用环介导恒温扩增技术建立的嗜肺军团菌检测方法,灵敏度高,特异性好,适合现场快速检测。     

胞内分枝杆菌ELISA检测方法的建立及初步应用

目的 建立胞内分枝杆菌双抗夹心ELISA检测胞内分枝杆菌生物学新方法。方法 以自主制备的胞内分枝杆菌HBHA单克隆抗体为包被抗体,建立胞内分枝杆菌ELISA检测方法。应用棋盘法优化检测条件,同时试验对封闭液进行了最佳选择,对检测样品的特异性、敏感性和准确度进行评估。结果 确定抗体包被最佳浓度为4μg/ml,抗鼠血清最佳稀释浓度为1:400,同时选择P/N值为3.38的1% BSA作为最佳封闭剂。双抗夹心法对新金分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、浅黄分枝杆菌和卡介苗等抗原检测的P/N值均小于2.1,无交叉反应。当菌体浓度为200个/ml时,检测结果仍为阳性,应用该方法检测60份样品中,呈现阳性的菌株为56份,检测准确度高达93.3%。结论 本方法可作为胞内分枝杆菌快速检测和流行病学调查的工具,同时对畜牧业的健康发展提供一种新的技术保障。     

基孔肯雅病毒LAMP检测方法的建立及其应用研究

目的:建立快速、灵敏、特异的基孔肯雅病毒(CHIKV)环介导等温基因扩增(LAMP)检测方法,将该方法应用于基孔肯雅热(CHIK)可疑患者的快速筛查。方法:根据CHIKV核酸序列多重比对结果设计并合成LAMP专用的扩增引物,摸索最佳反应条件,建立灵敏、特异的CHIKV核酸LAMP检测新方法;应用该方法对疑似患者血清中提取的核酸进行快速检测。结果:本方法对CHIKV样本的检测灵敏度达到27拷贝/反应,检测灵敏度高于普通PCR法,略低于实时荧光PCR法。本方法快速、灵敏,并具有较高的特异性和很好的重复性,可在两小时内对CHIK疑似病例进行准确诊断。利用本方法对入境CHIK患者及国内患者样本进行检测,均取得了良好的效果。结论:本方法适合国境口岸一线及基层卫生机构对CHIK可疑患者进行快速检测,对防止CHIK疫情向我国的传播及保障我国公共卫生安全均具有重要意义。     

鲍氏不动杆菌快速检测方法的建立与应用

目的建立鲍氏不动杆菌快速检测方法并应用于临床,为预防控制鲍氏不动杆菌医院感染提供依据。方法以鲍氏不动杆菌recA基因和16S-23SrRNA基因间区序列为目的基因,建立一种快速检测鲍氏不动杆菌的多重聚合酶链反应(PCR)方法。结果该方法对1株鲍氏不动杆菌标准株和12株临床株进行快速检测,结果准确可靠;用该方法直接对临床环境采样标本进行检测,能够检出鲍氏不动杆菌。结论建立鲍氏不动杆菌的快速检测方法,可为控制鲍氏不动杆菌医院感染提供有力工具。     

肠道病毒71型快速培养鉴定方法的建立和应用

目的:建立肠道病毒71型(EV71)快速培养鉴定方法,并应用于EV71感染的早期诊断。方法:1.以不同滴度的EV71临床分离株,低速离心接种于人横纹肌肉瘤细胞(RD)96孔板内,设定时间梯度培养后用间接免疫荧光技术检测EV71早期抗原,以优化快速培养鉴定方法的条件。2.采集上海地区2010年手足口病例患者的咽拭子、大便标本50份,以EV71快速培养鉴定方法检测,并与病毒分离培养比较。结果:病毒滴度为106TCID50/0.1 ml的EV71临床分离株系列稀释后培养3 d,至最高稀释度10-10能100%检测到病毒抗原。检测咽拭子标本5份、大便标本45份,病毒分离检测阳性26份,出现CPE平均时间为9.8d±2.098,阳性率为52.0%;快速培养鉴定方法3 d检出阳性30份,阳性率为60.0%。结论:在96孔板上开展离心培养结合免疫荧光技术应用于EV71感染的早期诊断,缩短了病原体检出时间、敏感性高、特异性强,操作更为简便,是快速诊断EV71感染的可靠方法。     

荧光定量PCR快速检测沙门菌方法的建立及应用

目的:建立沙门菌实时荧光PCR的快速检测方法,探讨其可行性和应用价值。方法:根据沙门菌的特异性DNA作为靶序列,以沙门菌菌株提取核酸DNA作为模板进行荧光检测。结果:本研究在7种相关菌株的检测中,除沙门菌出现很好的阳性外,其余菌株均为阴性;在纯菌条件下,定量检测低限为30 cfu/ml;同一样品检测3次Ct值的变异系数均小于5%;对模拟标本与分离培养对比,二者符合率为100%。结论:该方法的建立,不仅为食源性沙门菌污染及食物中毒的快速检测提供依据,而且还可直接用于临床粪便标本的检测。     

溶藻弧菌TaqMan实时PCR快速检测体系的建立

目的:建立溶藻弧菌TaqMan实时PCR快速检测体系。方法:根据溶藻弧菌胶原酶基因colH的保守序列设计一对引物和一条TaqMan探针,优化反应体系中的引物浓度和探针浓度,评价此反应体系的特异度,并确定其检测下限。结果:优化的反应体系中,引物浓度为200 nmol/L,探针浓度为200 nmol/L,检测下限为1.0×102拷贝/μl,较普通PCR提高了100倍。特异度为100%。结论:本研究所建立的检测体系能够灵敏和特异地检测溶藻弧菌,可以作为溶藻弧菌的快速检测方法。     

快速检测布鲁氏菌抗体的滴金免疫测定法的建立及应用

目的：建立一种快速诊断布鲁氏菌感染的方法。方法：将布鲁氏菌可溶性菌体抗原结合于硝酸纤维膜上，以胶体金颗粒结合的羊抗人IgG作为标记抗体。建立滴金免疫测定法，检测布鲁氏菌感染者血清抗体，通过布鲁氏菌抗原抗体渗滤在硝酸纤维膜上反应，2min后肉眼观察结果。并与试管凝集试验比较。结果：滴金免疫测定法的敏感性为95．35％（41／43），特异性为98．99％（98／99），其他病患者血清反应均为阴性，Youden’s指数为0．9434。滴金免疫测定法与试管凝集试验的符合率为97．89％（139／142），两法无显著性差异（P〉0．05）。结论：滴金免疫测定法可用于布鲁氏菌病的临床榆测和流行病学筛杏．具有椎广应用价值．