弓形虫表面抗原P22编码基因片段的亚克隆与表达

目的 亚克隆弓形虫RH株表面抗原P22编码基因，构建表达质粒pBK/P22，并对其在大肠杆菌（E.coli)中的表达作初步研究。方法 以限制性内切酶BamHⅠ和KpnⅠ双酶切质粒pBCG5.6/P22，获得弓形虫表面抗原P22编码基因目的片段，在以低熔点琼脂糖回收纯化后，插入表达质粒载体pBK-CMV的多克隆位点，构建重组体pBK/P22,并转化大肠杆菌DH5α，快速酚法初筛阳性重组子，阳性克隆以PCR法与限制性酶切分析鉴定后，以IPTG进行诱导在E.coliDH5α中表达，表达产物以SDS－PAGE与免疫印迹分析。要双酶切质粒pBCG5.6/P22，获得约593bp的P22码基因片段，与预期片段大小相符；所构建pBK/P22重组性体阳性克隆以双酶切和PCR鉴定与预期结果一致；SDS－PAGE与免疫印迹显示，表达产物的大小约28ku。结论 成功亚克隆并构建了弓形虫表面抗原P22编码基因pBK/P22表达质粒，诱导表达了弓形虫P22表面抗原蛋白，为抗原免疫特性的研究奠定了基础。     

弓形虫表面抗原P22编码基因片段的亚克隆与表达

目的亚克隆弓形虫RH株表面抗原P22编码基因,构建表达质粒pBK/P22,并对其在大肠杆菌(E.coli)中的表达作初步研究. 方法以限制性内切酶BamHⅠ和KpnⅠ双酶切质粒pBCG5.6/P22,获得弓形虫表面抗原P22编码基因目的片段,在以低熔点琼脂糖回收纯化后,插入表达质粒载体pBK-CMV的多克隆位点,构建重组体pBK/P22,并转化大肠杆菌DH 5α,快速酚法初筛阳性重组子,阳性克隆以PCR法与限制性酶切分析鉴定后,以IPTG进行诱导在E.coli DH 5α中表达,表达产物以SDS-PAGE与免疫印迹分析. 结果双酶切质粒pBCG5.6/P22,获得约593 bp的P22编码基因片段,与预期片段大小相符;所构建pBK/P22重组体阳性克隆经双酶切和PCR鉴定与预期结果一致;SDS-PAGE与免疫印迹显示,表达产物的大小约28 ku. 结论成功亚克隆并构建了弓形虫表面抗原P22编码基因pBK/P22表达质粒,诱导表达了弓形虫P22表面抗原蛋白,为抗原免疫特性的研究奠定了基础.     

弓形虫表面抗原P22基因片段的克隆、表达及鉴定

目的 扩增弓形虫表面抗原P22基因编码序列，并进行表达和鉴定。方法 设计合成引物，PCR法从RH株弓形虫基因组DNA中扩增P22基因编码序列，克隆人载体pET-32a，转化大肠埃希菌BL21，IPTG诱导表达，表达产物进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果 从弓形虫基因组DNA中扩增出P22基因编码序列，并诱导表达出能被兔抗弓形虫血清识别的重组P22。结论 成功获得弓形虫表面抗原P22的表达产物，为弓形虫病的诊断和疫苗研究创造了条件。     

弓形虫表面抗原SAG3基因片段克隆及序列测定

目的 克隆弓形虫ZS2及RH株SAG3表面抗原基因片段，并进行序列分析。方法 设计合成引物，从弓形虫ZS2、RH及ZS1株基因组DNA中分别特异扩增出编码SAG3抗原的基因片段。扩增的目的片段经纯化后用EcoRⅠ和BamH Ⅰ双酶切后，克隆到原核表达质检pGEX-47-2中，转化入大肠杆菌JMl09，用PCR初筛，将PCR扩增阳性的重组子用EooRⅠ和BamH Ⅰ双酶切鉴定，并进行序列的测定。结果 从弓形虫ZS2、RH和ZS1株DNA中扩增出1176bp的SAG3基因，构建重组质检pGEX-47-2-SAG3(pGEX—SAG3)，酶切产物的大小分别与预期相符。结论 成功地对弓形虫ZS2、RH和ZS1株SAG3基因进行体外扩增及构建原核表达重组质检pGEX-SAG3，并经酶切及序列分析所验证，为弓形虫SAG3表面抗原的表达、体外诊断研究做好准备。     

弓形虫表面抗原P22基因片段的克隆、表达及鉴定

目的　扩增弓形虫表面抗原P2 2基因编码序列 ,并进行表达和鉴定。　方法　设计合成引物 ,PCR法从RH株弓形虫基因组DNA中扩增P2 2基因编码序列 ,克隆入载体pET 3 2a ,转化大肠埃希菌BL2 1,IPTG诱导表达 ,表达产物进行SDS PAGE和Westernblot鉴定。　结果　从弓形虫基因组DNA中扩增出P2 2基因编码序列 ,并诱导表达出能被兔抗弓形虫血清识别的重组P2 2。　结论　成功获得弓形虫表面抗原P2 2的表达产物 ,为弓形虫病的诊断和疫苗研究创造了条件。     

弓形虫表面抗原P22蛋白的研究进展

弓形虫(Toxoplasma gondii)是专性寄生于人和多种动物组织有核细胞内的原虫，呈世界性分布。近年来关于弓形虫细胞表面抗原作为诊断试剂及免疫疫苗的双重潜在价值得到广泛研究，主要发现有5种表面抗原：P22、P23、P30、P35、P43。其中P22基因依据克隆的顺序也被称为SAG2。本文就弓形虫重要抗原P22的基因和蛋白结构，及该抗原在弓形虫虫株的分型、血清诊断、疫苗方面的研究作简要介绍。     

弓形虫表面抗原P30基因分枝杆菌-大肠杆菌穿梭表达重组质粒的构建及序列测定

目的　构建编码弓形虫RH株表面抗原P30基因的分枝杆菌 -大肠杆菌穿梭表达重组质粒并进行其序列测定。方法　弓形虫RH株腹腔接种小鼠 ,收集腹水 ,酚 /氯仿法抽提基因组DNA ;根据基因库P30基因序列设计合成一对引物 ,采用PCR法扩增编码P30的基因片段 ,经低熔点琼脂糖法回收并纯化 ;将P30基因定向克隆到分枝杆菌 -大肠杆菌穿梭表达质粒 ,转化大肠杆菌DH5dα,在卡那霉素阳性LB培养基平板筛选阳性重组子 ,并经双酶切及PCR鉴定 ;最后对重组子进行序列测定。结果　PCR所扩增的P30基因片段为 10 37bp ,阳性重组质粒pBCG -P30经XbaI+KpnI双酶切 ,获得包含P30和热休克蛋白 (hsp70 )启动子的复合基因片段 ,此片段的大小为 1170bp ,与预期的理论值相符合。序列测定分析进一步表明所克隆的基因为编码P30抗原的基因片段。结论　成功构建编码弓形虫表面抗原P30基因大肠杆菌 -分枝杆菌穿梭质粒pBCG -P30。     

应用聚合酶链反应技术建立弓形虫表面抗原基因的克隆与测定

弓形虫主要表面抗原Ｐ３０存在于弓形虫表膜及纳虫泡内的一种蛋白，是刺激机体产生免疫反应的主要抗原。以自行设计合成的一对引物，用聚合酶链反应的方法，从弓形虫基因组ＤＮＡ中将Ｐ３０编码基因调出，经纯化及相应酶切后，插入质粒ｐＢＶ２２０中构成重组质粒ｐＢＶ２２０－Ｐ３０。经Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法测序确证该重组质粒中的插入片段即为Ｐ３０基因。     

编码弓形虫表面抗原P30、P22复合基因真核表达载体的构建

目的 构建编码弓形虫RH株表面抗原P30、P22复合基因的真核表达重组质粒，为进一步表达融合蛋白及研制核酸疫苗做准备。方法 用弓形虫RH株腹腔接种小鼠，收集腹水，酚／氯仿法抽提弓形虫基因组DNA；用PCR技术从基因组DNA中扩增编码表而抗原P30、P22的基因片段，分别重组入pMD18T载体中。将pMD18-T载体中的P30、P22基因片段分别酶切，定向克隆入pUC18克隆载体中，pUC18-P30-P22中的P30P22片段经酶切、纯化后，亚克隆入pcDNA3．1(-)真核表达载体，用酶切、PCR及测序的方法对重组子进行鉴定。结果 从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出特异的P30及P22片段；大小均与预测值相符；克隆pUC18-P30P22重组质粒的酶切片段分别与P30、P22基冈大小一敛：经亚克隆、筛选鉴定获得了pcDNA3．1-P30-P22重组质粒，所测P30、P22基因序列与文献报道一致。结论 成功构建弓形虫pUC8-P30P21重组质粒和pcDNA3．1-P30-P22重组质粒，为研制弓形虫DNA疫苗奠定了基础。     

编码弓形虫表面抗原P30、P22复合基因真核表达载体的构建

目的　构建编码弓形虫RH株表面抗原P30、P22复合基因的真核表达重组质粒, 为进一步表达融合蛋白及研制核酸疫苗做准备。　方法　用弓形虫RH株腹腔接种小鼠,收集腹水,酚/氯仿法抽提弓形虫基因组 DNA;用 PCR技术从基因组DNA中扩增编码表面抗原 P30、P22 的基因片段,分别重组入 pMD18 T载体中。将 pMD18 T载体中的P30、P22基因片段分别酶切,定向克隆入 pUC18克隆载体中, pUC18 P30 P22 中的 P30 P22 片段经酶切、纯化后,亚克隆入 pcDNA3.1( )真核表达载体,用酶切、PCR及测序的方法对重组子进行鉴定。　结果　从弓形虫 RH株基因组DNA中扩增出特异的P30及P22片段;大小均与预测值相符;克隆 pUC18 P30 P22 重组质粒的酶切片段分别与 P30、P22基因大小一致;经亚克隆、筛选鉴定获得了 pcDNA3.1 P30 P22重组质粒,所测P30、P22基因序列与文献报道一致。结论　成功构建弓形虫 pUC18 P30 P22重组质粒和 pcDNA3.1 P30 P22 重组质粒,为研制弓形虫 DNA疫苗奠定了基础。     

刚地弓形虫P30(SAG1)基因的克隆与表达

目的构建弓形虫P30基因表达载体并获得重组表达蛋白。方法将弓形虫P30基因的开读框用PCR扩增,NcoⅠ和HindⅢ酶切后,与同样酶切的表达质粒pET30a(+)经T4连接酶连接,然后转化到DH5α中。菌液经PCR扩增和质粒酶切及基因测序鉴定后,将阳性重组质粒转化到大肠埃希菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物用SDS PAGE和Westernblot进行鉴定。结果扩增的P30基因片段为750bp,重组质粒诱导表达产物分子质量单位为30ku,与理论值相符。Westernblot确认重组质粒表达蛋白与小鼠抗弓形虫单克隆抗体(P30McAb)发生特异性反应。结论成功构建重组体并获得弓形虫主要表面抗原P30的高效表达产物,为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。     

弓形虫ZS2株抗原基因的扩增及克隆

扩增弓形虫ZS2株P30抗原基因,构建PcDNA3—P30真核表达重组质粒。方法本文采用PCR技术,自行设计一对寡核苷酸引物（P1,P2）,从弓形虫ZS2基因组DNA中特异扩增出编码P30抗原的基因片段。扩增的目的片段经纯化后用EcoRI和Hind双酶切后,克隆到真核表达质粒pcDNA3中,转化入大肠杆菌TG1,用氨共青霉素和PCR初筛,将PCR扩增阳性的重组子用EcoRI和Kind双酶切鉴定。结果从弓形虫ZS2株DNA中扩增出1025bP的P30基因,构建重组质粒PcDNA3—P30,酶切产物的大小分别与预期相符。结论成功地对弓形虫ZS2株P30基因进行体外扩增及构建真核表达重组质粒PcDNA3—P30,为重组P30抗原及核酸疫苗研究做好准备。     

弓形虫昆山分离株P30抗原基因的克隆与表达

目的 在大肠杆菌中高效表达P30抗原。方法 采用聚合酶链反应（PCR）从弓形虫昆山分离株cDNA文库中扩增得到编码P30抗原的基因,经DNA序列分析后导入表达载体pGEX-5x-3,然后在大肠杆菌BL21中进行表达,用亲和层析柱纯化表达产物,并以SDS－PAGE和Western blotting进行鉴定。结果 1、在我们比较的783个碱基中,弓形虫昆山分离株与RH株之间只有两个碱基不同;2、得到－分子量为54kDa的融合蛋白,占大肠杆菌总蛋白的38％。结论 1、弓形虫昆山分离株与RH株的P30基因没有大的差异;2、在大肠杆菌中得到了P30融合蛋白的高效表达。     

弓形虫P24基因细胞内定位载体重组质粒的构建

目的　构建编码弓形虫 RH株 P2 4基因的细胞内定位载体并进行其序列测定。　方法　弓形虫 RH株腹腔接种小鼠 ,收集腹水 ,Trizol试剂盒抽提基因组 RNA;根据基因库 P2 4基因序列设计合成引物 ,采用 RT- PCR法扩增编码P2 4的基因片段 ,经低熔点琼脂糖法回收并纯化 ;将 P2 4基因定向克隆到细胞内定位载体 p CMV/ myc系列 :p CMV/myc/ cyto(胞质定位 )、p CMV/ myc/ nuc(核定位 )、p CMV/ myc/ mito(线粒体定位 )及 p CMV/ myc/ ER(内质网定位 )。转化大肠杆菌 TOP10感受态细胞 ,在氨苄青霉素阳性 L B培养基平板上筛选出阳性克隆。重组子经双酶切 ,PCR鉴定 ,最后对重组子进行序列测定。　结果　 RT- PCR方法从弓形虫 RH株扩增 5 72 bp的 P2 4基因片段 ,分别构建重组质粒p CMV/ myc/ cyto- P2 4、p CMV/ myc/ nuc- P2 4、p CMV/ myc/ mito- P2 4和 p CMV/ myc/ ER- P2 4 ,酶切和 PCR鉴定产物大小与预期值相符合 ,序列测定分析进一步表明所克隆的基因为编码 P2 4抗原的基因片段。　结论　成功构建编码弓形虫表面抗原 P2 4基因真核细胞内定位载体重组质粒 p CMV/ myc/ cyto- P2 4、p CMV/ myc/ nuc- P2 4、p CMV/ myc/ mito- P2 4和p CMV/ myc/ ER- P2 4     

弓形虫P30抗原基因的PCR扩增及克隆的初步研究

根据已发表的弓形虫主要表面抗原Ｐ３０基因序列，自行设计合成了一对引物，分别在其正义链和反义链的５′末端加上了ＢａｍＨⅠ和ＥｃｏＲⅠ的酶切位点，利用ＰＣＲ技术获取Ｐ３０抗原基因整个开放阅读框架的碱基序列。ＰＣＲ产物经ＢａｍＨⅠ和ＥｃｏＲⅠ双酶切后，与经同样两种内切酶切割的质粒载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ连接构成重组质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ－Ｐ３０，转化大肠杆菌ＤＨ５α。通过遗传标记筛选、ＰＣＲ扩增及酶切分析对重组子进行了鉴定，为进一步选择真核系统或原核系统体外表达该抗原打下了必要的基础。     

弓形虫表面抗原SAG2的DNA疫苗载体构建及在Vero细胞中的表达

目的　构建弓形虫表面抗原SAG2的DNA疫苗载体 ,并在Vero细胞中表达。　方法　设计 1对引物 ,从弓形虫RH株速殖子基因组DNA中扩增SAG2全长编码基因 ,构建 pVAX1 SAG2真核表达重组质粒。以限制性内切酶KpnⅠ和EcoRⅠ进行双酶切、PCR鉴定 ,纯化后进行测序鉴定。脂质体介导法瞬时转染Vero细胞 ,同时以 pVAX1为对照 ,48h后收集细胞 ,Western blot鉴定。　结果　从弓形虫RH株DNA中扩增出了 5 77bp的SAG2基因 ,构建了真核表达载体 pVAX1 SAG2 ,在质脂体介导下转染Vero细胞 ,质粒DNA成功的转染到细胞中。通过Westen blot分析 ,细胞裂解液样品有 1条可被弓形虫免疫血清所识别的约 17ku大小的条带 ,与预计大小一致。　结论　真核表达载体pVAX1 SAG2在Vero细胞中有一定表达 ,且有一定的活性。