外周血内皮祖细胞体外培养分化研究

目的从人外周血中分离、培养和鉴定内皮祖细胞(EPCs),并观察其在体外增殖分化过程中各种细胞表型的变化.方法采用密度梯度离心方法获得外周血单个核细胞,体外进行诱导、分化和扩增,于培养第7天选择免疫荧光(DiI-acLDL/ FITC-UEA-Ⅰ)鉴定EPCs,并且用流式细胞仪和RT-PCR方法观察上述细胞在第0、4、10和21天的CD34、CD31、KDR和eNOS的表达变化.结果外周血单个核细胞在培养过程中出现梭形贴壁和铺路石样等形态;第7天免疫荧光染色表明,约70%的细胞呈双荧光阳性;流式细胞仪分析显示,CD31和KDR表达在体外培养过程中逐渐升高,至第21天分别达到(72.1±11.2)%和(81.0±12.5)%,而CD34在第10天达到高峰(38.0±13.4)%后,第21天下降为(28.3%±12.2)%;RT-PCR结果表明,第4、10和21天eNOS的表达逐渐增强.结论本试验成功从外周血单个核细胞中分离培养出EPCs,在其体外扩增分化为成熟内皮细胞的过程中,CD31、KDR和eNOS等内皮细胞标志表达逐渐增强,而CD34的表达在内皮祖细胞的成熟分化过程中略有下降.     

VEGF,b-FGF诱导的人外周血单个核细胞向血管内皮祖细胞分化的研究

目的:研究在VEGF, b-FGF诱导下人外周血单个核细胞向血管内皮祖细胞(EPCs)分化的方法. 方法: 采集健康志愿者外周血,经Ficoll密度梯度离心法获取单个核细胞,在加有VEGF, bFGF的M199培养基中培养,培养第7 d,免疫组化(SABC法)和免疫荧光检测细胞表面抗原的表达. 结果: 人外周血单个核细胞(MNCs)经体外VEGF, b-FGF的诱导分化,表达EPCs的表面标志KDR, CD133和CD34. 结论: 外周血来源的MNCs能在一定的培养条件下可以诱导分化为EPCs.     

VEGF,b-FGF诱导人脐血单个核细胞向血管内皮祖细胞分化的研究

目的:研究VEGF, b-FGF诱导下人脐血单个核细胞向血管内皮祖细胞(EPCs)分化.方法:从新鲜脐血中用Ficoll密度梯度离心法获取单个核细胞,在加有VEGF,bFGF的M199培养基中培养,培养7 d,免疫组化(SABC法)和免疫荧光检测细胞表面抗原的表达.结果:人脐血血单个核细胞(MNCs)经体外VEGF, b-FGF的诱导分化,表达内皮祖细胞的表面标志KDR, CD1133和CD34.结论:人脐血单个核细胞在一定的培养条件下可诱导分化为内皮祖细胞.     

猪外周血内皮祖细胞的分离培养及生物学特性

目的从小型猪外周血中分离、培养内皮祖细胞(EPCs),并进行相关鉴定,分析其生物学特性。方法采用密度梯度离心法获得小型猪外周血单个核细胞并进行体外传代培养,分别采用倒置相差显微镜观察、免疫荧光染色、流式细胞仪分析及Matrigel实验和DiI-acLDL摄取实验,对其细胞表型及功能进行相关鉴定。结果外周血单个核细胞在培养过程中出现梭形贴壁和铺路石样形态;培养第14天,约80%的细胞DiI-acLDL吞噬实验阳性,且CD133、CD34、flk-1、CD31、CD144的表达阳性率分别达到25.1%、55.9%、97.7%、82.0%和95.4%;细胞培养于凝固的Matrigel表面7 d后,形成特征性的网格状结构。结论该实验成功从小型猪外周血单个核细胞中分离培养出EPCs,在其体外扩增诱导的过程中,表达EPCs和成熟内皮细胞的特征性标志。     

猪外周血内皮祖细胞的分离培养及生物学特性

目的 从小型猪外周血中分离、培养内皮祖细胞(EPCs),并进行相关鉴定,分析其生物学特性.方法 采用密度梯度离心法获得小型猪外周血单个核细胞并进行体外传代培养,分别采用倒置相差显微镜观察、免疫荧光染色、流式细胞仪分析及Matrigel实验和DiI-acLDL摄取实验,对其细胞表型及功能进行相关鉴定.结果 外周血单个核细胞在培养过程中出现梭形贴壁和铺路石样形态;培养第14天,约80%的细胞DiI-acLDL吞噬实验阳性,且CD133、CD34、flk-1、CD31、CD144的表达阳性率分别达到25.1%、55.9%、97.7%、82.0%和95.4%;细胞培养于凝固的Matrigel表面7 d后,形成特征性的网格状结构.结论 该实验成功从小型猪外周血单个核细胞中分离培养出EPCs,在其体外扩增诱导的过程中,表达EPCs和成熟内皮细胞的特征性标志.     

人脐血内皮祖细胞的体外培养

目的从人脐带血中分离内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）,建立人脐血内皮祖细胞体外培养的方法,为实现内皮祖细胞的移植及实验研究提供足量的细胞来源。方法采用密度梯度离心法分离人脐带血内皮祖细胞,在EGM-2培养基中培养,采用流式细胞仪、免疫组化和免疫荧光鉴定EPCs。结果脐带血单个核细胞在经EGM-2培养过程中出现梭形贴壁和铺路石样等形态;1周后既分化成EPCs,细胞免疫荧光CD133染色率在培养第7天为（67.2±2.12）%,免疫组化CD34染色率为（89.67±2.05）%,流式细胞仪鉴定该种细胞CD133与KDR的双阳性率达87.8%。可确定该细胞为EPSc。结论采用本培养方法可获得良好的内皮祖细胞用于实验研究。     

人外周血内皮前体细胞的分离、培养及流式细胞仪动态检测

目的:建立人外周血内皮前体细胞（EPCs）分离、诱导的方法,并利用流式细胞仪鉴定人内皮前体细胞的培养效果,为血管生成的细胞治疗研究奠定基础。方法：Ficoll密度梯度离心提取单个核细胞（MNCs）,接种在人纤连蛋白包被的培养板上,培养于EGM 2MV中,4?d后,粘附细胞用Dil AC LDL和FITC UEA 1染色,采用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜观察。第4天到第7天,应用流式细胞仪动态检测粘附细胞表面标志CD34、CD31、KDR。结果：MNCs培养4?d后,荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜下可观察到Dil AC LDL和FITC UEA 1双阳性的粘附细胞,流式细胞仪检测结果显示,CD34、CD31、KDR阳性细胞表达率分别为（2.50±1.47）%、（5.72±1.66）%、（36.24±3.24）%。第5、6和7天,CD34和CD31阳性细胞阳性率分别为（8.45±3.97）%、（22.52±3.86）%,（14.13±2.79）%、（42.76±3.67）%,（21.14±2.91）%、（54.67±3.44）%。结论：外周血中确实存在EPCs,并且在体外能被诱导分化为成熟的内皮细胞。     

外周血内皮祖细胞改善肢体缺血的研究

目的:研究人外周血来源内皮祖细胞(EPC)移植对改善肢体缺血的作用. 方法:人外周血单个核细胞在体外诱导扩增6 d和14 d后,分别检测其EPC特异性标志的表达,并将荧光染料标记后的培养第6日的贴壁细胞通过缺血局部多点注射移植到后肢缺血的裸鼠动物模型体内,以评价其治疗效果. 结果:人外周血单个核细胞经体外诱导分化,培养第6日的贴壁细胞表达KDR, CD133, CD34和vWF,流式细胞仪检测其阳性率分别为(46.4±9.3)%, (33.8±11.7)%, (73.5±6.3)%和(38.9±8.2)%;培养第14日的贴壁细胞KDR, CD34和vWF的表达阳性率均增高,而CD133表达阳性率明显降低,流式细胞仪检测其阳性率分别为(81.5±7.6)%, (88.9±5.4)%, (78.3±13.6)%和(3.8±8.7)%;移植EPC后裸鼠缺血后肢的坏死情况和毛细血管密度均较对照组明显改善(P＜0.05);移植EPC后缺血后肢肌肉石蜡切片中可见分散不均的红色和黄绿色双色荧光的细胞掺入. 结论:从人外周血单个核细胞中可诱导出EPC,而且移植的EPC可以定向整合到后肢缺血局部,明显改善裸鼠后肢缺血.     

人循环内皮祖细胞的分离培养和诱导分化

目的研究人循环内皮祖细胞（EPCs）分离、培养、分化及鉴定。方法采用Ficoll密度梯度离心法从人外周血中分离单个核细胞,接种于含血管内皮生长因子（VEGF）及优质胎牛血清的M199培养液中,对其进行体外诱导分化培养,以免疫组化、细胞荧光化学法及流式细胞检测法鉴定贴壁细胞的内皮细胞特异性标志。结果人外周血单个核细胞（MNCs）经体外培养,表达内皮细胞的特异性抗原,包括VWF、CD31和CD34,并显示出能内吞乙酰化低密度脂蛋白（ac-LDL）,结合UE小1等内皮细胞特性,提示这些细胞具有内皮细胞的表面蛋白特性和具有内皮细胞功能。结论人外周血中存在具有分化增殖能力的EPCs,在一定培养条件下可分化为血管内皮细胞。     

大鼠外周血内皮祖细胞体外向内皮细胞诱导分化时的表型变化特征

目的 研究大鼠外周血内皮祖细胞(EPC)体外分化为内皮细胞的过程中,干细胞标志物以及内皮细胞表型的变化.方法 取SD大鼠外周血,应用Ficoll密度梯度离心的方法获得单个核细胞,体外培养于纤连蛋白处理的培养皿中,同时应用VEGF和bFGF诱导,使之向内皮细胞转化,用免疫组织化学方法检测细胞CD31、CD34、Flk-1、vWF在第1～7天的表达.结果 贴壁细胞的CD31、CD34、Flk-1、vWF在不同时段呈不同程度的表达.干细胞的标志物CD31、CD34的表达逐步减弱,第6天时消失.内皮标志物Flk-1和 vWF表达逐步增强,第7天时达100%.结论 大鼠外周血干细胞向内皮祖细胞分化的过程中,干细胞标志物逐渐消失,内皮细胞的表型逐步显现.     

小儿骨髓内皮细胞和内皮祖细胞的培养及鉴定

目的探索小儿骨髓内皮细胞和内皮祖细胞的分离培养,为组织工程血管、补片或带瓣管道的制备找新的种子细胞来源.方法采集小儿骨髓,梯度密度离心法分离单核细胞,内皮细胞培养液EGM-2培养,种植于提前包埋了纤维连接蛋白的培养皿进行体外扩增,分别取48 h内贴壁细胞和48 h后贴壁细胞,应用免疫组化和免疫荧光技术鉴定内皮细胞系列标志:CD34、CD31、FLK-1、VE-Cadherin和Ⅷ因子以及祖细胞标志CD133.结果经过梯度密度离心和贴壁法选择的细胞表达内皮细胞特异性抗原CD34、CD31、FLK-1、VE-Cadherin和Ⅷ因子,部分表达CD133.培养至第5代细胞形态基本相似,细胞总数可以达到108以上.结论自小儿骨髓可以分离培养出内皮细胞和内皮祖细胞并能体外扩增,可以作为构建组织工程血管、补片或带瓣管道的种子细胞来源.     

人主动脉内皮细胞的培养及免疫细胞化学研究

人主动脉内皮细胞体外长期培养在国内首次成功。内皮细胞培养10～15代,细胞倍增时间20h～25h,累积倍增数25～30。应用相差显微镜,扫描、透射电镜,Ⅷ因子相关表面抗原的免疫荧光抗体及血管紧张素转换酶的单克隆抗体,对培养的人主动脉内皮细胞进行形态学及免疫细胞化学的观察与研究。证明,长期培养后的多核内皮细胞是具有内皮细胞特点的变形内皮细胞。     

内皮祖细胞的生物学特性研究进展

内皮祖细胞在体内外能分化为成熟内皮细胞。目前,内皮祖细胞已被证实存在于成年人外周血,骨髓和人脐带血中。本综述总结了近年来内皮祖细胞的生物学研究进展,并讨论了其在心血管疾病中的潜在的治疗作用。     

大鼠胸主动脉内皮细胞培养方法的改进

目的：建立一种简单易行的SD大鼠胸主动脉的内皮细胞培养方法。方法：分离大鼠胸主动脉,清除血管外结缔组织,将其剪成厚约1.5mm的血管环,以15-20个血管环密度接种于25 cm^2培养瓶中,以含20%胎牛血清的DMEM液培养,60h后去掉血管环。待细胞生长达单层融合时,消化传代。对P2代细胞应用抗Ⅷ因子抗体进行鉴定。结果：60h后,细胞呈集落样散在分布于瓶底;7-9d细胞汇合成单层,呈铺路石状。经Ⅷ因子相关抗原免疫组化鉴定,所培养细胞为内皮细胞。结论：血管环贴壁法培养SD大鼠胸主动脉内皮细胞简易可行。     

体外定向诱导胚胎干细胞分化为内皮细胞及其与脐静脉内皮细胞的比较

目的：研究干细胞定向分化为内皮细胞的效率,并与人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)比较。方法：用两步法诱导干细胞HUES9分化为内皮细胞,前3 d在N2B27培养基中加入骨形态发生蛋白4 (25 ng/mL)和肝糖原合成激酶3β受体的选择性抑制剂CHIR99021(10 μmol/L)使细胞分化到中胚层状态,第4天开始用 VEGF165(200 ng/mL)和Forskolin(2 μmol/L)将细胞诱导为内皮细胞。观察分化第6天细胞形态,并与HUVECs比较。用 CD144作为内皮细胞表面标志物,流式细胞术检测分化效率及分化后细胞的身份。比较两种内皮细胞迁移和成管能 力。结果：分化后的内皮细胞与HUVECs在显微镜下形态一致。分化细胞表面标志物阳性率达到73.4%,重新培养后 的内皮细胞表面CD144阳性率达到86.6%,HUVECs为94.4%。分化后的内皮细胞与HUVECs均具有良好的迁移和成管 能力,但分化后的内皮细胞能力不如HUVECs强。运用SB431542后,能够提高分化后内皮细胞的迁移和成管能力。 结论：此两步法将干细胞分化为内皮细胞有较高的分化效率,可作为理想的分化方法。     

壳多糖对兔主动脉平滑肌细胞和内皮细胞增殖的影响

目的：研究壳多糖对体外培养的兔主动脉平滑肌细胞和内皮细胞生长的影响。方法：将不同质量浓度（０．２,２,２０,２００,２０００μｇ／ｍｌ）的壳多糖溶液分别加入兔主动脉平滑肌细胞和内皮细胞培养液中,培养１２,２４,４８ｈ后用ＭＴＴ经色法测定细胞数。结果：平滑肌细胞数随着壳多糖质量浓度和作用时间的增加而减少;内皮细胞数随着其质量浓度和作用时间的增加,在一定范围内相应增加。结论：壳多糖能抑制兔主动脉平滑肌     

兔骨髓诱导的内皮细胞和纤维蛋白凝胶体外共培养

目的将兔骨髓诱导的内皮细胞接种于纤维蛋白凝胶内并观察其生长增值情况。方法梯度离心分离兔骨髓单个核细胞（MNCs）,直接向内皮细胞诱导培养,传代培养至第2代细胞,倒置显微镜观察细胞形态及生长特点,免疫组化鉴定;以10^5密度接种于纤维蛋白凝胶中培养并定期观察细胞生长情况,单纯细胞及胶原内的细胞分别用MTT法检测其生长并绘制生长曲线,胶原切片并作苏木精．伊红染色观察细胞在胶原内的生长。结果诱导的内皮细胞为铺路石样。呈单层生长,第2代细胞CD31、八因子相关抗原免疫组化均为阳性,摄取低密度脂蛋白和结合凝集素实验均阳性;细胞在纤维蛋白凝胶内成立体生长,细胞在纤维蛋白凝胶内3d后成梭形铺开,6d后自发形成管腔样结构;细胞在纤维蛋白凝胶内生长曲线成“s”形。结论骨髓诱导的内皮细胞在纤维蛋白凝胶内生长增值良好,纤维蛋白凝胶可以作为接种骨髓诱导的内皮细胞的基质材料。     

表达内皮抑素基因的内皮祖细胞治疗肝癌的初步研究

目的:观察内皮抑素(endostatin,ES)基因转染的内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)对小鼠肝癌细胞H22增殖的影响,探讨联合自体EPCs和ES基因治疗肝癌的可行性和有效性?方法:构建表达ES基因的慢病毒载体,培养小鼠骨髓源EPCs,运用qPCR检测培养内皮细胞表面标记CD31?血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)?血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)表达,电镜观察内皮细胞特征小体?实验分EPCs组?EPCs+LV空病毒载体组?EPCs+ES组?CCK-8法检测各组细胞增殖的情况?同时构建原位肝癌小鼠模型,尾静脉注射3组细胞后不同时间点处死小鼠,测量肿瘤大小并进行统计分析?结果:①酶切和测序?PCR鉴定证实成功构建慢病毒载体pLenti6.3-ES-Monomer-DsRed;②qPCR显示培养细胞表达内皮细胞标志CD31?VEGFR?vWF,透射电镜下在细胞质内可见多个散在内皮细胞特征性Weibel-Palade小体(WP小体);③慢病毒载体Lenti6.3-ES-Monomer-DsRed转染小鼠骨髓源性EPCs后荧光显微镜下可见细胞呈红色荧光;EPCs+ES组细胞上清较对照组上清液对小鼠肝癌细胞H22体外增殖具有明显抑制作用,体内实验显示EPCs+ ES组肝癌生长速度慢于对照组?结论:小鼠骨髓源单个核细胞体外可以诱导培养为内皮祖细胞,负载ES基因的EPCs体外可以抑制小鼠肝癌细胞H22的增殖,体内可以抑制小鼠肝癌生长?     

诱导正常血管内皮细胞具备肿瘤血管特性的研究

[目的]探讨用肿瘤细胞培养上清液诱导的人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)是否具备肿瘤血管内皮细胞的特性,旨在寻找一种简便的方法,解决肿瘤血管内皮细胞不易获得的难题.[方法]HUVEC用含不同浓度人肝癌细胞株HepG2培养上清的条件培养液培养,3-(4,5-二甲基噻唑)-5-(3-羧甲酯基)-2-(4-磺苯基)-2氢-四唑盐法(MTS)检测其增殖率,免疫细胞化学法结合图像定量分析测量血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR2)的变化,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测肿瘤内皮标记物1和8(TEM1、TEM8)的mRNA表达.[结果]含体积分数10%、20%、40%HepG2培养上清的条件培养液培养,HUVEC增殖率分别为71%、89%、109%.HUVEC用含体积分数50%HepG2培养上清液的条件培养液培养后,VEGFR2平均光密度值明显高于对照组(P＜0.05),且TEM1及TEM8呈阳性表达,而对照组不表达.[结论]HepG2上清液促进HUVEC增殖,增殖后的HUVEC具备肿瘤血管内皮细胞的特性.