HBV P基因YMDD变异的检测及临床应用的初步研究

目的采用错配PCR扩增方法进行HBVP基因YMDD变异的检测，对其临床意义进行初步的研究。方法应用分子克隆方法，构建YMDD、YVDD和YIDD变异的阳性质粒，并对该方法进行敏感性及特异性试验。对65例未经抗病毒治疗的乙型肝炎患者检测YMDD变异情况。结果经PCR方法、酶切鉴定及直接测序鉴定出YMDD、YVDD和YIDD质粒构建成功，且该方法具有较好的敏感性和特异性。65例未经拉米夫定治疗的乙型肝炎患者存在YMDD变异，出现变异6例，阳性率为9．07％；其中YIDD和YI／YMDD各1例，YVDD3例，YV／YMDD1例。结论本检测方法简便、实用，在未经抗病毒治疗的患者中可存在YMDD变异，其与野生株一样是自然存在的，抗病毒药物压力不是导致HBV YMDD变异的唯一因素。     

未经拉米夫定治疗而发生乙型肝炎病毒YMDD变异的临床分析

目的探讨未经抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者乙肝病毒（HBV）的YMDD基因变异情况。方法采用PCR荧光法诊断YMDD基因变异。结果84例慢性乙型肝炎HBV YMDD变异阳性17例,阴性67例。17例YMDD变异的患者中12例从未应用过抗病毒药物,5例曾行抗病毒治疗。结论未经抗病毒治疗的乙型肝炎患者亦存在较高的YMDD变异率,临床上在应用抗病毒治疗前应对患者是否存在YMDD基因变异进行检测。     

应用实时荧光PCR方法检测乙型肝炎病毒基因YMDD变异

[目的]建立一种检测乙型肝炎患者YMDD变异株的方法,并且研究应用拉米夫定治疗及未用药治疗的乙型肝炎初发患者中YMDD变异株发生的情况。[方法]应用实时荧光聚合酶链反应（PCR）方法对30例未经过任何药物治疗的乙肝初发患者,50例使用拉米夫定治疗1年患者,50例使用拉米夫定治疗两年患者和20例使用拉米夫定与干扰素联合治疗两年的患者同时进行YMDD变异株的检测。[结果]通过对熔解曲线的分析,在未经任何治疗的乙肝初发患者中检出YMDD变异株2例,占6．67％;拉米夫定治疗1年的患者中检出YMDD变异株13例,占26.00％;拉米夫定治疗两年患者中检出YMDD变异株25例,占50．00％;拉米夫定和干扰素联合治疗的患者中检出YMDD变异株9例。占45．00％。[结论]在未经任何药物治疗的乙肝患者中即存在YMDD变异株,并且随着使用拉米夫定时间的延长在不断增加,且联合用药并不能减少变异株的发生,因此对乙肝患者在用药前,及用药过程中进行YMDD变异株的检测是非常必要的。而实时荧光PCR方法具有简便、快速、灵敏、经济的特点,特别适用于临床对YMDD变异株的检测,从而及时的指导临床用药。     

乙型肝炎病毒感染者YMDD自然变异研究

目的了解未经抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者中HBVP基因YMDD变异情况，并观察YMDD自然变异组与非变异组临床病情轻重的关系。方法采用PCR和荧光探针杂交检测技术，检测60例慢性乙型肝炎患者血清HBV YMDD自然变异情况。结果在60例患者中，YMDD变异阳性5例(8．33％)，阴性55例，5例变异中2例为YIDD阳性，3例为YVDD阳性。结论未经抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者存在YMDD自然变异株；YMDD自然变异的患者没有临床病情加重的趋势。     

拉米夫定治疗中乙肝病毒多聚酶YMDD变异对患者临床经过的影响

目的：研究乙肝病毒（HBV）多聚酶YMDD变异后HBV DNA复现对慢性HBV感染患者临床经过的影响。方法：用mp PCR-RFLP技术检测24例拉米夫定治疗过程中出现HBV DNA复现的患者血清,对YMDD变异者的系列临床资料,应用SAS软件进行统计学分析。结果：检出YMDD变异18例;YMDD变后转氨酶水平较HBV DNA转阴时有显著升高,并反跳至治疗前水平。结论：YMDD变异后,部分病例可有类似肝炎发作、甚至肝脏失代偿的表现。     

基因芯片检测拉米夫定引起的乙型肝炎病毒基因YMDD变异的研究

目的:建立乙型肝炎病毒(HBV)变异基因诊断芯片,对拉米夫定治疗慢性乙型肝炎过程中出现的肝炎病毒P基因区YMDD变异进行快速准确的检测诊断。方法:设计特异性寡核苷酸探针。用点样法制备HBV变异基因诊断芯片。选择住院患者30例服用拉米夫定后,HBVDNA转阴[<500拷贝(opies/ml)]68周后又反跳≥5000copies/ml的患者进行基因芯片杂交检测。同时用PCR直接测序法对30例患者血清标本进行双盲HBVDNA聚合酶活性区域测序对照。结果:30例服药后HBVDNA反跳患者中基因芯片测得HBVYMDD变异21例,其中YVDD变异11例,YIDD变异10例。直接序列测定发现有核苷酸A741变为G,使氨基酸由蛋氨酸552变为缬氨酸(氨基酸基序由YMDD变为YVDD)11例,有6例核苷酸A669变为C,使氨基酸由亮氨酸528变为蛋氨酸;核苷酸G743变为T,使氨基酸由蛋氨酸552变为异亮氨酸(氨基酸基序由YMDD变为YIDD)10例。其中有3例伴有核苷酸T781变为C,使氨基酸由亮氨酸565变为脯氨酸。其结果与基因芯片完全一致。结论:HBV变异基因诊断芯片可以同时检测YVDD、YIDD变异,同PCR直接测序法比较,准确率达100%,无假阳性。     

基因芯片检测HBV YMDD变异的临床应用研究

目的应用基因芯片检测慢性乙型肝炎患者拉米夫定治疗过程中HBV YMDD变异类型以及与抗病毒疗程的关系。方法169例接受拉米夫定治疗(100mg/d,1次/d,疗程6~36个月)的慢性乙型肝炎患者和51例未抗病毒治疗的慢性乙肝患者,采用基因芯片方法检测HBV YMDD变异,荧光定量PCR检测HBV DNA含量。所有患者HBV DNA定量值均≥5×104拷贝/ml。结果①未抗病毒治疗的51例患者检出单纯YMDD阳性(未变异)35例(71.4%),变异14例(28.6%),3种变异模式,且均与野生株并存:Y(M/V)DD(10例),Y(M/I)DD(3例),Y(M/V/I)DD(1例);②接受拉米夫定治疗的169例患者单纯YMDD阳性18例(13.7%),变异113例(86.3%),显著高于未抗病毒治疗组(χ2=57.1,P<0.01),有6种变异模式:Y(M/V)DD(39例),Y(M/I)DD(10例),Y(M/V/I)DD(16例),YVDD(15例),YIDD(22例),Y(V/I)DD(11例);③抗病毒治疗6个月YMDD变异率66.7%(22/33),以Y(M/V)DD和Y(M/I)DD为主;~12个月变异率89.3%(25/28),以Y(M/V)DD,YIDD和Y(M/V/I)DD为主;~18个月变异率85.7%(18/21),以Y(M/V),YIDD和YVDD/YIDD为主;~24个月变异率97.5%(39/40),以YVDD,Y(M/V)DD和YIDD为主;治疗>24个月者9例,变异率100.0%(9/9),以YIDD,YVDD/YIDD和Y(M/V/I)DD为主。结论基因芯片检测HBV YMDD变异方法简便,特异性高,变异模式判读直观,结果可靠。抗病毒治疗前后检测YMDD变异情况,对指导和调整抗病毒治疗方案有重要的临床应用价值。     

拉米夫定治疗慢性乙型肝炎发生病毒学反弹患者YMDD变异分析

选取402例服用拉米夫定后出现乙型肝炎病毒(HBV)DNA反弹的慢性乙型肝炎(CHB)患者血清样品,应用荧光PCR法定性检测YMDD变异情况。402例中有309例(76.87%)检测出YMDD变异,其中120例为YVDD变异,74例为YIDD变异,115例为YVDD+YIDD联合变异;309例YMDD变异患者中同时检测出变异株与野生株占69.26%(214/309),仅检测出变异株占30.74%(95/309)。另外,93例为YMDD野生型阳性。     

基因芯片技术在检测乙型肝炎病毒 P区YMDD变异中的研究

目的 用基因芯片检测未经抗病毒治疗的HBV DNA阳性血清中HBV P区YMDD变异情况,从分子生物学角度了解YMDD两种变异的状态,为科学合理地指导临床抗病毒治疗及预测患者临床预后提供有力的依据。方法 将150份未经抗毒治疗的HBV DNA阳性血清,用PCR方法扩增P区,扩增产物与基因芯片上的寡核苷酸进行杂交,杂交结果通过扫描仪扫描到计算机上,经软件分析可得到HBVY MDD野生型及其YVDD和／或YIDD变异型结果,并对部分阳性标本用基因序列测序证实。结果 150份HBV DNA阳性血清,用基因芯片方法检出阳性标本(包括YMDD野生型和变异型)共122例,占81．3％,阴性标本28例,占18．7％;在122例阳性标本中,单纯YMDD野生型(即无变异标本)有90例,占73．8％;YVDD变异28例,占22．9％;YIDD变异2例,占1．6％;YVDD和YIDD混合变异2例,占1．60A,,变异株检出率为26．2％,而且变异株均与野生株共存。其中8份阳性标本进行基因序列测序,证实与芯片检测结果完全一致。结论(1)用当前先进的基因芯片技术检测HBVP区YMDD变异,操作简便,结果可靠,特异性高。(2)基因芯片可快速、同时、多人份检出HBVYMDD野生株及其YIDD和／或YVDD突变株的共同感染。(3)部分HBV感染者在未经抗病毒治疗情况下已自然存在HBV YMDD变异,而且变异株均与野生株共存,其中以YVDD变异为多。(4)HBV感染患者在治疗前后有必要检测是否存在HBV YMDD变异株感染,为指导临床科学合理用药和制定治疗方案提供依据。     

乙型肝炎病毒基因YMDD突变检测结果分析及临床意义

目的：检测乙型肝炎患者HBV基因突变，为临床治疗乙型肝炎联合用药或单一用药提供实验室依据。方法：采用BocheLightCycler^TM荧光PCR定量分析仪，应用FQ—PCR技术进行乙肝病毒基因突变(YMDD)及HBV—DNA的检测。结果：经半年以上的临床治疗观察，拉米夫定加胸腺肽联合用药组20例乙肝患者未检测出YMDD变异株，用药后HBV-DNA和ALT检测指标分别随治疗的进展拷贝数降低和恢复正常；而单一服用拉米夫定药物治疗组37例乙肝患者，检测出发生YMDD变异有8例，阳性率5．4％和8．1％。结论：乙型肝炎病毒耐药基因(YMDD)突变的检测有助于临床有效治疗。     

拉米夫定治疗中乙型肝炎病毒YMDD变异的研究

目的观察拉米夫定治疗慢性乙型盱炎后乙型肝炎病毒YMDD基序变异的情况。方法105例慢性乙型肝炎患者随机分成两组，一组68例为治疗组给予拉米夫定；另一组37例为对照组，给予除拉米夫定外的其他治疗。治疗1年后对患者乙型肝炎病毒多聚酶基因YMDD基序进行定性检测，观察突变情况。结果拉米夫定治疗组：用药1年后有12例发生YMDD突变，其中YVDD变异有8例，YIDD变异4例，变异株中有9例伴血清ALT、HBV-DNA水平回升；对照组无变异株产生。结论拉米夫定可诱导乙型肝炎病毒YMDD基序发生变异，导致耐药株的产生。     

拉米夫定治疗前与治疗期间乙肝病毒YMDD变异研究

目的研究慢性乙型肝炎患者应用拉米夫定治疗前与治疗一年期间的乙肝病毒YMDD变异情况。方法103例接受拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎患者,在开始治疗前和治疗第1、4、8个月以及1年时采集患者外周血,提取乙型肝炎病毒DNA,采用单核苷酸多态性分析方法,进行短核苷酸片段测序分析。结果乙型肝炎病毒DNA多聚酶区,使用拉米夫定治疗前,发生YVDD变异者1例,发生YIDD变异者2例;治疗第1月,发生YVDD变异者2例,发生YIDD变异者2例;治疗第4月,发生YVDD变异者3例,发生YIDD变异者4例;治疗第8月,发生YVDD变异者6例,发生YIDD变异者8例;治疗1年时,发生YVDD变异者11例,发生YIDD变异者13例。结论在进行拉米夫定治疗前,乙型肝炎病毒即有变异情况发生,随拉米夫定治疗变异率增加治疗1年时,乙型肝炎病毒发生变异率最高。     

乙型肝炎病毒基因型与拉米夫定疗效关系研究

目的 探讨乙型肝炎病毒（HBV）基因型与拉米夫定治疗疗效的关系及其机理。方法 收集拉米夫定治疗的51例慢性乙型肝炎患者的临床资料，分析HBV基因型与拉米夫定治疗疗效的关系。结果 HBV基因型B型对拉米夫定的应答率为45．4％（10／22），C基因型的应答率为20．7％（6／29），两组应答率差异有显著性（P〈0．05）；B基因型的HBeAg的血清转换率为31.8％（7／22），C基因型为13．8％（4／29），经统计学处理差异有显著性（P〈0．05）。结论 拉米夫定治疗慢性乙型肝炎患者，B基因型疗效较C基因型好，HBV基因型可能是预测拉米夫定治疗效果的因素之一。     

海南地区乙型肝炎基因型与YMDD自然突变的相关性

目的：了解海南地区未经抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者YMDD突变和乙型肝炎病毒基因型情况及两者之间的关系。方法：收集49例未使用抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者血清,采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测乙肝病毒表面标志物,PCR-反向点杂交方法测定HBV突变及基因型。结果：49例患者中,检出B型8例（16．33％）,其中发生YMDD自然突变1例（12．5％）;C型34例（69．39％）,其中发生YMDD自然突变6例（17．65％）,YMDD自然突变的发生率C基因型与B基因型相比差异无统计学意义（P〉0．05）;同时两基因型之间乙肝标志物的比较差异无统计学意义（Jp〉0．05）。结论：海南地区慢性乙型肝炎患者中,优势基因型为C型。在未经抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者中存在YMDD变异株。     

乙型肝炎YMDD变异与丙氨酸转氨酶乙型肝炎病毒e抗原及乙型肝炎病毒DNA的关系探讨

目的探讨拉米夫定治疗慢性乙型肝炎期间乙型肝炎病毒(HBV)YMDD变异的情况及其与临床的关系。方法采用通用模板信号扩增(UT-PCR)方法,对拉米夫定治疗过程中血清出现HBV DNA由阴转阳的52例慢性乙型肝炎患者进行HBVYMDD变异检测,并结合患者治疗前HBV DNA载量、丙氨酸转氨酶(ALT)水平、免疫标志物及YMDD变异后HBV DNA载量等临床信息进行结果分析。结果YMDD变异的检出率为53.85%,52例患者中,28例发生了YMDD变异,其中YIDD17例,YVDD7例,YIDD和YVDD混合变异4例。发生YIDD变异的患者较治疗前HBV DNA水平显著降低(P<0.05),发生YVDD变异的患者较治疗前HBV DNA水平差异无统计学意义(P>0.05)。YVDD变异后的HBVDNA水平与YIDD变异后HBV DNA水平差异无统计学意义(P>0.05)。YMDD变异组治疗前的ALT基础水平高于YMDD野生组治疗前水平(P<0.01),治疗前HBVDNA水平及HBeAg阳性率在变异组和野生组中差异无统计学意义(P>0.05)。结论拉米夫定治疗前ALT基础水平高可能是YMDD变异的一个易发因素。密切监控慢性乙型肝炎患者的HBV DNA及ALT水平,有利于及时发现YMDD是否发生变异。     

乙肝病毒基因分型及其临床意义

目的:探讨南通地区乙肝病毒(HBV)基因型分布状况及其临床相关性。方法:选择南通地区HBV-DNA阳性者200例,其中乙肝表面抗原携带者(ASC)28例,慢性乙型肝炎(CHB)89例,重型肝炎(FHF)26例,肝硬化(LH)30例,肝细胞癌(HCC)27例,采用多对型特异性引物巢式PCR法检测HBV基因型。结果:200例中B型51例(25.5%),C型141例(70.5%),BC混合型8例(4.0%);C基因型在FHF组、LC组、HCC组中的比例显著高于ASC组(P<0.05)。B型、C型、BC混合型HBeAg阳性率分别为49.0%、53.2%和37.5%,无统计学意义(P>0.05)。C型和BC混合型HBV-DNA载量显著高于B型,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:南通地区HBV基因型以B、C型为主,C型为优势基因型,并与重型肝炎、肝硬化、肝癌的发生及血清HBV-DNA高载量相关。     

拉米夫定联合苦参素治疗慢性乙型肝炎疗效及对YMDD变异的影响

目的:观察拉米夫定加苦参素联合治疗慢性乙型肝炎的疗效及对慢性乙型肝炎病毒P基因(YMDD)变异的影响。方法:收集乙型肝炎病毒(HBV)HBeAg、HBVDNA阳性的慢性乙型肝炎患者67例,分为拉米夫定加用苦参素组(A组)、单用拉米夫定组(B组)。分别检测血清HBeAg、抗-HBe、HBVDNA、肝脏生化指标和基因YMDD变异。结果:在治疗56周时,拉米夫定联合苦参素组HBeAg/抗-HBe转换率(39.4%)优于拉米夫定组(P<0.05)。HBVDNA阳性率及YMDD变异率都比拉夫米定组低(P<0.05)。结论:拉米夫定联合苦参素能在一定程度上提高治疗慢性乙型肝炎的疗效并可减少YMDD变异。     

慢性乙型肝炎患者拉米夫定治疗不同阶段HBV DNA多聚酶分析

目的分析拉米夫定治疗不同时期HBV DNA多聚酶区耐药突变的变化规律和主要耐药突变的分布情况。方法将接受拉米夫定治疗的98例患者根据治疗时间进行分组,采用PCR方法对其血清HBV多聚酶区进行扩增并对聚合酶链反应（PCR）产物进行直接测序。结果拉米夫定治疗后血清HBV DNA水平≥10^4copies／ml的患者中,治疗时间〈6个月6例,其中1例发生突变;6～12个月13例,其中7例发生突变;12～24个月19例,其中13例发生突变;24～36个月20例,其中19例发生突变,各组之间耐药突变发生率比较差异有统计学意义（P〈0．05）。耐药患者中有10种突变类型,其中以rtM204I突变最多见,为14例（35．0％）,其次为rtL180M／M204V（17．5％）、rtL180M／M2041（12．5％）。结论对拉米夫定治疗6个月以上而没有达到病毒学完全应答的患者进行乙肝病毒基因耐药突变的检测,有助于及时准确的调整治疗方案。     

拉米夫定治疗慢性乙型病毒性肝炎患者YMDD变异及影响因素

目的：探讨慢性乙型病毒性肝炎患者应用拉米夫定治疗后YMDD变异发生率及其影响因素。方法将90例慢性乙肝患者根据治疗方法的不同分为观察组和对照组,对照组应用拉米夫定,观察组应用拉米夫定及干扰素,测定并观察患者治疗前、治疗过程中的HBV DNA载量,血清ALT水平,并分析ALT水平与HBV DNA载量与YMDD变异率的相关性。结果①单用拉米夫定治疗的患者在治疗6个月后YMDD变异的累计发生率明显高于拉米夫定联合干扰素治疗的患者（P〈0.05）;②未联合应用干扰素、ALT水平〈80 U/L、HBV DNA载量〉1.0×10^3 copy/ml是影响YMDD变异的独立危险因素（P〈0.05）;③ALT水平与YMDD变异率呈负相关（r=-0.62,P〈0.05）,HBV DNA水平与YMDD变异率呈正相关（r=0.85,P〈0.05）。结论未联合应用干扰素、ALT水平低以及HBV DNA载量高是慢性乙型病毒性肝炎患者YMDD变异的影响因素,并且ALT水平及HBV DNA载量与YMDD变异率成相关性;临床医师应当通过ALT水平及HBV DNA载量进行指导用药。     

拉米夫定治疗中乙肝病毒聚合酶YMDD变异的早期预测因子研究

目的：建立ＨＢＶ多聚酶ＹＭＤＤ变异的快速检测方法，并藉此进行临床流行病学研究，以了解应用拉米夫定治疗乙肝过程中ＹＭＤＤ变异的发生率及其早期预测因子。方法：收集９１例应用拉米夫定治疗的慢性ＨＢＶ感染者临床资料及系列血清。应用ｍｐＰＣＲＲＦＬＰ技术检测治疗过程中ＨＢＶ　ＤＮＡ复现患者的ＹＭＤＤ变异情况，并采用ＳＰＳＳ软件进行统计学分析。结果：检出ＹＭＤＤ变异３５例（３８．５％），其累计发生率在治疗１２和１８个月时分别为２０．４８％、５３．４６％。拉米夫定治疗前诊断为肝硬变者ＹＭＤＤ变异出现较早（Ｐ＝０．０２７９），在慢性肝炎中ＨＢｅＡｇ阳性者ＹＭＤＤ出现较早（Ｐ＝０．０２９６）。Ｃｏｘ比例风险模型显示：肝硬变（Ｐ＝０．００９２）和ＨＢｅＡｇ阳性（Ｐ＝０．０７７８）与ＹＭＤＤ变异有关。结论：慢性肝炎中ＨＢｅＡｇ阳性和肝炎肝硬变可作为拉米夫定治疗过程中ＹＭＤＤ变异的早期预测因子。