PLGA纳米可降解尿道支架的制备及力学性能

目的：探讨电纺丝法制备聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)(摩尔比80∶20)可降解尿道支架的可行性,并评价支架管的力学性能。方法：PLGA（80∶20）用三氯甲烷溶解并配成3%、4%、5%和6%的溶液,采用电纺丝技术制备纳米尿道支架,采用扫描电镜观察各种浓度PLGA制备的纳米尿道支架的微观结构,比较各种浓度PLGA支架的纤维直径、孔径、孔隙率及力学性能的差异。结果：浓度为3%、4%和5%的PLGA尿道支架制备成功,浓度为6%的PLGA因浓度过高制管失败。支架呈白色,长度4 cm,内径约 3.0 mm,外径约4.0 mm。电镜扫描见3种浓度的PLGA支架纤维平均直径随浓度的增高而增粗,组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。3种浓度PLGA支架的平均孔径分别为（7±4）、(13±7)和(32±13)μm,各组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。3%PLGA支架的孔隙率接近79%,4%PLGA支架的孔隙率约为85%,而5%PLGA支架的孔隙率约为90%,各组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。3种浓度PLGA支架的平均断裂强度分别为（2.37±0.15）、（1.97±0.07）和（1.85±0.11）MPa,3%PLGA支架的断裂强度显著高于浓度4%及5%PLGA支架（P<0.05）,而4%与5% 2种浓度PLGA支架的平均断裂强度比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论：5%PLGA尿道支架在孔径、孔隙率等方面可较好满足尿道组织工程支架对空间结构的要求,虽力学性能较3%PLGA支架略差,但可完全满足支架对力学性能的要求。     

牙周膜成纤维细胞与静电纺丝纳米纤维的生物相容性研究

目的 研究不同比例的静电纺丝聚乳酸/聚己内酯(PLA/PCL)纳米纤维与牙周膜成纤维细胞(PDLF)的生物相容性,探索其作为牙周膜组织工程支架的可行性.方法 聚乳酸(PLA)和聚己内酯(PCL)分别按重量比75:25、50:50和25:75制成混合溶液,应用静电纺丝技术制成3种比例的纳米纤维支架.将PDLF接种于3种比例的支架上,经细胞培养,通过光学显微镜观察PDLF在3种支架上的形态;MTT法检测PDLF在支架上的增殖,荧光显微镜下计数细胞,检测粘附能力;活死细胞染色法比较PDLF在3种比例支架上的活力.结果 在体外培养条件下,PDLF在3种比例支架上均能生长,其中50:50支架上的PDLF增殖曲线最接近常规培养细胞的曲线,明显较其他2种支架上PDLF数量多;50:50支架对PDLF的粘附作用明显强于另外2种;50:50支架对PDLF活性的影响最小,优于其他比例的支架.结论 PDLF能在不同比例的PLA/PCL纳米纤维上生长,其中,按重量比为50:50合成的支架在与牙周膜成纤维细胞共培养时体现出较好的生物相容性,可作为牙周膜组织工程候选支架材料.     

电纺丝法PLGA 可降解输尿管支架的制备及体外降解研究

 目的探讨电纺丝法制备聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）可降解输尿管支架管的可行性,并评价支架管的体外降解性能。方法不同比例PLGA 合成后,采用电纺丝技术得到纳米输尿管支架管,使用扫描电镜观察支架管表征。将输尿管支架管截成长约2 cm 小段,并浸于尿液中进行体外降解试验研究,分别于各观察点取出样品,观察大体形态、残重率及分子量变化。结果支架管具有纳米结构,其物理性质及电镜下结构完全满足可降解支架管的需求。PLGA 材料的降解的残重率曲线近乎成线性,其中50：50比例的PLGA 降解最快,约至第6周材料崩解,而70：30 比例的PLGA 降解最慢,在10 周左右崩解,80：20 降解速率介于二者之间,降解时间约需8 周。材料的体外降解过程中分子量变化趋势与重量损失大体相同,降解早期分子量下降迅速,后期减慢并趋于平稳。结论电纺丝技术得到的输尿管支架管管物理特性完全满足可降解输尿管支架管的要求。PLGA（80：20）及PLGA（50：50）两种材料满足了输尿管支架管对降解时间的要求,是制备支架管较为理想的材料。     

聚乳酸乙醇酸共聚物与纳米羟基磷灰石共混制备组织工程纤维环支架的实验研究

目的探讨以聚乳酸乙醇酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)与纳米羟基磷灰石(hydroxyapa-tite,HA)为原料,利用静电纺丝的技术制备出的三维多孔支架构建组织工程纤维环的可行性。方法将PLGA与HA溶解于丙酮中,配制20%(w/v)的溶液,磁力搅拌均匀后,进行静电纺丝,制备三维多孔支架。支架通过扫描电镜和磷酸盐缓冲液降解(phosphate buffered saline,PBS)的方式,观察支架的形貌和降解性能;利用CCK-8和伊红染色的方法观察支架的生物相容性。结果支架具有良好的纤维形貌,直径均匀,扫描电镜下可见HA结晶。支架在磷酸盐缓冲液中降解速度较快,8周时支架失重可达40%,表现出良好的降解性能。细胞毒性试验和伊红染色均表明细胞在支架上的生长情况较好,支架具有良好的生物相容性。结论 PLGA与HA共混制备的纳米纤维支架具有良好的空间结构和生物相容性,因此该支架是一种良好的组织工程纤维环支架材料。     

三种形貌静电纺丝膜片的制备及其与牙周膜细胞的相容性

目的探讨三种形貌静电纺丝膜片的制备方法,并比较其对牙周膜细胞（periodontal ligament cells,PDLCs）的细胞相容性。方法通过控制纺丝溶液成分、空气湿度、流速,制成3种静电纺丝膜片,利用扫描电镜观察其形貌;将PDLCs与三种膜片共培养,DAPI染色观察PDLCs的形貌、分布;MTT法检测PDCFs的增殖;活-死细胞染色法比较PDLCs的活力。结果研究显示,制得纤维状,液滴状,圆盘状三种形貌的膜片;在共培养第7、11天,PDLCs在圆盘状膜片上的细胞增殖和活性明显优于另两种膜片（P〈0.01）。结论通过调控静电纺丝的溶液成分、空气湿度、温度及流速,可以改变纺丝膜片的微观结构和形貌,从而影响材料的细胞相容性。圆盘状膜片具有更好的细胞相容性。     

载EPO腺病毒的PLGA纳米纤维支架在体内促进骨缺损修复作用

目的: 将促红细胞生成素(EPO)腺病毒局限在应用部位,观察其在体内的促进骨形成作用。方法: 采用冷冻干燥法,将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)腺病毒与聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米纤维支架复合作为实验组(PLGA/Ad-EGFP组),以等剂量的EGFP腺病毒为对照组,分别感染骨髓基质细胞(BMSCs),以BMSCs感染EGFP的荧光细胞面积比例检测病毒活力。采用Picogreen dsDNA定量检测试剂盒检测病毒释放动力学。将EPO腺病毒与PLGA纳米纤维支架冻干复合作为实验组(PLGA/Ad-EPO组),以单纯骨缺损为对照组,植入大鼠颅骨缺损处,在第4和8周采用Micro CT及组织学HE染色检测EPO腺病毒的新生骨面积百分比。结果: PLGA/Ad-EGFP组荧光细胞面积比例明显高于对照组(P<0.05);腺病毒在PLGA上呈突释曲线,第1小时存留53.0%±5.6%,第16小时存留20.0%±3.3%。与对照组比较,PLGA/Ad-EPO组在第4周促进红细胞生成,并在第4及8周大鼠颅骨缺损修复,新生骨面积百分比达到25.0%±5.7%及35.0%±6.3%(P<0.05)。结论: 应用冻干法将腺病毒与PLGA复合能够有效保存病毒活性, PLGA /Ad-EPO纳米纤维支架能够在一定程度上促进骨缺损修复。     

转染CDMP-2基因的成肌细胞与PLGA材料的相容性

目的探讨转染软骨源性形态发生蛋白2基因的成肌细胞与PLGA(聚乳酸/乙醇酸共聚物)材料的相容性。方法将转染CDMP-2基因的成肌细胞接种于PLGA支架,以成肌细胞与PLGA支架培养组为对照。采用MTT法检测成肌细胞在支架上的生长情况,并绘制生长曲线。结果与结论各组吸光度值差异无显著性意义(P>0.05)。转染CDMP-2基因的成肌细胞可以在PLGA材料上良好的生长,为后续研究成肌细胞修复软骨损伤打下了良好的基础。     

可降解组织工程血管支架材料的细胞相容性

目的对可降解材料聚乳酸-羟基乙酸共聚物和聚氨酯体外评价,初步探讨其作为血管支架材料的可行性。方法通过血红蛋白的释放对溶血进行评价;采用细胞增殖度法(MTT法)、细胞形态学观察方法研究聚乳酸-羟基乙酸共聚物和聚氨酯材料的细胞毒性。结果 PLGA和PU组的溶血率均小于ISO规定的5%,可认为这两种材料无溶血作用。MTT比色法结果显示细胞毒性为0～1级;细胞形态学观察显示L929细胞在聚氨酯材料浸提液中呈梭形或三角形,贴壁良好。结论这两种材料溶血低,细胞相容性良好,符合组织工程血管支架材料的应用要求。     

PLGA纳米材料在缺血性脑卒中中的应用

聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)具有良好生物相容性、生物可降解性、良好的成球或成膜性以及生物体内半衰期长等优势,已经广泛应用于肿瘤的临床治疗、诊断和其他医学生物领域;同时纳米医学技术在生物医药学、再生医学、诊断工具方面的发展也很迅速。目前缺血性脑卒中的治疗和早期诊断仍是一个难题,而PLGA纳米材料在缺血性脑卒中的诊疗中的应用已取得长足的进展。PLGA纳米材料在神经保护药物的载药、组织修复、影像诊断方面的应用是研究的热点。     

磁性聚乳酸-羟基乙酸氧化酚砷纳米微粒的制备及其特性

目的:研究磁性聚乳酸-羟基乙酸氧化酚砷纳米微粒(M-PLGA-PAO-NP)的制备工艺,并对纳米粒子进行评价.方法:运用超声乳化-溶剂挥发法制备磁性聚乳酸-羟基乙酸氧化酚砷纳米微粒,通过透射电镜(TEM)观察微粒形态,振动样品磁强计(VSM)确证纳米微粒磁性的存在,并对纳米微粒的平均粒径、载药量、包封率等进行评价.结果:纳米微粒外观呈规则球形,粒径在140～500 nm占总数的80%,载药量为3.2%,包封率为34.2%,药物磁性较好.结论:获得了较满意的磁性聚乳酸-羟基乙酸氧化酚砷纳米微粒制备工艺,其过程简单,粒子性状符合要求.     

全反式维甲酸对人牙周膜细胞向成骨分化的影响

目的检测全反式维甲酸(AT-RA)对人牙周膜细胞(hPDLCs)向成骨分化的影响。方法原代培养hPDLCs,用噻唑盐(MTT)方法检测AT-RA作用于细胞hPDLCs及对其增殖的影响,用酶动力方法检测对其碱性磷酸酶(ALP)活性的影响,用茜素红染色方法检测对其形成钙盐沉积的影响。结果 AT-RA不影响hPDLCs的增殖活性,但能增强hPDLCs的ALP活性,并明显促进钙盐沉积。结论 AT-RA可以促进hPDLCs向成骨分化。     

动态牵张应变对人牙周膜细胞的细胞骨架的影响

目的 研究动态牵张应变下人牙周膜细胞（HPDLCs）细胞骨架的变化。方法 体外培养HPDLCs,利用动态牵张应变细胞加载装置对HPDLCs分别加载1%、10%和20%的牵张应变,每种应变分别加载7个时间段（0.5、1、2、4、6、12、24 h）,应用激光共聚焦显微镜观察HPDLCs细胞骨架的形态结构;收集图像并运用Image-Pro Plus 4.5.0.29软件进行分析,测定HPDLCs的面积、长度与宽度比（长宽比）以及细胞骨架蛋白F-actin的积分荧光强度。结果 激光共聚焦显微镜观察发现：随着加载牵张应变的作用时间延长和应变值提高,HPDLCs细胞逐渐呈现栅栏状相互平行排列趋势,且排列方向垂直于牵张力方向,胞体被拉长。图像分析结果显示：加载动态牵张应变后,HPDLCs的细胞面积、长宽比及F-actin的表达量均发生相应的变化。结论 动态牵张应变可引起HPDLCs细胞骨架的变化,并且与施加应变的大小和应变作用时间有关。     

EGF对人牙周膜细胞增生与ALP活性表达的影响

探讨表皮生长因子 (EGF)对人牙周膜细胞的增生与碱性磷酸酶 (ALP)活性表达的影响 ,为EGF应用于牙周组织的再生与修复提供实验依据。采用MTT和ALP活性检测法 ,观察不同质量浓度 ( 0 .1～ 1 0 μg/L)EGF第 2 4、4 8和 72h对体外培养的第 3代人牙周膜细胞 (PDLCs)的作用。与对照组比较 ,在 2 4～ 72h ,0 .1～ 5 μg/L的EGF可显著抑制PDLCs的增生 (P <0 .0 1～ 0 .0 5 ) ;1 0 μg/LEGF培养 4 8h对PDLCs有促进增生的作用 (P <0 .0 5 ) ,培养 72h有稳定增生的作用 (P >0 .0 5 )。 0 .1、0 .5 μg/LEGF可显著抑制PDLCs的ALP活性 (P <0 .0 1～ 0 .0 5 ) ;1～ 1 0 μg/LEGF在 2 4h可显著增强PDLCs的ALP活性 (P <0 .0 1～ 0 .0 5 ) ,在培养 4 8和 72h有稳定ALP活性的作用 (P >0 .0 5 )。提示在一定的作用时间内 ,1 0 μg/LEGF对人PDLCs的生长和分化可同时具有促进作用。     

黄岑苷对H2O2诱导人牙周膜细胞损伤后作用的研究

目的:探索黄岑苷对H₂O₂诱导人牙周膜细胞氧化损伤后的保护作用。方法:原代培养人牙周膜细胞（humanperiodontalligamentcells,hPDLCs）并鉴定。CCK-8法检测细胞增殖及活性,选择适合的H₂O₂浓度,建立人牙周膜细胞氧化损伤模型。采用Hoechst33342荧光染色法观察损伤后细胞核形态,同时应用流式细胞术检测各组人牙周膜细胞对H₂O₂诱导的细胞毒性反应变化。此外采用分光光度法检测各组细胞及其上清液的LDH、MDA含量,从而阐明黄岑苷对人牙周膜细胞氧化损伤后的保护作用。结果:CCK-8法显示在H₂O₂浓度为200μmol/L时,其光密度（opticaldensity,OD）值与其他浓度组有差异（F=24.113,P=0.001）;荧光染色法观察到细胞凋亡典型形态;流式细胞术显示1¹0μg/mL的黄岑苷对H₂O₂处理引起的人牙周膜细胞损伤有保护作用;检测LDH、MDA含量和漏出率提示1μg/mL黄岑苷能减少H₂O₂损伤后细胞的氧化损伤产物及炎症产物。结论:适宜浓度的H₂O₂可导致人牙周膜细胞凋亡率增高,同时细胞内的LDH、MDA漏出率上升,造成氧化损伤,适当浓度的黄岑苷可以保护人牙周膜细胞经H₂O₂的氧化损伤。     

降钙素促进人牙周膜干细胞的胶原合成和成骨作用

目的 考察降钙素（CT）促进人牙周膜干细胞（hPDLSC）的胶原合成和成骨作用。方法 将50名成人受试者分为慢性牙周炎（CP）组（n=25）和对照组（n=25）。CP组中,选择探诊深度≥5 mm的上颌前部和有骨丢失影像学证据的部位,从每例患者的6个上颌位点收集龈沟液（GCF）样本。对照组中,对没有炎症的多个部位（每名受试者10～12个）进行取样以确保收集足够量的GCF。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测GCF中CT、转化生长因子β1（TGF-β1）和骨形态发生蛋白（BMP）2/4/7的表达,通过Spearman相关分析考察CT表达与临床参数牙周袋探诊深度（PD）、临床附着丧失（CAL）和牙龈指数（GI）及上述指标的相关性。用携带CT基因的重组腺病毒（Ad.CT）感染hPDLSC,并通过实时定量PCR和蛋白质印迹法分别检测TGF-β1、BMP2/4/7、碱性磷酸酶（ALP）、骨钙蛋白（OCN）和Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白（ColⅠ/Ⅲ）的mRNA和蛋白质表达。结果 CP组患者GCF中CT表达水平高于对照组[（32.62±1.46）ng/mL vs（17.70±0.76）ng/mL,P<0.01）]。CP组患者CT表达与临床参数PD、CAL、GI呈负相关（P<0.01、P<0.05）。CP组患者GCF中BMP2/4/7和TGF-β1的表达水平均高于对照组[BMP2：（138.67±4.04）ng/mL vs（103.96±2.78）ng/mL;BMP4：（155.53±3.55）ng/mL vs（133.15±2.92）ng/mL;BMP7：（106.59±2.85）ng/mL vs（90.22±1.56）ng/mL;TGF-β1：（105.92±3.40）ng/mL vs（89.85±2.42）ng/mL;P均<0.01],且CP患者上述指标均与CT表达呈正相关（P<0.01、P<0.05）。腺病毒感染的CT过表达使hPDLSC中TGF-β1、ColⅠ/Ⅲ及成骨细胞标志物BMP2/4、ALP和OCN表达增加（P均<0.01）。与Ad.CT和空载腺病毒共同感染的细胞相比,用Ad.CT和特异性阻断TGF-β1小干扰RNA（siRNA）的重组腺病毒（Ad.TGF-β1 siRNA）共同感染的细胞胶原蛋白表达水平更低（ColⅠ：0.16±0.02 vs 0.22±0.03;ColⅢ：0.11±0.01 vs 0.15±0.02;P均<0.01）。与Ad.CT感染的细胞相比,Ad.CT和头蛋白共处理细胞中ALP和OCN的蛋白质表达水平更低（ALP：0.19±0.02 vs 0.25±0.03;OCN：0.13±0.01 vs 0.19±0.02;P均<0.01）。结论 CT通过TGF-β1和BMP信号转导途径促进hPDLSC的胶原合成和成骨作用。     

人重组骨形成蛋白-7对人牙周膜成纤维细胞增殖及分化能力的影响

目的:研究人重组骨形成蛋白-7（ rhBMP-7）对体外培养的人牙周膜成纤维细胞(HPDLCs)增殖、分化能力的影响,为进一步探讨其促进牙周组织再生奠定细胞学基础。方法：选取因阻生或正畸需要拔除的牙齿,无菌条件下刮取根中1/3的牙周膜组织,采用组织块法培养牙周膜成纤维细胞,经免疫细胞化学鉴定后接种培养板,加入含浓度为50、100、200及400 μ mol·L^-1 rhBMP-7的培养液。分别于培养后1、3及5 d,采用MTT法测定HPDLCs的增殖能力,采用ELISA检测HPDLCs培养液中ALP的活性。结果:原代牙周膜细胞生长缓慢,加入rhBMP-7后细胞生长旺盛,细胞形态为纺锤形或成纤维样,胞浆透明,生长状态良好。随着时间的延长,rhBMP-7在100、200及400 μ mol·L^-1 各浓度时,HPDLCs细胞的增殖率呈逐渐增加的趋势(P<0.01),但各浓度组间比较差异无显著性(P>0.05);
与对照组比较,100、 200及400 μ mol·L^-1 rhBMP-7 各浓度组HPDLCs细胞裂解液和培养液中的ALP活性均增高(P<0.05或P<0.01),其中200 μ mol·L^-1 rhBMP-7 组ALP活性最高。结论: BMP-7可能通过促进HPDLCs细胞的增殖和向骨细胞分化功能而参与牙周组织改建。     

黄芩素对人牙周膜细胞骨向分化能力的影响

目的： 探讨中药黄芩提取物黄芩素对人牙周膜细胞（hPDLCs）增殖和成骨分化功能的影响。 方法：原代培养hPDLCs,向hPDLCs中分别加入浓度为0.3125、0.625、1.25 μmol/L的黄芩素作为实验组,对照组不加黄芩素。MTT法检测黄芩素对hPDLCs增殖的影响后,分别采用碱性磷酸酶（ALP）活性测定、茜素红S 染色、Real-time PCR和Western Blot法研究黄芩素对hPDLCs ALP活性、矿化结节形成、I型胶原（Col-I）mRNA和蛋白表达的影响。 结果： 与对照组相比,各浓度黄芩素对hPDLCs增殖均无明显影响;各浓度黄芩素组均表现为ALP活性上升;同时骨向诱导21 d后可见黄芩素组矿化结节形成增加,定量分析结果显示1.25 μmol/L黄芩素组形成矿化结节数量最多;Real-time PCR和Western Blot结果显示各浓度黄芩素组Col-ImRNA和蛋白表达均有上升,7 d时随浓度的增加其表达上升,1.25 μmol/L黄芩素组达到最高水平。     

神经生长因子对人牙周膜细胞增殖与分化作用的研究

目的 研究神经生长因子对体外培养的人牙周膜细胞增殖和分化作用的影响.方法 采用四唑盐比色法(MTT)和碱性磷酸酶(ALP)活性检测法,测定不同浓度(0.1 U/ml、1 U/ml、10 U/ml、100 U/ml)的神经生长因子对体外培养的第5-6代人牙周膜细胞增殖及碱性磷酸酶活性的作用.结果 与对照组(2?S的DMEM培养液)相比,1,10,100 U/ml的神经生长因子都可促进人牙周膜细胞的增殖,但10 U/ml作用最显著;100 U/ml的神经生长因子可显著促进碱性磷酸酶的活性(P＜0.01).结论 不同浓度的神经生长因子可显著促进人牙周膜细胞的增殖与分化.     

Smoothened慢病毒干扰载体的构建及其对人牙周膜干细胞增殖与分化的影响

目的 体外构建及筛选人Smoothened(SMO)基因的慢病毒干扰载体,使用此载体下调人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem ceils,PDLSCs)中SMO基因表达并检测其对细胞增殖与分化的影响.方法 针对人SMO 基因设计3条干扰序列,构建RNA干扰慢病毒载体,在293FT细胞中包装病毒液并转染293A细胞,通过实时荧光定量PCR检测干扰效率,得到具有最佳干扰效率的病毒后,转染PDLSCs,用Western blot检测其对PDLSCs中SMO基因的干扰效果及对细胞分化的影响,CCK-8法检测其对PDLSCs增殖的影响.结果 成功构建3个SMO慢病毒干扰载体(pGP-SMO1、pGP-SMO2、pGP-SMO3),通过转染293A细胞并进行实时荧光定量PCR检测后,得到pGP-SMO1具有最佳干扰效率,转染后SMO mRNA水平下降到对照的(28.5±2.5)％.利用此病毒能够很好地转染体外培养的PDLSCs,并使PDLSCs中SMO蛋白水平下降80％.进一步检测细胞增殖发现,与未转染组比较,SMO下调后PDLSCs增殖变慢[(1.09±0.20) vs (1.86±0.21),P＜0.01].同时也导致成骨分化标志物Runx2的蛋白表达下调.结论 利用慢病毒介导的干扰病毒载体成功干扰了PDLSCs SMO基因的表达,SMO基因的下调会导致PDLSCs增殖减慢,成骨分化能力减弱.