缺氧诱导因子1α过表达对前列腺癌细胞血管生成能力的影响

目的：观察转染缺氧诱导因子1α（HIF-1α）对人前列腺癌细胞血管形成相关蛋白的影响,并探讨其分子机制。方法：用脂质体Lipofectamine2000包装重组真核表达载体pCDNA3.1（-）/HIF-1α后转染人前列腺癌细胞LNCaP,600μg/ml G418筛选稳定表达的抗性克隆。免疫荧光及Western印迹法鉴定HIF-1α过表达,Western印迹法检测血管形成相关蛋白血管内皮生长因子（VEGF）、iNOS、促血管生成素2（Ang-2）。结果：与未转染细胞LN-CaP相比,转染细胞LNCaP/HIF-1α中出现明显的HIF-1α蛋白条带,并激发出较强荧光,VEGF、iNOS表达增加,Ang-2未见明显变化。结论：HIF-1α过表达能够诱导LNCaP细胞血管形成相关蛋白表达增多,进而增强其体外血管形成能力。     

过表达缺氧诱导因子1α影响前列腺癌血管生成的体内研究

目的:观察转染缺氧诱导因子1α(HIF-1α)在体内环境下对人前列腺癌血管形成的影响,并探讨其分子机制。方法:对构建的转染HIF-1α人前列腺癌LNCaP细胞(LNCaP/HIF-1α)复苏后培养,ELISA法检测转染前后培养液上清PSA水平;流式细胞术检测细胞周期;将转染前后的LNCaP细胞建立免疫裸鼠皮下肿瘤模型,观察肿瘤生长情况;收集肿瘤标本后针对肿瘤血管生成相关蛋白血管内皮生长因子(VEGF),诱导型一氧化氮合酶(iN-OS),促血管生成素2(Ang-2)行免疫组化染色。结果:与LNCaP细胞相比,转染HIF-1α的人前列腺癌LNCaP细胞培养液PSA水平明显降低(t=8.243,P<0.05);流式细胞术显示其更具有增殖活性。体内实验显示皮下肿瘤成瘤率提高,成瘤时间提前。LNCaP/HIF-1α免疫组化研究显示VEGF、iNOS、Ang-2表达较LNCaP组增强。结论:在体内环境下,HIF-1α过表达能够诱导人前列腺癌LNCaP细胞血管形成相关蛋白VEGF、iNOS表达上调,提高肿瘤血管形成能力。并通过诱导肿瘤血管形成来增强肿瘤的侵袭转移能力;体内外实验显示HIF-1α可能对人前列腺癌LNCaP细胞Ang-2表达不产生影响,而在体内环境下Ang-2表达受其他因素调控。     

缺氧诱导因子1α诱导人前列腺癌细胞上皮间质化改变的研究

目的:研究人前列腺癌细胞在缺氧诱导因子1α(HIF-1α)诱导下能否发生上皮细胞间质转化态(EMT)改变,进而致侵袭能力增强,并初步分析其分子机制。方法:应用RT-PCR技术检测LNCaP细胞及其亚细胞系C4、C4-2、C4-2B这4种EMT阴性的人前列腺癌细胞中波形蛋白(vimentin)mRNA表达情况,并凭此筛选出适合于进一步作转染诱导试验的细胞。用脂质体Lipofectamine2000包装重组真核表达载体pCDNA3.1(-)/HIF-1α和pCD-NA3.1(-)空质粒后,分别转染上步试验所挑选出的人前列腺癌细胞LNCaP,600μg/mLG418筛选抗性克隆。免疫荧光及Western印迹法鉴定HIF-1α表达,Western印迹法检测EMT标志蛋白——上皮型钙粘素(E-cadherin)和vimentin的表达,Transwell验证转染后LNCaP细胞侵袭能力的改变。结果:RT-PCR证实4种EMT阴性的细胞中,仅LNCaP表达有vimentin编码基因,适合作转染诱导试验。免疫荧光也观察到HIF-1α转染细胞胞质中荧光亮度较空质粒转染细胞和未转染细胞明显增强。Western印迹法证实HIF-1α转染细胞发生了EMT转化,其E-cad-herin表达缺失,而vimentin表达增加。同时,Transwell体外侵袭试验也发现,LNCaP/HIF1α细胞的体外侵袭能力显著高于LNCaP细胞和LNCaP/pCDNA3.1(-)细胞。结论:HIF-1α过表达可以通过调节两种EMT相关蛋白诱导人前列腺癌细胞LNCaP发生EMT改变并致其侵袭能力增强。     

缺氧诱导因子1α诱导前列腺癌LNCaP细胞上皮间质转化的体内外研究

目的:探讨在体内外环境下缺氧诱导因子1α(HIF-1α)过表达对前列腺癌细胞发生上皮间质转化(EMT)并导致肿瘤侵袭能力升高的影响.方法:对已构建的稳定表达HIF-1α的人前列腺癌LNCaP细胞(LNCaP/HIF-1α)复苏后培养,对HIF-1α过表达进行鉴定.MTT法测定细胞增殖;检测转染前后培养液上清PSA水平;软琼脂成瘤实验比较两种细胞体外成瘤能力;将转染前后的LNCaP细胞注射免疫裸鼠皮下建立皮下肿瘤模型,观察肿瘤生长情况;收集肿瘤标本进一步行免疫组化处理.结果:免疫荧光和Western印迹证实LNCaP/HIF-1α细胞中HIF-1α过表达.同LNCaP细胞相比,转染HIF-1α的人前列腺癌LNCaP细胞培养液中PSA水平明显降低;MTT法显示其更具有增殖活性,体外成瘤能力更强.体内实验显示皮下肿瘤成瘤率提高,成瘤时间提前.肿瘤标本免疫组化提示转染组E钙粘蛋白表达下调,波形蛋白表达上调.结论:HIF-1α过表达能够封闭E钙粘蛋白,上调波形蛋白表达,提示HIF-1α过表达可能通过诱导EMT增强LNCaP细胞侵袭能力.     

缺氧诱导因子1α诱导前列腺癌LNCaP细胞上皮间质转化的体内外研究

目的:探讨在体内外环境下缺氧诱导因子1α(HIF-1α)过表达对前列腺癌细胞发生上皮间质转化(EMT)并导致肿瘤侵袭能力升高的影响。方法:对已构建的稳定表达HIF-1α的人前列腺癌LNCaP细胞(LN-CaP/HIF-1α)复苏后培养,对HIF-1α过表达进行鉴定。MTT法测定细胞增殖;检测转染前后培养液上清PSA水平;软琼脂成瘤实验比较两种细胞体外成瘤能力;将转染前后的LNCaP细胞注射免疫裸鼠皮下建立皮下肿瘤模型,观察肿瘤生长情况;收集肿瘤标本进一步行免疫组化处理。结果:免疫荧光和Western印迹证实LNCaP/HIF-1α细胞中HIF-1α过表达。同LNCaP细胞相比,转染HIF-1α的人前列腺癌LNCaP细胞培养液中PSA水平明显降低;MTT法显示其更具有增殖活性,体外成瘤能力更强。体内实验显示皮下肿瘤成瘤率提高,成瘤时间提前。肿瘤标本免疫组化提示转染组E钙粘蛋白表达下调,波形蛋白表达上调。结论:HIF-1α过表达能够封闭E钙粘蛋白,上调波形蛋白表达,提示HIF-1α过表达可能通过诱导EMT增强LNCaP细胞侵袭能力。     

HIF-2α在肾透明细胞癌血管生成中的作用

目的探讨体外水平HIF-2α在肾透明细胞癌血管生成中的作用。方法采用RNAi方法,体外化学合成HIF-2α序列特异的siRNAs,转染肾透明细胞癌786-0细胞抑制HIF-2α表达,Western blotting、ELISA方法检测VEGF表达变化,应用BrdU抗体ELISA比色法研究HIF-2α抑制后肿瘤细胞血管生成能力改变。结果肾透明细胞癌786-0细胞不表达HIF-1a,仅表达HIF-2α,缺氧诱导HIF-2α蛋白表达增加。HIF-2α序列特异的siRNAs特异抑制HIF-2α蛋白的表达,转染效率>80%,抑制率(72.0±8.0)%;HIF-2α抑制后,缺氧诱导的细胞结合型VEGF表达减少,分泌型VEGF在正常氧压情况下抑制率(21.7±3.8)%,缺氧情况下抑制率(37.8±4.7)%,肿瘤细胞在体外水平的血管生成能力降低(42.7±5.0)%。结论HIF-2α在肾透明细胞癌中具有促进肿瘤血管生成的作用,抑制HIF-2α下调细胞结合型与分泌型VEGF表达而降低肾透明细胞癌在体外水平的血管生成能力。     

地高辛联合姜黄素对雄激素非依赖性前列腺癌细胞PC3生长的影响

目的 观察地高辛联合姜黄素对雄激素非依赖性前列腺癌细胞PC3生长作用的影响及可能机制.方法 地高辛、姜黄素及两药联合作用PC3细胞,MTT法测定细胞增殖,流式细胞术测定细胞凋亡,Western Blot法检测PC3细胞中抑制低氧诱导因子-1(hypoxia-induc-ible factor-1α,HIF-1α)、血管生成因子(VEGF)蛋白的表达水平.结果 与对照组相比,联合用药组显著抑制PC3细胞的增殖(P＜0.05);地高辛、姜黄素联合较单独用药可升高PC3细胞凋亡率(P＜0.05);蛋白印迹法检测提示地高辛组、姜黄素组、联合用药组中HIF-1α、VEGF表达明显下调,联合用药组效果更显著(P＜0.05).结论 地高辛联合姜黄素可显著抑制雄激素非依赖性前列腺癌细胞PC3的增长并诱导其凋亡,并可能与下调HIF-1α、VEGF表达有关.     

长链非编码RNA-MALAT1对结直肠癌细胞介导的血管形成的影响

目的观察长链非编码RNA-肺腺癌转移相关转录因子1(MALAT1)对结直肠癌细胞介导的血管形成的影响,并初步探索其中可能的机理。方法在结直肠癌细胞株SW48中通过转染质粒过表达MALAT1经常规培养或乏氧培养后,收集培养液上清利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测其中血管内皮生长因子(VEGF)的含量,并利用此培养液上清孵育脐静脉内皮细胞(HUVEC),检测其对HUVEC形成血管微管能力的影响;同时收集SW48细胞通过蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测其中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达。结果在SW48中过表达MALAT1后,常规培养条件下其培养液上清中的VEGF含量为(514±32)mg/L,较对照组的(110±14)mg/L明显增高(P0.05),乏氧培养条件下MALAT1组VEGF含量为(928±18)mg/L,较对照组的(230±21)mg/L也有明显增高(P0.05);利用上述培养液上清孵育HUVEC,过表达MALAT1可促进其体外的成管能力;同时Western blot法证实过表达MALAT1可促进HIF-1α蛋白的表达。结论过表达MALAT1可促进结直肠癌细胞介导的血管形成,其可能作为结直肠癌新的药物治疗靶点。     

短发夹状RNA抑制缺氧诱导因子1α在前列腺癌细胞中的表达

目的:构建产生缺氧诱导因子1α(HIF-1α)特异性短发夹状RNA(shRNA)的载体并检测其抑制作用,探讨该技术在前列腺癌治疗中的应用前景。方法:设计、合成针对HIF-1α的特异性shRNA模板序列,将其插入含有U6启动子的psilencerTM2.1-U6载体中,得到shRNA表达载体psilencer-HIF,在脂质体介导下转染前列腺癌细胞株PC-3M,应用绿色荧光蛋白质粒pEGFP共转染评价转染效率,RT-PCR及Western印迹检测其对HIF-1α表达的影响。结果:重组质粒psilencer-HIF经测序分析证实与设计的完全一致,共转染24 h后质粒转染效率为(89.26±4.72)%,其产生的shRNA在PC-3M细胞中能诱导RNA干扰(RNAi),转染后48 h HIF-1αmRNA和蛋白水平分别下降82.09%和81.61%(P<0.01);而阴性对照组HIF-1α表达水平无明显改变(P>0.05)。结论:成功构建了HIF-1α基因shRNA表达质粒,其可有效抑制前列腺癌细胞中的HIF-1α的表达,为前列腺癌的基因治疗提供了新思路。     

缺氧诱导因子1α在肝癌细胞上皮-间充质化中的作用

目的:探讨缺氧诱导因子1 α(HIF-1 α)在肝癌上皮-间充质化(EMT)中的作用.方法:采用可调控HIF-1 α表达的肝癌HepG2Tet-on-HIF-1α细胞系,首先用real-time PCR与Western blot方法检测低氧环境中HepG2Tet-on-HIF-1α细胞EMT相关分子(E-cadherin,vimentin,FSP-1)及HIF-1 α的mRNA和蛋白表达水平,然后在常氧环境下,采用强力霉素(Dox)诱导HepG2Tet-on-HIF-1α细胞HIF-1 α过表达,以及HepG2Tet-on-HIF-1α细胞经Dox处理后再转染HIF-1αsiRNA,观察上述分子的表达情况.结果:低氧处理后,HepG2Tet-on-HIF-1α细胞EMT相关分子及HIF-1 α的mRNA和蛋白表达水平较常氧状态下均明显增加(均P＜0.05);常氧环境下,Dox能诱导HepG2Tet-on-HIF-1α细胞HIF-1 α过表达,同时明显增加EMT相关分子的mRNA和蛋白表达水平(均P＜0.05),但转染HIF-1αsiRNA后,Dox的诱导作用被取消.结论:HIF-1α促进HepG2细胞EMT,并可能是肝癌基因治疗的有效靶点.     

地高辛对前列腺癌LNCaP和PC3细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨地高辛对雄激素依赖和去势抵抗性前列腺癌细胞增殖和凋亡的影响及可能的机制.方法 设立地高辛的浓度和时间梯度,分别作用于正常前列腺细胞株、雄激素依赖性及去势抵抗性前列腺癌细胞株LNCaP和PC3,流式细胞仪检测凋亡指数,MTT法检测细胞增殖速率;应用Western Blot技术检测HIF-1 α和VEGF的蛋白水平.结果 地高辛对LN-CaP和PC3细胞均有良好的抑制增殖及促进凋亡的作用(P＜0.05);Western Blot法检测提示地高辛干预组HIF-1α和VEGF的蛋白水平较未干预组明显降低(P＜0.05).结论 地高辛可抑制雄激素依赖及去势抵抗性前列腺癌细胞增殖并促进其凋亡,作用机制可能是通过抑制HIF-1 α/VEGF这一信号通路来发挥作用.     

Expression of hypoxia-inducible angiogenic proteins (hypoxia-inducible factor-1alpha, vascular endothelial growth factor, and E26 transformation-specific-1) and plaque hemorrhage in human carotid atherosclerosis

OBJECT: Plaque hemorrhage in carotid atherosclerosis promotes plaque progression, resulting in cerebrovascular disease. Hypoxia inducible factor-1alpha (HIF-1alpha) induces angiogenesis via the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and E26 transformation-specific-1 (Ets-1). The authors investigated human carotid plaques to determine whether these hypoxia-inducible angiogenic proteins play a major role in intraplaque angiogenesis and hemorrhage. METHODS: The expression of HIF-1alpha, VEGF, and Ets-1 was analyzed using immunohistochemistry and Western blotting in 29 human carotid plaques obtained at carotid endarterectomy. The authors investigated the relationship between plaque characteristics and clinical symptoms. RESULTS: A higher incidence of plaque hemorrhage was observed in plaques associated with symptoms than in those without symptoms (p = 0.03). Hypoxia-inducible factor-1alpha, VEGF, and Ets-1 coexisted in the deep layer of plaque, where angiogenesis was remarkably developed; the expression levels of HIF-1alpha, VEGF, and Ets-1 were significantly enhanced in the main lesion of the plaque (p < 0.01). Symptomatic plaques showed higher expression of VEGF (p = 0.04) than asymptomatic plaques. Plaques with hemorrhage showed a higher incidence of plaque ulcer (p = 0.001) and higher expression of Ets-1 (p = 0.03) than those without hemorrhage. Moreover, significantly increased expressions of VEGF (p = 0.01) and Ets-1 (p = 0.006) were observed in plaques with not only hemorrhages but also ulcers and severe stenosis. CONCLUSIONS: The findings in this study suggest that hypoxia-inducible angiogenic proteins in human carotid atherosclerosis promote intraplaque angiogenesis, which can induce plaque hemorrhage and progression.     

Altered expression of genes regulating angiogenesis in experimental androgen-independent prostate cancer

BACKGROUND: The aim of this study was to investigate how the expression of genes regulating angiogenesis is altered when prostate cancer cells progress into androgen-independency. METHODS: A gene array specific for angiogenesis was used to compare the human prostate cancer cell line LNCaP (androgen-dependent) with its more angiogenic and tumorigenic subline LNCaP-19 (androgen-independent). Results were verified with real-time RT-PCR, and further investigations were focused on the angiogenesis inhibitor a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 1 (ADAMTS1). Expression of ADAMTS1 was investigated in vitro as well as in subcutaneous tumors with real-time RT-PCR and Western blotting. Microvessel density (MVD), versican proteolysis and protein levels of TIMP-2 and TIMP-3, known as ADAMTS1 inhibitors, were also analyzed in tumor xenografts. RESULTS: The gene array revealed decreased expression of ADAMTS1, ephrin-A5, fibronectin 1, and neuropilin 1 in LNCaP-19 compared to LNCaP, while expression of midkine and VEGF were increased. Further studies showed that mRNA and protein levels of ADAMTS1 were significantly lower in LNCaP-19 compared to LNCaP, both in vitro and in subcutaneous tumors. The amount of ADAMTS1 correlated negatively with MVD, but no relation was found between ADAMTS1 and versican proteolysis. CONCLUSIONS: Expression of several genes associated with angiogenesis was altered during transition into androgen-independency. Among these, a significant decrease was found for ADAMTS1, whose expression inversely correlated with MVD. Its role in progression of prostate cancer needs further investigation, but this inhibitor of angiogenesis could be an interesting candidate for future anti-angiogenic therapy.     

HIF-1α、VEGF在胰腺癌组织中的表达及临床意义

目的研究胰腺腺癌组织中的低氧诱导因子-1α（hypoxia—inducible factor—1α,HIF-1α）和血管内皮生长因子vascular endothelial growth factor,VEGF）的表达情况及其临床意义。方法采用Westernblotting方法检测30例胰腺腺癌组织及其中9例胰腺癌相应癌旁胰腺组织中HIF—1α、VEGF的表达。结合临床病例资料,分析HIF—1α、VEGF与肿瘤的大小、部位、病理分化程度、淋巴结转移及胰腺癌TNM分期之间的关系。结果统计结果显示HIF-1α、VEGF在胰腺癌肿瘤组织中的表达高于癌旁组织,两者比较具有统计学意义（P〈0．01）,同时相关性分析显示肿瘤组织中HIF—1α与VEGF两者之间具有正相关性（r=0．655,P〈0．01）。结合临床资料分析,胰腺癌肿瘤组织中HIF—1α、VEGF的表达与肿瘤大小、淋巴结转移和胰腺癌TNM分期密切相关,并且具有统计学意义（P〈0．01）。结论胰腺癌组织中HIF—1α、VEGF存在高表达,HIF—1α、VEGF和肿瘤大小、淋巴结转移和胰腺癌TNM分期有关。HIF-1α、VEGF可能可作为判断胰腺癌预后的一个指标。