小剂量藜芦碱诱发大鼠脑海马CA1区锥体神经元异常放电癫痫脑片模型的特征

背景阵发性去极化漂移是癫痫活动的脑神经元的细胞学特征,过去认为其产生与突触传递异常有关.近年来,阵发性去极化漂移的内因机制得到进一步关注和重视.;目的观察小剂量藜芦碱诱发大鼠脑海马CA1区锥体神经元产生癫痫样活动的特征,探讨其可能的离子机制.设计探索性观察实验.单位解放军第四军医大学的神经科学研究所.材料实验于2002-10/2004-10在解放军第四军医大学神经科学研究所完成.选择出生后14 d的健康SD大鼠40只,所需试剂购自天津市医药公司和Sigma公司.干预大鼠经腹腔麻醉后取脑切片,通过0.5 μmol/L藜芦碱诱发癫痫样活动.在6张脑片上诱发产生阵发性去极化飘移样放电后,灌流液中加入80 nmol/L河豚毒素,在另外5张脑片上,用抗癫痫药物苯妥英(5μmol/L)替换河豚毒素,观察在不同药物作用下细胞电生理特性的变化.主要观察指标①细胞放电模式.②电压钳模式下通过细胞Ⅰ-Ⅴ反应计算河豚毒素敏感性持续性钠电流的大小.结果小剂量藜芦碱细胞外灌流后,随着神经元膜的超极化,大鼠CA1区锥体细胞表现出固定模式的阵发性去极化漂移串样放电,这种电活动可被小剂量(80 nmol/L)河豚毒素或(5 μmol/L)苯妥英所阻断.电压钳模式下测量阈下河豚毒素敏感性钠电流,在膜电位-55,-60,-65mV范围内,癫痫放电神经元测值明显增大,表明小剂量藜芦碱可增强持续性钠电流,并具有电压依赖性.结论小剂量藜芦碱可在大鼠脑海马CA1区锥体神经元上诱发出阵发性去极化漂移样癫痫活动.小剂量河豚毒素或苯妥英可阻断这种癫痫活动,其离子机制可能与持续性钠电流的增强有关.     

新生大鼠海马神经元的急性分离与膜片钳技术

目的：获得适用于膜片钳技术的单个海马神经元。 方法：实验于2005-09／11在新乡医学院机能学研究室完成。应用酶消化及机械分离法，急性分离出生3～6d的SD大鼠海马神经元，在倒置显微镜下，选取已贴壁直径约10～15μm的锥体形神经元观察其急性分离效果和细胞活性状态。电生理学的鉴定采用全细胞膜片钳的模式记录电流反应，首先在大鼠海马CA1区锥体神经元诱发出内向离子流。在大鼠海马CA1锥体神经元诱发出内向离子流后，通过程控灌流系统在细胞外液中加1μmol／L的钠通道阻断剂河豚毒素灌流同一神经元，记录内向离子流的变化。 结果：①该法可获得形态良好的单个海马神经元，海马锥体细胞具有锥形胞体（10～20μm）和厚墩的顶树突特征。活性较好的海马神经元，胞体呈三角形或椭圆形，表面光亮，细胞膜完整、清晰的，立体感较强。一般有1个较长的顶树突和2个以上较短的基树突。②利用膜片钳技术内向电流被诱发，用1μmol／L河豚毒素完全阻断该电流，说明该内向电流为钠电流。 结论：该法可获得形态和生理特性良好的单个海马神经元，证实该方法适用于海马神经元膜片钳研究，对深入探讨药物和毒物对海马离子通道及信号转导机制的作用有重要价值。     

氟哌利多对大鼠脑缺血海马CA1区锥体细胞持续钠通道电流的影响

背景：脑缺血后离子通道通透性的异常和神经细胞内外离子平衡的紊乱是缺血性脑损伤的重要因素，钠通道激活引起的去极化是脑缺血损伤的始动环节。 目的：采用膜片钳技术测定氟哌利多对脑缺血海马CA1区锥体细胞持续性钠通道电流的影响，分析氟哌利多是否对脑缺血损伤产生保护？ 设计：随机对照动物实验。 单位：上海交通大学附属第六人民医院麻醉科，上海交通大学附属第一人民医院麻醉科。 材料：实验于2002-04／2003-04在上海交通大学附属第一人民医院麻醉实验室完成。选择出生10-14d未断乳的SD大鼠14只，每只鼠各选择2个海马CA1区细胞，共28个细胞，随机分为4组：缺血对照组、氟哌利多3μmol／L组、氟哌利多10μmol／L组、氟哌利多30μmol／L组，7个／组。 方法：酶消化法急性分离全部大鼠脑海马CA1区锥体细胞，通过低氧和无糖法制备神经元缺血模型。选择贴壁良好、呈三角形或星形、胞体较亮，折光性良好、突起明显、胞浆均匀一致、核仁明显的细胞用于实验。采用“Y-tube”系统快速给药，氟哌利多3，10，30μmol／L组各自给予氟哌利多3，10，30μmol／L，缺血对照组不给药。全细胞膜片钳技术记录各组持续钠电流的基础值以及缺血3min和5min时钠通道电流的变化。 主要观察指标：①脑海马CA1区神经元正常持续钠电流的记录。②脑缺血时海马CA1区神经元持续性钠电流的记录。③不同浓度氟哌利多对脑缺血时持续性钠电流的影响。 结果：实验选用14只大鼠脑海马CA1区的28个细胞，全部进入结果分析。①脑海马CA1区神经元正常持续钠电流的记录：使用钙通道阻滞剂CdCl20．5mmol／L及钾通道阻滞剂TEA20mmol／L，在钳制电压-105mV、刺激电压-30mV下给予长为400ms的方波刺激，可记录到一个较小的、激活较晚且持续时间较长的内向电流，经河豚毒素阻断证实为持续性钠电流。②脑缺血时海马CA1区神经元持续性钠电流的记录：缺血对照组缺血3min时持续钠电流增加为正常情况的（1．60&;#177;0．21）倍，缺血5min时持续钠电流增加为正常情况的（2．87&;#177;0．45）倍，差异显著（P〈0．05）。③不同浓度氟哌利多对脑缺血时持续性钠电流的影响：缺血对照组、氟哌利多3，10，30μmol／L组持续钠电流的基础值分别是（77．42&;#177;15．17）pA，（87．44&;#177;21．56）pA，（84．13&;#177;20．06）pA，（80．22&;#177;19.30）pA，组间比较差异无显著性意义。缺血5min后氟哌利多3，10，30μmol／L组持续性钠电流分别为（105．36&;#177;17．16）pA，（94．74&;#177;18．88）pA，（84．88&;#177;13．94）pA，明显低于缺血对照组（21831&;#177;9．34）pA。 结论：在钳制电压-105mV、刺激电压-30mV条件下，脑缺血损伤时持续性钠电流增加，氟哌利多可能通过抑制持续性钠电流的增强而发挥神经元保护作用。。     

大鼠脑海马CA1区神经元诱发放电过程中催产素与阿片受体的参与和调制作用

背景：中枢内催产素可作为一种神经递质或调质参与学习记忆、性行为、痛觉调节以及阿片耐受与依赖，海马内催产素能系统与阿片系统具有一定的相互作用。 目的：探讨侧脑室注射催产素对大鼠脑左背侧海马CA1区神经元诱发放电的影响以及催产素与阿片受体之间可能的相互作用。 设计：随机对照实验。 单位：广东医学院生理教研室，武汉大学医学院生理系，武汉大学医学院病理学教研究。 材料：实验于2002-09／2003-09在武汉大学医学院生理系完成，选用雄性SD大鼠36只。随机分为6组，生理盐水对照组、催产素处理组（0．2，2，20mg／L）、催产素受体拮抗剂＋催产素（2mg／L）组、纳洛酮＋催产素（2mg／L）组，每组6只。 方法：脑海马CA1区细胞外记录采用玻璃微电极记录：用微电极推进器将电极插入脑海马CA1区。神经元放电经微电极放大器放大后，显示在示波器上进行观察。记录到神经元放电后，经双极不锈钢电极每隔5min刺激坐骨神经1次，共刺激50min 10次。催产素O．2，2，20mg／L处理组通过侧脑室给药管匀速而缓慢注入催产素O．2，2，20mg／L5μL。催产素受体拮抗剂＋催产素（2mg／L）组：侧脑室预先注射80mg／L催产素受体拮抗剂2．5μL，然后再注射2mg／L催产素2．5μL。纳洛酮＋催产素（2mg／L）组：侧脑室预先注射400mg／L纳洛酮2．5μL，然后再注射2mg／L催产素2．5μL。以放电频率变化率为观察指标，检测不同剂量催产素对海马CA1区神经元诱发放电的影响及催产素受体拮抗剂、纳洛酮对催产素的作用。主要观察指标：各组大鼠刺激前后脑海马CA1区神经元诱发放电频率的变化率。 结果：36只大鼠均进入结果分析。①侧脑室分别注射0．2，2，20mg／L催产素5μL使海马CA1神经元诱发放电频率明显降低，剂量依赖关系明显。②催产素（2mg／L）对CA1神经元诱发放电的抑制作用可被侧脑室预先注射催产素受体拮抗剂（80mg／L，2．5μL）所阻断。③侧脑室注射纳洛酮（400mg／L，2．5μL）可明显减弱催产素（2mg／L）的作用。 结论：催产素通过激活催产素受体可抑制海马CA1神经元对外周传入电信号的反应，中枢内阿片系统也参与催产素的抑制作用，当用纳洛酮阻断阿片受体后，催产素的抑制作用明显减弱。     

红藻氨酸诱导大鼠癫痫发作时海马神经元凋亡变化的动态观察

目的：探讨大鼠癫痫发作时海马神经元凋亡变化。方法：采用红藻酸氨(KA)诱导大鼠癫痫发作模型，观察行为学及脑电图变化；用神经元尼氏体亚甲蓝特殊染色法观察大鼠癫痫发作时海马CA1区神经元损害情况；用原位细胞凋亡检测法观察癫痫发作时海马CA1区神经元凋亡情况及苯巴比妥干预后神经元凋亡的变化。结果：KA注射后大鼠出现严重边缘性惊厥，脑电图表现为持续性癫痫样放电。海马细胞在KA注射后8h开始出现凋亡阳性细胞，48h达高峰，主要表现在CA1区锥体细胞，经苯巴比妥干预后凋亡细胞明显减少。结论：癫痫发作后的迟发性神经元死亡很可能经由凋亡途径，早期终止癫痫发作可抑制海马神经元凋亡。     

体外培养大鼠海马神经元癫痫模型中神经元凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3基因的表达

背景：颞叶癫痫的发病与海马神经元丢失死亡有关，但其海马神经元丢失的具体方式和详尽机制还不清楚，难以确定海马神经元癫痫样放电与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteine-containing ASPartate—specific protease，Caspase-3）激活及神经元凋亡的必然联系。 目的：观察体外培养大鼠海马神经元癫痫模型中神经元凋亡及Caspase-3基因的表达情况。 设计：开放性实验。 单位：解放军第二军医大学长海医院神经外科，解放军第二军医大学长征医院神经外科。 材料：实验于2002-06／2003—06在解放军第二军医大学神经外科实验室完成。选取出生24h内的SD大鼠10只，雌雄不拘。Caspase-3流式检测试剂盒购自美国BD公司，PCR引物由上海皓嘉公司合成。 方法：①将24h内新生SD大鼠断头取脑，解剖出双侧海马，制备海马神经元癫痫样放电细胞模型。通过全细胞膜片钳对细胞模型放电情况进行检测。以培养8d并经无镁处理的神经元细胞作为癫痫样放电模型组，以培养8d但未经无镁处理的神经元细胞作为空白对照组，记录电位变化。②采用反转录-聚合酶链法克隆大鼠全长caspase-3 cDNA．并加以标记；采用原位杂交和流式细胞术检测caspase-3基因表达和神经元凋亡情况。 主要观察指标：①Caspase-3基因cDNA的克隆结果。②Caspase-3原位杂交检测结果。③细胞凋亡检测结果。 结果：①反转录-聚合酶链反应扩增的产物经12g/L琼脂糖凝胶电泳显示约800bp DNA片段区带，与预期值一致。DNA序列测定显示所得克隆的开放阅读框架长843bp。②杂交显示空白对照组海马阳性染色神经元少于10％，神经元突起饱满，形成广泛的突触联系。癫痫样放电模型组无镁处理3h后，染色阳性细胞明显增多；无镁处理12h后，有较多强阳性染色神经元，基本保持有神经元突起，但突起变得菲薄。③流式细胞分析显示。无镁处理6h后凋亡细胞开始明显增加，单位时间内凋亡细胞数不尽一致。 结论：癫痫样放电可以启动caspase-3表达，继而介导神经元凋亡。     

大鼠边缘叶癫痫发作前后局部脑血流变化与脑海马CA3区半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达及神经元凋亡

目的：观察大鼠边缘叶癫痫发作前后局部脑血流变化，验证半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3在癫痫大鼠脑海马CA3区神经元中表达与其神经元凋亡的关系。方法：实验于2002-05／2003-10在教育部重点实验室复日．大学华山医院神经病学研究所完成。选取清洁级SD雄性大鼠60只，随机分为5组：分组情况：①正常对照组6只，杏仁核内注射0.5μL磷酸缓冲液，其余4组均完成造模过程，杏仁核内注射红藻氨酸0．5μg溶于0．5μL的磷酸缓冲液中，pH值调至7．4。②单纯癫痫组36只，根据处死大鼠的时问点分为0，2，4，8，24，72h6组，6只／组，癫痫发作1h后经股静脉注射安定终止发作。③实验给药组6只，脑室内注射半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂z-DEVD-fmk。④实验对照组6只，脑室内注射磷酸缓冲液：⑤空白对照组6只，脑室和杏仁核内均注射磷酸缓冲液结果判定：①观察癫痫发作后双侧脑灌注率的变化，以癫痫发作前10mln的脑血流为基线，计算发作后占相应基线的百分率。②观察半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂对癫痫发作同侧脑海马CA3区TUNEL阳性细胞(凋亡细胞)和存活神经元的影响。③观察癫痫发作同侧脑海马CA3区半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3细胞凋亡线粒体通路效应酶脑内的表达。结果：共60只大鼠进入结果分析。①单纯癫痫4h组癫痫发作前后局部脑血流无明显变化，双侧脑灌注率波动范围在10％以内。②脑室内注射半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂可减少TUNEL阳性细胞，增加存活的神经元。③正常对照组半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3在脑神经元内构成性表达主要分布于神经元细胞核周围；单纯癫痫组癫痫发作终止24h时同侧脑海马CA3区半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3弥散于部分神经元的整个细胞，即免疫反应性增强。结论：①癫痫大鼠发作时脑灌注率波动较小，局部腩血流无明显变化，说明其神经元凋亡与脑缺血无关。②给予半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂可明显减少大鼠癫痫侧脑海马CA3区神经元的凋亡，增加存活的神经元。提示半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3在介导癫痫大鼠神经元的凋亡中发挥了作用。     

氟哌利多对大鼠脑缺血海马CA1区锥体细胞持续钠通道电流的影响

背景脑缺血后离子通道通透性的异常和神经细胞内外离子平衡的紊乱是缺血性脑损伤的重要因素,钠通道激活引起的去极化是脑缺血损伤的始动环节.目的采用膜片钳技术测定氟哌利多对脑缺血海马CA1区锥体细胞持续性钠通道电流的影响,分析氟哌利多是否对脑缺血损伤产生保护?设计随机对照动物实验.单位上海交通大学附属第六人民医院麻醉科,上海交通大学附属第一人民医院麻醉科.材料实验于2002-04/2003-04在上海交通大学附属第一人民医院麻醉实验室完成.选择出生10～14 d未断乳的SD大鼠14只,每只鼠各选择2个海马CA1区细胞,共28个细胞,随机分为4组缺血对照组、氟哌利多3 μmol/L组、氟哌利多10 μmol/L组、氟哌利多30μmol/L组,7个/组. 方法酶消化法急性分离全部大鼠脑海马CA1区锥体细胞,通过低氧和无糖法制备神经元缺血模型.选择贴壁良好、呈三角形或星形、胞体较亮,折光性良好、突起明显、胞浆均匀一致、核仁明显的细胞用于实验.采用"Y-tube"系统快速给药,氟哌利多3,10,30 μmol/L组各自给予氟哌利多3,10,30μmol/L,缺血对照组不给药.全细胞膜片钳技术记录各组持续钠电流的基础值以及缺血3 min和5 min时钠通道电流的变化.主要观察指标①脑海马CA1区神经元正常持续钠电流的记录.②脑缺血时海马CA1区神经元持续性钠电流的记录.③不同浓度氟哌利多对脑缺血时持续性钠电流的影响.结果实验选用14只大鼠脑海马CA1区的28个细胞,全部进入结果分析.①脑海马CA1区神经元正常持续钠电流的记录使用钙通道阻滞剂CdCl2 0.5 mmol/L及钾通道阻滞剂TEA 20 mmol/L,在钳制电压-105 mV、刺激电压-30 mV下给予长为400 ms的方波刺激,可记录到一个较小的、激活较晚且持续时间较长的内向电流,经河豚毒素阻断证实为持续性钠电流.②脑缺血时海马CA1区神经元持续性钠电流的记录缺血对照组缺血3 min时持续钠电流增加为正常情况的(1.60±0.21)倍,缺血5 min时持续钠电流增加为正常情况的(2.87±0.45)倍,差异显著(P＜0.05).③不同浓度氟哌利多对脑缺血时持续性钠电流的影响缺血对照组、氟哌利多3,10,30 μmol/L组持续钠电流的基础值分别是(77.42±15.17)pA,(87.44±21.56)pA,(84.13±20.06)pA,(80.22±19.30)pA,组间比较差异无显著性意义.缺血5min后氟哌利多3,10,30μmol/L组持续性钠电流分别为(105.36±17.16)pA,(94.74±18.88)pA,(84.88±13.94)pA,明显低于缺血对照组(218.31±29.34)pA.结论在钳制电压-105mV、刺激电压-30mV条件下,脑缺血损伤时持续性钠电流增加,氟哌利多可能通过抑制持续性钠电流的增强而发挥神经元保护作用.     

围术期麻醉用药诱发癫痫样活动的研究进展

癫痫样活动指各种原因诱发大脑神经元异常放电导致局部或全身出现的单组或多组肌群阵发性不自主震颤、抽搐,甚至全身强直,伴或不伴有脑电图异常。全身麻醉或椎管内麻醉均可导致患者出现一定程度的抽搐,说明麻醉药可以诱发癫痫样活动,且其机制可能不尽相同。本文就目前围术期麻醉用药诱发的癫痫样活动的研究进展及可能机制进行总结。     

新生大鼠海马神经元的急性分离与膜片钳技术

目的:获得适用于膜片钳技术的单个海马神经元。方法:实验于2005-09/11在新乡医学院机能学研究室完成。应用酶消化及机械分离法,急性分离出生3～6d的SD大鼠海马神经元,在倒置显微镜下,选取已贴壁直径约10～15μm的锥体形神经元观察其急性分离效果和细胞活性状态。电生理学的鉴定采用全细胞膜片钳的模式记录电流反应,首先在大鼠海马CA1区锥体神经元诱发出内向离子流。在大鼠海马CA1锥体神经元诱发出内向离子流后,通过程控灌流系统在细胞外液中加1μmol/L的钠通道阻断剂河豚毒素灌流同一神经元,记录内向离子流的变化。结果:①该法可获得形态良好的单个海马神经元,海马锥体细胞具有锥形胞体穴10～20μm雪和厚墩的顶树突特征。活性较好的海马神经元熏胞体呈三角形或椭圆形,表面光亮,细胞膜完整、清晰的,立体感较强。一般有1个较长的顶树突和2个以上较短的基树突。②利用膜片钳技术内向电流被诱发,用1μmol/L河豚毒素完全阻断该电流,说明该内向电流为钠电流。结论:该法可获得形态和生理特性良好的单个海马神经元,证实该方法适用于海马神经元膜片钳研究,对深入探讨药物和毒物对海马离子通道及信号转导机制的作用有重要价值。