在大肠杆菌中合成人干扰素

为了研究人干扰素基因在大肠杆菌中的表达,作者构建了一些质粒。这些质粒含有由杂交的大肠杆菌启动子控制的IFN-β_1基因或IFN-aC基因。启动子中有tryp启动子的-35同感序列(consensus sequence)——TTGACA和Lac UV5启动子的-10同感序列     

由大肠杆菌表达生产重组人干扰素-γ

以常数和可变比生长速率进行分批补料发酵工艺，用于对表达人干扰素-γ(hIFN-γ)的大肠杆菌BL21(DE3)进行高细胞密度培养。通过控制气流和搅拌速度，并在必要时充以纯氧，使溶氧水平保持在空气饱和度的20％～30％。葡萄糖是唯一的碳源和能源。分别以常数和可变比生长速率补料策略进行分批发酵，在36和20h之后获得的终细胞密度分别达到了～100g干细胞重／L。     

β-干扰素

异名人成纤维细胞干扰素(Interferon-human Fibroblast)、HF—IF B-IF Fiblaferon,Feron 化学名为人成纤维细胞受诱导剂作用后产生的分子量约22,000的糖蛋白。与糖链结合的由166个氨基酸组成的多肽部分,分子式为C_(908)H_(1406)N_(246)O_(252)S_7,分子量为20,025。包含糖链后分子量约为22,000。药效分类抗肿瘤、抗病毒药开发单位 (美)Searle 上市厂商 (西德)Bioferon 1984年1月     

重组人干扰素-γ在大肠杆菌高细胞密度发酵中过量表达

将人干扰素-g(hIFN-g)置T7启动子的控制之下,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。在分批补料过程中,以葡萄糖作为唯一的碳源和能源,用指数加料速率进行补料。在恒定比生长速率(0.12 h-1)和可变比生长速率(0.12～0.52 h-1)下,重组大肠杆菌的细胞密度都达到了100g干重/L。后者质粒的稳定性和rhIFN-g的比产率高于前者。后者rhIFN-g的最终比产率和总产量分别达到了(0.35±0.02)·(g细胞干重)-1和(0.9±0.05)g·L-1·h-1。重组人干扰素-γ在大肠杆菌高细胞密度发酵中过量表达@袁宁…     

在大肠杆菌内合成一种具有人白细胞干扰素活性的多肽

一、前言几乎所有的脊椎动物细胞当其感染某些病毒或与诱异剂接触时都能产生一种或多种糖蛋白——干扰素(IFs)。IFs 能诱导靶细胞对病毒呈拮抗的状态,合成多种蛋白质,特别是一种蛋白激酶,寡聚异腺苷酸合成酶及磷酸二酯酶。此外,IFs 对免疫反应亦有调     

生产β-胡萝卜素大肠杆菌工程菌的构建

将噬夏孢欧文氏菌β-胡萝卜素合成相关基因crtE,crtB,crtI融合后克隆进表达载体pET-15b,构建表达载体pET-15bcrtEIB;将crtY首先克隆进pET-15b,构建pET-15bcrtY,再将crtY连同T7启动子和终止子切下,插入pACYC-184构建pACYC-184crtY。将以上两重组质粒共转化E.coli BL21(DE3)构建工程菌,IPTG诱导工程菌累积橙色色素,经吸收光谱分析,确定工程菌中合成的色素为β-胡萝素。β-胡萝卜素的最高含量可达3.5mg/g.DW,每升发酵液可得6.53g干菌体。     

人γ干扰素与α干扰素或β干扰素合用可增强抗病毒和抗细胞活性

作者联合应用人γ-干扰素(HuIFN-γ)和人γ-干扰素(天然或重组)或人β-干扰素(HuIFN-β),对IFN在转化的人羊膜WISH细胞、正常的二倍体纤维母细胞(Fs-4)和21三体纤维母细胞(Gm2767)的抗病毒和抗细胞活性进行了研究,结果如下:采用空斑试验法测定病毒产量,判断IFN的抗病毒活性,当HuIFN-α、β和γ以不同浓度(5、2.5和1.0U/ml)分别作用于WISH细胞,都能诱导抗病毒活性,且HuIFN-γ的作用比HuIFN-α或β强.以等浓度(2.5U/ml)     

重组人干扰素β1b活性标准品的稳定性研究

目的 评价重组人干扰素β1b(recombinant human interferon β1b,rhIFN-β1b)活性标准品在不同贮存温度条件下的稳定性.方法 检测在不同贮存温度(37 ℃、室温、4和-20 ℃)条件下放置不同时间段的rhIFN-β1b活性标准品的外观、溶解性、水分、pH值及生物学活性.结果 活性标准品分别在4种温度条件下放置90周生物学活性都没有降低的趋势,并且没有明显差别,同时水分、pH值等都符合规定.结论 说明辅料配方合理,可有效保护rhIFN-β1b,减少其降解,活性标准品稳定性良好.     

干扰素-β的研究进展

IFN-β是人和动物受到细菌、病毒、核苷酸等刺激物诱导下,由成纤维细胞、白细胞等产生的一种微量、高效的细胞因子。它具有抗病毒、抑制和杀伤肿瘤细胞、免疫调节等作用,主要用于多发性硬化症、肝炎或其它病毒性感染的治疗。本文将对干扰素β的分子结构、理化性质、生物学作用及其生产现状和发展前景做一简要概述。     

人β干扰素的放射免疫测定

作者用C-10细胞或正常的包皮成纤维细胞经超诱导制备人β干扰素(HuIFN-β),再用纯化的HuIFN-β免疫家兔,制备抗体,用HuIFN-β亲和层析法提纯抗-IFN-β免疫球蛋白,用~(125)Ⅰ标记,其比活性为0.11μci/μg蛋白。     

重组人内皮抑素在大肠杆菌中表达及其生物学活性鉴定

目的　利用大肠杆菌原核表达系统表达重组人内皮抑素Endostatin ,并对其进行生物学活性鉴定。方法　采用RT-PCR方法从人胚肝中钓取人内皮抑素cDNA ,将其克隆入pGEM-TEasy克隆载体中;经全自动序列分析仪测序确证后,将人内皮抑素cDNA亚克隆入原核表达载体pWR450-1 ,构建含人内皮抑素cDNA的重组质粒;将该重组质粒转化入大肠杆菌TG₁中进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定;表达产物初步纯化复性后以鸡胚尿囊膜血管生成抑制实验和小鼠伤口愈合实验对其进行生物学活性鉴定。结果　成功获得549bp人endostastin基因,测序证实序列正确。经IPTG诱导的重组原核表达质粒表达出重组人内皮抑素的融合蛋白,此蛋白在SDS-PAGE凝胶上显示出一条约75KD的阳性条带。重组人内皮抑素融合蛋白的初纯物在体外能抑制鸡胚尿囊膜血管生成及延长小鼠伤口愈合时间。结论　人内皮抑素融合蛋白在大肠杆菌原核表达系统中高水平表达,并具有抗血管生成活性,为采用抗血管生成方法治疗恶性实体肿瘤的研究奠定了基础     

重组人内皮抑素在大肠杆菌中表达及其生物学活性鉴定

目的 利用大肠杆菌原核表达系统表达重组人内皮抑素Endostatin,并对其进行生物学活性鉴定。方法 采用RT—PCR方法从人胚肝中钓取人内皮抑素cDNA,将其克隆入pGEM—T Easy克隆载体中;经全自动序列分析仪测序确证后,将人内皮抑素cDNA亚克隆入原核表达载体pWR450—1,构建含人内皮抑素cDNA的重组质粒;将该重组质粒转化入大肠杆菌TG1中进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定;表达产物初步纯化复性后以鸡胚尿囊膜血管生成抑制实验和小鼠伤口愈合实验对其进行生物学活性鉴定。结果 成功获得549bp 人 endostastin基因,测序证实序列正确。经IPTG诱导的重组原核表达质粒表达出重组人内皮抑素的融合蛋白,此蛋白在SDS-PAGE凝胶上显示出一条约75KD的阳性条带。重组人内皮抑素融合蛋白的初纯物在体外能抑制鸡胚尿囊膜血管生成及延长小鼠伤口愈合时间。结论 人内皮抑素融合蛋白在大肠杆菌原核表达系统中高水平表达,并具有抗血管生成活性,为采用抗血管生成方法治疗恶性实体肿瘤的研究奠定了基础。     

重组人干扰素β-1a注射液制剂安全性研究

目的 检测重组人干扰素β-1a注射液的制剂安全性并探讨可能的影响因素。方法 分别以重组人干扰素β-1a注射液进行家兔肌肉和皮下刺激性试验、豚鼠主动全身过敏性试验、大鼠被动皮肤过敏性试验和体外溶血性试验,检测药物的局部刺激性、Ⅰ型过敏反应性和溶血作用。结果 pH 3.6的11、22 μg/kg重组人干扰素及其空白溶媒对家兔肌肉和皮肤黏膜具有轻度刺激作用,相应剂量下pH为4.3的重组干扰素及其空白溶媒对家兔组织无明显刺激作用;pH 3.5的5.5、22 μg/kg剂量下重组人干扰素及其空白溶媒对大鼠无被动致敏作用,对豚鼠主动致敏作用呈强阳性,辅料中不含人血清白蛋白的样品则对豚鼠无致敏作用;pH 3.5的重组人干扰素对家兔红细胞具有极轻度体外溶血作用,pH 4.5样品则无体外溶血和致红细胞凝聚作用。结论 pH值对重组人干扰素β-1a注射液刺激性和体外溶血性具有一定影响,应注意对其pH值的控制;干扰素对豚鼠致敏作用为辅料中人血清白蛋白所致,临床使用中对人产生致敏的可能性很小。重组人干扰素β-1a注射液制剂安全性较好。     

重组人β干扰素在DHFR~--CHO细胞中的高效表达

目的由二氢叶酸还原酶缺陷型的中国仓鼠卵巢(DHFR--CHO)细胞高效表达重组人β干扰素(rhIFN-β),比较来源于E.coli、Yeast和CHO细胞的IFN-β抗增殖活性。方法采用PCR技术,从pLG104R载体中扩增目的基因,经XhoⅠ和SmaⅠ双酶切后克隆到真核表达载体pCI-dhfr中,采用阳离子脂质体介导方法,将构建的表达载体转染到CHO细胞中。通过MTX的加压筛选,以病毒诱导的细胞病变抑制(CPEI)法进行活性定量检测,获得稳定、高效表达rhIFN-β的CHO细胞株,并扩大培养。分离纯化后,定量并鉴定表达产物。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法比较E.coli、Yeast和CHO细胞表达体系所生产的rhIFN-β的抗增殖活性。结果得到由CHO细胞株表达的rhIFN-β纯品,且抗增殖活性显著高于其他2个表达体系。结论CHO细胞可大规模生产rhIFN-β,且活性高于其他表达体系,显示了以CHO细胞为生产平台的优越性。     

重组人干扰素β-1a注射液的安全药理学研究

目的 研究重组人干扰素β-1a注射液对实验动物中枢神经系统、呼吸系统、心血管系统以及消化系统的影响,观察药物潜在的对生理功能的不良影响,为临床实验提供依据及参考。方法 小鼠单次sc重组人干扰素β-1a注射液5.5、22.0、88.0 μg/kg,观察小鼠自主活动,进行平衡协调能力和协同睡眠实验,研究药物对动物中枢神经系统的影响;食蟹猴单次sc重组人干扰素β-1a注射液1、4、16 μg/kg,观察食蟹猴的心电、血压、呼吸频率、呼吸幅度,研究药物对动物呼吸系统和心血管系统的影响;小鼠单次sc重组人干扰素β-1a注射液5.5、22.0、88.0 μg/kg,进行胃肠推进实验,研究药物对胃肠消化系统的影响。结果 小鼠单次sc重组人干扰素β-1a注射液,5.5、22.0、88.0 μg/kg剂量组动物自主活动、平衡运动能力未见明显变化、未见与阈下剂量戊巴比妥钠协同睡眠作用,且未见胃肠推进的明显变化;食蟹猴单次sc重组人干扰素β-1a注射液,1、4、16 μg/kg剂量组动物未见明显剂量或时效相关性的心血管、呼吸系统影响。结论 重组人干扰素β-1a注射液对实验动物的中枢神经系统、呼吸系统、心血管系统及消化系统均未见明显药物影响。     

新型重组人-αB/D干扰素的抗病毒活性

作者对一种新型的重组人-αB/D干扰素(rHu IFN-αB/D)的抗病毒能力进行了研究.在培养14天的人单个核细胞中,rHu IFN-αB/D明显地抑制了1型单纯疱疹病毒(HSV-1/VR3)的复制及其对细胞的破坏作用,其抑制效果比同剂量rHu IFN-αA或IFN-γ好.用HSV-1/VR3鼻内感染小鼠后     

基于蛋白酶活性控制的重组人β干扰素毕赤酵母表达体系优化

以毕赤酵母人β干扰素表达体系为研究对象,考察与蛋白酶活性相关的营养和环境因素对外源蛋白hIFN-HAS表达/降解的影响。结果表明,pH、谷氨酸和EDTA是显著影响hIFN-HAS表达的3个因素。通过响应面分析得到hIFNβ-HAS表达的最优条件为pH 5.5、谷氨酸0.18%、EDTA 12 mmol/L,目的蛋白表达量为24.46 mg/L。发酵终产物的电泳结果表明:条件优化后,hIFNβ-HSA降解带明显变淡,说明营养和环境因素的优化一定程度上抑制了蛋白酶的活性,由此增加了目的蛋白的积累。     

人干扰素生产的现状及进展

近年来大量制备干扰素(IFN)的方法取得了进展,已可获得相当数量的部份纯化IFN,进行临床疗效观察和基础研究。目前用人细胞制备的 IFN 有白细胞、类淋巴母细胞、成纤维细胞和免疫 IFN,除后者尚处于研究阶段外,其他几种均已能大量生产。本文对此作一扼要叙述,至于用 DNA 重组技术生产IFN 则不在本文范围之内。     

重组人干扰素大肠杆菌高效表达系统的建立

目的:构建重组人干扰素-α2b(rhIFN-α2b)原核表达系统,以获得rhIFN-α2b在大肠杆菌中的高效表达。方法:依据大肠杆菌遗传密码子频率表,在不改变氨基酸组成的情况下,人工半合成适于在大肠杆菌中表达的rhIFN-α2b编码序列;经PCR扩增后,克隆人表达型质粒载体pDH;筛选阳性菌落,温度诱导表达,表达产物行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白质印迹(WesternBlot)鉴定,并以人羊膜细胞-水泡性口炎病毒(WISH-VSV)系统鉴定rhIFN-α2b抗病毒活性。结果:PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定可见与预期大小符合的512bp的DNA条带;重组质粒pDH/IFN-α2b经序列分析,证实含有与预期相符且读码框架正确的hIFN-2b编码序列;SDS-PAGE可见与IFN-α2b分子质量大小一致的蛋白质条带,WesternBlot鉴定此条带为rhIFN-2b,其比活性达(1.8～2)×108U/mg。结论:rhIFN-α2b在大肠杆菌中的高效表达系统构建成功,且能高水平地表达出具有生物活性的rhIFN-α2b。