支气管哮喘豚鼠模型支气管肺组织血管细胞粘附分子和Eotaxin的表达及调控

目的　研究支气管哮喘 (简称哮喘 )时嗜酸细胞选择性粘附分子———血管细胞粘附分子(VCAM 1)和趋化因子Eotaxin及转录调控因子核因子 (NF) κB、活化蛋白 1(AP 1)在大、小气道及肺组织中的表达 ,探讨嗜酸细胞趋肺的机制。方法　以卵蛋白致敏法制备豚鼠哮喘模型 ,3 6只豚鼠分设 6组 ,每组 6只。对照组 (F组 )、哮喘 1天组 (A组 )、哮喘 4天组 (B组 )、哮喘 14天组 (C组 )、地塞米松注射组 (D组 )、布地奈德吸入组 (E组 )。用免疫组化法分别测定VCAM 1、Eotaxin、NF κB和AP 1在段支气管及细支气管肺泡区的蛋白表达 ,用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)法测定肺组织匀浆VCAM 1及Eotaxin的mRNA表达 ,电泳迁移实验 (EMSA)测定肺组织匀浆NF κB及AP 1的DNA结合活性。结果各模型组显示 ,与段支气管相似 ,细支气管肺泡区VCAM 1、Eotaxin的蛋白C组分别为 (2 6 3± 3 2、89 0± 8 6)及mRNA相对表达量与F组 (11 2± 3 7、5 0± 4 0 )比较 (P <0 0 1、0 0 0 1) ;NF κB及AP 1的蛋白相对表达量 (C组分别为 179± 7、76± 6) ,与F组 (3 6± 3、2 7± 5 )比较 (P <0 0 1、0 0 0 1) ,且与VCAM 1、Eotaxin呈显著正相关 (r分别 =0 919、0 965　 0 90 4、0 881,P均 <0 0 0 1) ;以上 4项指标在B、C组段支气管及     

丝裂原活化蛋白激酶与γ谷氨酰半胱氨酸合成酶在大鼠慢性阻塞性肺疾病肺组织中的表达

我们前期的研究表明了γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GSC)在慢性阻塞性肺疾病(COPD)和支气管哮喘(简称哮喘)中的重要作用。本组实验探讨细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p-p38与γ-GCS在大鼠COPD中的作用。     

丝裂原活化蛋白激酶与核因子E2相关因子调节γ谷氨酰半胱氨酸合成酶在豚鼠支气管哮喘中的作用

我们通过检测支气管哮喘（简称哮喘）豚鼠肺组织中丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）[磷酸化细胞外激活蛋白激酶（p-ERK）、磷酸化c-Jun氨基末端激酶（p-JNK）和磷酸化P38（p-P38）]和Nrf2的表达,探讨MAPK-Nrf2信号通路对γ谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）的可能调控作用及在哮喘发病中的作用.     

γ谷氨酰半胱氨酸合成酶在大鼠慢性阻塞性肺疾病中的表达

研究表明,氧化/抗氧化失衡是慢性阻塞性肺疾病(COPD)主要发病机制之一。肺组织中重要的抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)对纠正氧化失衡,保护肺组织免受氧化损伤起关键作用。γ谷氨酰半胱氨酸合成酶(γGCS)是GSH合成的限速酶,调控GSH生成的速度和量。为此,我们的实验初步探讨γGCS在大鼠COPD中的作用。材料与方法　雄性Wistar大鼠14只,平均体重(2 0 0±2 0 )g ,随机分为COPD组和对照组,每组7只。每天熏香烟及2次气管内滴入2 0 0 μg脂多糖法制作COPD大鼠动物模型[1] 。按文献[2 ]方法测定γGCS活性。免疫组织化学法测定肺组织c fos、c j…     

Nrf2调控γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶表达与慢性阻塞性肺疾病

Nrf2（NF-E2 related factor）在参与细胞抗氧化应激和外源性有毒物质诱导的主要防御机制中发挥重要的作用，是外源性有毒物质和氧化应激的感受器。细胞质Keap1蛋白是Nrf2的负调节因子。Nrf2能调控Ⅱ相解毒酶基因如γ谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）的表达。氧化／抗氧化失衡是慢性阻塞性肺疾病的主要发病机制。谷胱甘肽（GSH）是肺内主要的抗氧化剂，而γ-GCS是GSH的限速酶，因此通过Nrf2途径调控细胞内γ-GCS的表达具有重要作用。     

支气管哮喘豚鼠肺内肾上腺髓质素和受体表达及地塞米松的影响

肾上腺髓质素(ADM)是从肾上腺嗜铬细胞瘤中分离出的一种新的生物活性肽…，具有舒张血管、扩张支气管等多种作用^[2]。支气管哮喘(简称哮喘)发作时ADM及其受体(ADMR)基因表达过程仍未明确，我们的研究旨在观察哮喘豚鼠肺内ADM／ADMR基因的表达以及是否受糖皮质激素的调控。     

转化生长因子β1在慢性阻塞性肺疾病γ谷氨酰半胱氨酸合成酶表达调控中的作用

谷胱甘肽（GSH）作为肺最主要的抗氧化剂在肺部抗氧化损伤中发挥着重要作用，γ谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）是GSH生物合成的限速酶。慢性阻塞性肺疾病以患者肺内GSH水平降低和转化生长因子（TGF）哏浓度升高为特征。TGF-β1是GSH合成强有力的抑制因子，这种抑制作用在一定程度上是通过对γ-GCSh编码基因转录过程的调控实现的。TGF—β1下调γ-GCSh表达的分子机制可能与活化蛋白（AP）-1有关。     

慢性阻塞性肺疾病患者γ谷氨酰半胱氨酸合成酶活性及表达的变化

目的　研究慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者体内氧化/抗氧化状态改变,探讨γ谷氨酰半胱氨酸合成酶(γGCS)及其mRNA在肺内分布及表达变化。方法　(1)收集急性期COPD患者(13例)和普通体检者(9名)血清标本,检测还原型谷胱苷肽(GSH)、活性氧(ROS)、总抗氧化力(TAOC)和γGCS活性;(2)收集肿瘤伴或不伴COPD肺叶切除患者临床标本(COPD组12例,对照组10例),用免疫组化和原位杂交方法检测肺组织中γGCS及γGCSmRNA表达;并进行相关分析。结果(1)急性期COPD患者血清中GSH[(2387±386)mg/ml]降低、ROS[(2463±199)U/ml]增高、TAOC[(534±022)U/ml]降低、γGCS活性[(1922±336)U/ml]增强,与对照组[分别为(3687±634)mg/ml、(1023±112)U/ml、(1136±107)U/ml和(1237±296)U/ml]比较差异均有统计学意义(P均<005);(2)急性期COPD患者血清中GSH、ROS、TAOC、γGCS活性和一秒钟用力呼气容积占预计值百分比(FEV1占预计值%)、一秒钟用力呼气容积/用力肺活量(FEV1/FVC)、动脉血氧分压(PaO2)、动脉血二氧化碳分压(PaCO2)之间无相关性(P>005);(3)原位杂交发现,γGCSmRNA在COPD组肺泡、支气管和炎症细胞中呈高表达[吸光度(A)值半定量分析分别为029±005、031±005和028±006],与对照组(分别为014±003、017±004和020±005)比较差异均     

香烟烟雾对大鼠气道上皮细胞γ谷氨酰半胱氨酸合成酶表达的调控作用

氧化／抗氧化失衡是慢性阻塞性肺疾病（COPD）的主要发病机制之一。本研究室前期的研究结果表明，抗氧化剂谷胱甘肽（GSH）及其合成限速酶γ谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）在COPD的抗氧化机制巾起重要作用。红系衍生的核因子相关因子2（Nrf2）是上调抗氧化基因表达的关键转录冈子，在抗氧化机制中发挥重要的作用，在COPD大鼠肺组织中磷脂酰肌醇-3-激酶／蛋白激酶B（P13k／Akt）信号通路可能通过激活Nrf2参与γ-GCS的表达调控。     

大鼠γ谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位基因5''端调控序列初步分析

目的分析大鼠γ谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)催化亚单位(GCLC)基因5'端调控区域和相应转录因子的特性.方法克隆1 760 bp大鼠GCLC上游调控基因并构建含荧光素酶基因的报道载体GCLC-Luc(GCLC/pGL-3),利用外切核酸酶Ⅲ将大鼠GCLC基因的5'端序列单向切成不同长度的缺失体,将所构建的GCLC-Luc及其11个缺失体转染大鼠肺泡上皮细胞,通过测量转染后细胞的荧光素酶活性确定该基因的调控区域,并通过转录因子分析软件分析出可能与这些调控区域结合的转录因子,最后通过电泳迁移率改变实验(EMSA)以明确该调控区的顺式元件和转录因子.结果实验成功地克隆出大鼠GCLC上游调控基因及其报道载体GCLC-Luc及GCLC-Luc的11个缺失体.将GCLC-Luc及其缺失体转染肺泡上皮细胞并分析荧光素酶活性GCLC-Luc(-1 758/+2-Luc),缺失体1(-1 231/+2-Luc),缺失体2(-1 108/+2-Luc),缺失体3(-1 087/+2-Luc),缺失体4(-876/+2-Luc),缺失体5(-745/+2-Luc),缺失体6(-705/+2-Luc),缺失体8(-613/+2-Luc),缺失体9(-595/+2-Luc),缺失体10(-403/+2-Luc)和缺失体11(-111/+2-Luc)的荧光素酶值分别为(90 012±2 445)、(77 652±840)、(149 927±4 915)、(71 588±1 108)、(99 283±2 612)、(75 443±1 438)、(282 772±7 046)、(96 891±2 275)、(148 917±5 966)、(258 991±5 015)和(895±49)U.EMSA证实核因子1(NF-1)、CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)能与-705～-613 bp区段的序列结合,活化蛋白1(AP-1)、核因子κB(NF-κB)能与-403～-111 bp区段的序列结合,上游刺激因子(USF)能与-745～-705 bp区段的序列结合.结论 GCLC基因的-403～-111 bp和-705～-613 bp区段属正调控区域,NF-1、C/EBP、AP-1、NF-κB等转录因子能与这些正调控区域结合并可能参与GCLC基因的表达调控;-745～-705 bp属负调控区域,USF能与该负调控区域的E-box元件结合,提示E-box与USF相互作用可能抑制GCLC基因的表达.     

哮喘豚鼠模型细支气管和肺组织的病理学研究

目的深化对哮喘小气道及肺组织病理改变的认识。方法以卵蛋白致敏法制备哮喘豚鼠模型,共设6组对照组、哮喘1日组、哮喘4日组、哮喘14日组、氟美松组及布地奈德组。观察和比较6组豚鼠大、小气道及肺泡区病理学改变及炎性细胞浸润情况。行支气管肺泡灌洗,并行细胞计数及分类。电镜观察肺泡细胞的形态。测定支气管肺泡灌洗液(BALF)中总磷脂的含量。结果各哮喘模型组豚鼠支气管黏膜上皮、基底膜、平滑肌增厚,肺泡隔较对照组显著增宽(P<0.001),肺泡腔变小;大、小气道及肺泡区有大量嗜酸粒细胞及淋巴细胞浸润;BALF中细胞总数较对照组显著增多(P<0.01),早期以中性粒细胞为主,晚期则以嗜酸粒细胞和淋巴细胞为主;电镜示肺泡Ⅱ型上皮细胞肿胀、板层体排空及部分脱落;BALF中总磷脂含量较对照组显著降低(P<0.01)。氟美松组及布地奈德组以上改变显著减轻,接近对照组。结论支气管哮喘时细支气管和肺组织也广泛存在着以嗜酸粒细胞为主的炎症;肺泡细胞在形态学改变的同时,也发生着功能的改变。     

烟雾暴露对支气管哮喘豚鼠肺内P物质含量及其基因表达的影响

为探讨烟雾暴露对支气管哮喘(简称哮喘)豚鼠肺组织、支气管肺泡灌洗液(BALF)、血液中P物质(SP)含量及其肺组织中SP基因表达的影响,我们对此进行了研究并探讨了烟雾暴露对SP的影响机制。材料与方法　选择1 5～2 0个月龄、体重2 5 0～2 75 g及饲养条件一致的豚鼠5 0只,按随机数字表法将豚鼠分为以下5组,每组10只。( 1)常规诱喘组(A组) :用经典的卵蛋白吸入法制作哮喘模型[1] ,即将单只豚鼠置于半封闭的容器中,于第1、4、7天分别超声雾化吸入1%卵蛋白各3min使其致敏;第2 1天超声雾化吸入2 %卵蛋白5min激发诱喘;( 2 )烟雾暴露2周后诱喘组(…     

核因子相关因子2及其蛋白激酶与γ谷氨酰半胱氨酸合成酶在慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织的表达

本室前期研究结果显示，γ谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）作为体内重要抗氧化剂谷胱甘肽的限速酶，在慢性阻塞性肺疾病（COPD）的抗氧化机制中发挥了重要的作用。红系衍生的核因子相关因子2（NRF2）是新近发现的氧化应激反应重要的转录激活因子，在氧化应激反应中处于核心地位。国外报道蛋白激酶B（PKB）、非典型蛋白激酶c（aPKC）信号通路可能在不同的角度对NRF2的生物学功能进行调节。目前对NRF2的信号转导通路的研究很少涉及到整体的模型，不同实验室在不同的组织细胞中所得结果不同。我们通过检测COPD大鼠肺组织中PKB、aPKCλ/l、NRF2和γ-GCS的表达及相关作用，以探讨其在COPD抗氧化机制中的作用。     

环孢素A对支气管哮喘豚鼠肺内嗜酸粒细胞凋亡及Fas表达的影响

支气管哮喘（简称哮喘）是一种涉及多种炎性细胞的慢性炎症性疾病，其中嗜酸粒细胞（EOS）是关键的效应细胞。EOS凋亡异常在哮喘气道炎症发生中的作用已有研究。糖皮质激素（简称激素）诱导EOS凋亡可能为其抗哮喘气道炎症的重要机制。但激素对抵抗型哮喘的治疗是临床上面临的一大难题。初步临床观察表明，小剂量环孢素A（CSA）可以使激素抵抗型哮喘患者肺功能明显改善而激素用量减少，但其确切机制尚不清楚。我们的实验通过环孢素A对哮喘豚鼠肺内EOS凋亡及Fas表达的影响，来揭示环孢素A治疗哮喘的可能机制。     

地塞米松对哮喘豚鼠肺组织G蛋白α亚族的调控研究

抗哮喘药物种类繁多并不断增加 ,但糖皮质激素 (ＧＣ)作为临床一线用药其地位至今无法替代。ＧＣ的抗哮喘机制是复杂的 ,要想准确解释其平喘机制仍待时日。近来发现 ,许多药物通过与Ｇ蛋白藕联的受体相互作用发挥药效 ,我们发现哮喘豚鼠肺组织Ｇα亚族表达增高与其发病有关[1] ,ＧＣ的抗哮喘作用是否与调控Ｇ蛋白的表达有关尚少见报道。我们的实验用卵蛋白致敏复制豚鼠哮喘模型 ,用地塞米松 (ＤＥＸ)进行干预 ,通过测定Ｇ蛋白α亚族的表达变化 ,以期从信号转导的角度阐述ＧＣ的抗哮喘机制。材料与方法　雄性豚鼠 18只 (本校动物中心提供 ) ,…     

不同潮气量机械通气对大鼠肺组织激活蛋白-1、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的影响

目的通过观察不同潮气量机械通气对大鼠肺组织激活蛋白-1（AP-1）和1-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ—GCS）表达的影响,探讨氧化-抗氧化系统失衡在呼吸机所致肺损伤（VILI）发生中的作用。方法24只雄性Wistar大鼠随机分为对照组、小潮气量（L—VT）组和大潮气量（H—VT）组,每组8只。光镜下观察各组大鼠肺组织病理损伤程度;采用硫代巴比妥酸比色法测定大鼠血浆及肺组织中丙二醛（MDA）含量,原位分子杂交技术和免疫组织化学染色法检测肺组织AP-1和γ-GCSmRNA及其蛋白表达水平。结果H—VT组大鼠肺组织和血浆中MDA含量明显高于对照组和L—VT组（均P〈0．01）,肺组织病理损伤程度较对照组和L—VT组明显加重;L—VT组与对照组比较差异无统计学意义（P〉0．05）。H—VT组肺组织γ-GCSmRNA及其蛋白表达水平明显低于对照组和L—VT组（均P〈0．01）,而AP-1mRNA及其蛋白表达水平明显高于对照组和L—VT组（均P〈0．01）,L—VT组与对照组比较差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论大潮气量机械通气通过上调肺组织AP-1mRNA及其蛋白表达,抑制γ-GCS活性,导致肺组织局部谷胱甘肽合成减少和氧化-抗氧化系统失衡,可能是VILI发生的重要因素之-。     

地塞米松对哮喘豚鼠PS的影响

将24只雄性豚鼠随机分为哮喘组,地塞米松干预组,两组均用高效液相色谱法测定其支气管肺泡灌洗液（BALF）中的磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）水平;用Lowry法测定BALF中的总蛋白含量;电镜观察两组肺表面活性物质（PS）超微结构变化。结果显示,与哮喘组比较,地塞米松干预组BALF中PC和PE增加。总蛋白降低（P〈0．01）。哮喘组PS层丧失正常的连续结构,肺泡Ⅱ型上皮细胞内板层体空泡化;地塞米松干预组PS层基本连续。肺泡Ⅱ型上皮细胞内板层体少量空泡化。提示地塞米松对PS的影响可能为其有效治疗哮喘的作用机制之一。     

丝裂原活化蛋白激酶、蛋白激酶B和γ谷氨酰半胱氨酸合成酶在慢性阻塞性肺疾病患者肺组织中的表达

我们前期研究表明，γ谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）是体内重要抗氧化剂谷胱甘肽（GSH）的限速酶，在慢性阻塞性肺疾病（COPD）发病中起重要作用。我们观察COPD患肺组织中γ-GCS与蛋白激酶的表达，探讨丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）蛋白激酶B（PKB）信号通路与γ-GCS在COPD发病中的作用。     

慢性阻塞性肺疾病大鼠磷脂酰肌醇-3激酶、蛋白激酶B及γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶表达研究

目的通过观察COPD大鼠中磷脂酰肌醇-3激酶（phosphoinositide-3 kinases,P13K）、蛋白激酶B（protein kinaseB,PKB）与γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（gamma glutamylcysteine synthetase,γ-GCS）的表达,研究P13K、PKB通路和rGCS的关系及其在COPD中可能的参与机制。方法30只健康雄性Wistar大鼠随机分COPD组和对照组。采用每日熏香烟和两次气管内注入脂多糖法制作COPD大鼠模型。检测大鼠肺组织中7-GCS活性,原位杂交检测肺组织中rGCSmRNA的表达,免疫组织化学分析肺组织中P13K、PKB与γ-GCS蛋白水平。结果COPD组大鼠肺组织中γ-GCS差异（P〈0．01）。P13K、PKB与γ-GCS免疫组织化学在COPD组可见肺泡、支气管活性明显高于对照组,组间差异有统计学意义（P〈0．01）。原位杂交示COPD组大鼠支气管,肺泡上皮细胞与小动脉平滑肌细胞7-GCSmRNA广泛表达,与对照组有显著性壁细胞及小血管平滑肌细胞胞浆中皆有蛋白阳性信号表达;图象定量分析示大鼠COPD组P13K、PKB与γ-GCS蛋白表达显著高于对照组（P〈0．01）。直线相关分析得出P13K、p—PKB蛋白表达与γ-GCS活性、mRNA及蛋白表达呈正相关。结论COPD大鼠肺组织7-GCS蛋白和mRNA表达增高,P13K、p-PKB蛋白也有相应高表达,提示P13K、PKB和γ-GCS可能在COPD的发病机制中发挥作用,且可能参与了γ-GCS的信号转导通路。     

大剂量氨溴索对机械通气大鼠肺组织激活蛋白-1、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的影响

目的 通过观察不同剂量氨溴索对机械通气大鼠肺组织激活蛋白-1(AP-1)和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)表达的影响,探讨大剂量氨溴索对呼吸机所致肺损伤(VILI)的干预作用.方法 32只雄性Wistar大鼠随机分为对照组、机械通气(MV)组、常规剂量氨溴索(CDAMB)组和大剂量氨溴索(HDAMB)组,分别采用原位分子杂交技术和免疫组织化学染色法检测肺组织AP-1和γ-GCS Mrna及其蛋白表达水平.结果 MV组和CDAMB组大鼠肺组织AP-1 Mrna及其蛋白表达水平明显高于对照组,而γ-GCS Mrna及其蛋白表达水平则明显低于对照组(P<0.01).HDAMB组AP-1 Mrna及其蛋白表达水平明显低于MV组和CDAMB组,而γ-GCS Mrna及其蛋白表达水平高于MV组和CDAMB组(P<0.01).MV组和CDAMB组各项指标比较差异无统计学意义.结论 氧化/抗氧化失衡参与了VILI的发病过程.大剂量氨溴索可通过抑制机械通气大鼠肺组织AP-1的表达和上调γ-GCS的表达而发挥抗氧化作用,对VILI有一定保护作用.