地高辛标记原位杂交技术检测骨髓单个核细胞中HCV RNA

为探讨丙型肝炎病毒(HCV)肝外感染、复制场所与肝损害的关系,应用地高辛标记HCV RNA 探针原位杂交技术,对20例慢性丙型肝炎患者骨髓单个核细胞中的 HCV RNA(包括正链 RNA 和负链 RNA)进行了检测。结果有18例骨髓单个核细胞用正链 HCV RNA 探针杂交在较多细胞中出现杂交信号(90%),而所有患者骨髓单个核细胞用负链 HCV RNA 探针杂交无杂交信号出现。结果提示:慢性丙肝患者骨髓中存在 HCV RNA,即骨髓可受到丙肝病毒感染.但骨髓单个核细胞负链 RNA 阴性表明骨髓细胞并非 HCV 的复制场所。本研究对阐明 HCV 在人体中的致病作用以及丙肝的慢性化有一定的意义。     

同步检测血浆和外周血单个核细胞中HCV RNA的临床研究

目的探讨联合检测对提高HCV RNA在慢性丙型肝炎患者中检出率的临床意义.方法利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术对583例ALT升高持续1年以上的患者进行同步检测血浆和外周血单个核细胞(PBMC)中的HCV RNA.结果血浆中HCV RNA总检出率为19.2%.PBMC中HCV RNA总检出率为24.5%,HCV RNA在PBMC中的检出率明显高于血浆中的检出率.结论两种方法同时应用能够提高HCV RNA在慢性丙型肝炎患者中的检出率.     

原位反转录PCR检测慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞中HCV

目的研究慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌ，ＰＢＭＣ）中丙型肝炎病毒的定位分布及复制。方法直接原位反转录－ＰＣＲ（标记引物）对２０例慢性丙型肝炎患者的ＰＢＭＣ内丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）的分布、定位及存在形式进行研究。结果１６例患者外周血单个核细胞的胞浆内发现ＨＣＶＲＮＡ阳性信号，并有一例患者的胞浆内发现ＨＣＶＲＮＡ负链信号。结论ＨＣＶ可感染ＰＢＭＣ并在其中复制。原位ＲＴ－ＰＣＲ为进一步研究ＨＣＶ进入人体内的分布、潜伏、复制状况以及丙型肝炎治疗、药物研究奠定了基础。     

慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞中负链HCV RNA的检测及意义

19例临床诊断慢性丙型肝炎患者,检测其外周血单个核细胞中丙型肝炎病毒(HCV)RNA的存在及复制状态。所选检测对象血清标本抗-HCV及HCV RNA均为阳性。采用逆转录-套式PCR法检测其外周血单个核细胞中HCV正、负链RNA,结果19例患者外周血单个核细胞中14例HCV正链RNA阳性;6例HCV负链RNA阳性。实验结果证实部分慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞中存在HCV复制,表明肝细胞并非为HCV感染与复制的唯一场所。HCV感染慢性化与其外周血单个核细胞中存在HCV复制可能有一定关系。     

丙型肝炎病毒RNA在血浆及外周血单个核细胞中的检测意义

丙型肝炎属于黄病毒家族的E链RNA病毒。HCV感染的最大特点是极易演变为慢性。且病情有逐步加重的趋势。目前有少数学者在研究丙型肝炎发病机理时,证实了外周血单个核细胞中存在HCV RNA。为进一步探讨患者不明原因ALT升高、查找病原学,我们将细胞内检测HCV RNA技术用于临床,对疑为丙型肝炎的患者同步检测血浆及外周血单个核细胞中HCV RNA,现报道如下。 1 材料与方法     

丙型肝炎患者血清和外周血单个核细胞中HCV RNA检测及意义

采用套式PCR检测38例急性丙型肝炎和36例慢性丙型肝炎患者血清和外周血单个核细胞(PBMC)中HCV RNA。结果显示74例丙型肝炎患者血清HCV RNA阳性68例,PBMC阳性44例;急性丙型肝炎患者PBMC中HCV RNA阳性15例(39.5％),慢性丙型肝炎患者PBMC中阳性29例(80.5％);3例血清HCV RNA阴性,而PBMC中HCV RNA阳性;8例患者血清抗-HCV阴性,而血清HCV RNA阳性。结果显示,在部分丙型肝炎患者的PBMC中存在HCV RNA,慢性丙型肝炎患者PMBC中HCV RNA检出率显著高于急性丙型肝炎患者(P<0.01)。提示PBMC可能为HCV肝外贮存和复制场所,PBMC中的HCV感染在丙型肝炎慢性化和慢性肝损害中可能起一定作用,血清HCV RNA检测可能有助于抗-HCV阴性丙型肝炎的诊断。     

地高辛标记原位杂交技术检测骨髓单个细胞中HCV RNA

为探讨丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）肝外感染、复制场所与肝损害的关系，应用地高辛标记ＨＣＶ ＲＮＡ探针原位杂交技术，对２０例慢性丙型肝炎患者骨髓单个核细胞中的ＨＣＶ ＲＮＡ（包括正边ＲＮＡ和负链ＲＮＡ）进行了检测。结果有１８例骨髓单个核细胞用正链ＨＣＶ ＲＮＡ探针杂交在较多细胞中出现杂交信号（９０％），而所有患者骨髓竟单个核细胞用负链ＨＣＶ ＲＮＡ探针杂交无杂交信号出现。结果提示：慢性丙肝患者骨髓中存在的     

实时荧光定量RT-PCR检测血清和单个核细胞中HCV RNA的意义

目的探讨实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)检测血清和外周血单个核细胞(PBMCs)中HCV RNA含量及其临床价值。方法采集可疑丙型病毒性肝炎病人血,用FQ-RT-PCR分别检测血清和PBMCs中HCV RNA含量。血清或PBMCS HCV RNA阳性者都视为HCV RNA阳性。结果检测可疑患者180例,HCV RNA阳性106例。其中血清HCV RNA阳性84例,占79.25%;PBMCs HCV RNA阳性63例,占59.43%。HCV RNA阳性比率血清高于PBMCs(χ2=9.78,P<0.01)。单独血清HCV RNA阳性43例,占40.57%;单独PBMCs HCV RNA阳性22例,占20.75%;血清和PBMCs中HCV RNA同时阳性41例,占38.68%。血清和PBMCs HCV RNA含量差异无显著性。结论同时检测血清和PBMCs HCV RNA可提高HCV感染诊断的阳性率,检测PBMCs HCV RNA对抗病毒治疗的疗效评价及治疗时间有重要意义。     

乙肝患者外周血单个核细胞中乙肝病毒复制中间产物RNA的检测及临床意义

采用逆转我聚酶链反应技术检测乙肝患者外周血单个核细胞乙肝病毒复制中间产物ＲＮＡ。０例乙肝患者外周血单个细胞中乙肝病毒复制中间产物ＲＮＡ阳性率为８．３％（５／６０）,其中３０例慢笥肝炎患者阳性率为１３．３％（４／３０）,１５例肝炎肝硬变患者阳性率为６．７％（１／１５）,１５例急性肝炎患者中无１例阳性。认为外周血单个细胞中乙肝病毒复制中间产物与乙肝的慢性化有关,但与临床病情轻重无关。     

外周血单个核细胞中HBV,HCV重叠感染的研究

近年来有较多资料表明乙型肝炎病毒(HBv)和丙型肝炎病毒(H改)能存在于外周血单个核细胞(PBMC)中。HBv不但能存在于该细胞中,而且能在其中复制和表达。HCV可以感染PBMC,但是否能复制还有争议。至于HBv、HCv重叠感染PBMC目前作者尚未见报道,本研究旨在了解PBMc中HBV、Hcv重叠感染的可能性,以及细胞中病毒的检出与血清学标志的关系‘材料与方法 一、病例 70例慢性病毒性肝炎患者选白浙江医科大学附属第一医院和杭州铁路医院传染科住院患者,检测其血清和PBMC中的刊3v、HCv指标。为排除血清污染,同时检测PBMC最后一次洗液。另设…     

慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞丙型肝炎病毒检测及其意义

目的 探讨外周血单个核细胞（ＰＢＭＣｓ）在丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）的感染中的作用。方法 对２２例慢性丙型肝炎患者２１例抗－ＨＣＶ（＋）血液管析患者及１２例健康献血员的ＰＢＭＣｓ分别进行ＨＣＶＲＮＡ,ＨＣＶ抗原检测及电镜观察。结果 （１）２２生丙型肝炎肝炎患者ＰＢＭＣｓ中有７７．３％（１７／２２）ＨＣＶＲＮＡ阳性,（２）感染ＨＣＶ的ＰＢＭＣｓ中电镜下发现复制的ＨＣＶ颗粒;（３）ＨＣＶ颗粒阳笥者的血清和     

慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞中HCV RNA和NS5抗原的检测

目的 研究丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染外周血个核细胞（ＰＢＭＣ）的情况及其意义。方法 运用非核素原位杂交法（ＮＩＳＨ）和抗生蛋白链菌素－生物素法（ＳＡＢＣ）分别检测２０例慢性丙型肝炎患者ＰＢＭＣ中的ＨＣＶ ＲＮＡ和ＮＳ５抗原。结果 ２０例患者中有８例（４０％）,ＰＢＭＣ中ＨＣＶ ＲＮＡ呈阳性,其中６例（３０％）ＰＢＭＣ中ＮＳ５抗原同时呈阳性。ＨＣＶＲＮＡ主要分布于胞浆中,而ＮＳ５抗原还可以出现在胞膜     

慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞丙型肝炎病毒感染研究

目的 以分子生物学、免疫学有电镜等技术对慢性丙型肝炎患者ＰＢＭＣｓ进行综合检测,以证实其受ＨＣＶ感染,并试图在电镜下发现和证实感染细胞内ＨＣＶ颗粒。方法 对逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）和免疫组织化学等技术分别检测患者ＰＢＭＣｓ内的ＨＣＶ ＲＮＡ和ＨＣＶＡｇ,以常规和免疫电镜技术观察研究感染细胞内ＨＣＶ的形态、定位和超微结构。结果 ＨＣＶ ＲＮＡ阳性检出率为７７．２％（１７／２２）,ＨＣＶＡｇ     

乙型肝炎患者外周血单个核细胞端粒酶活性的研究

目的 了解乙型肝炎患者外周血单个核细胞（PBMC）端粒酶活性的表达情况。方法 通过扩增端粒重复序列（TRAP）及光度酶联免疫法，分别检测健康人及各类乙型肝炎患者PBMC的端粒酶水平。结果 各组患者PBMC在植物血凝素（PHA）刺激前均有端粒酶活性的表达，以急性型肝炎组最高，重型肝炎组最低，二者差别具有显著性（P〈0．001）。PHA刺激后与刺激前比较各组端粒酶活性均有显著性升高（P〈0．001），刺激后的端粒酶水平以重型肝炎组为最低，与其他三组比较差别具有显著性（P〈0．05）。慢性重型乙型肝炎经胸腺五肽（TP5）治疗后端粒酶活性显著增高（P〈0．05）。结论 HBV急性感染期PBMC的端粒酶水平升高；慢性感染期PBMC的端粒酶水平在体内被抑制。TP5具有免疫调节作用，能使过低的端粒酶水平趋向于正常。     

慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞及肝组织中HBV cccDNA定量检测

目的优化HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)特异性定量检测方法,并观察HBV cccDNA在慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)及肝组织中的分布情况。方法标本抽提核酸后,以不降解质粒的ATP依赖的DNA酶(PSAD)进行酶切,再以跨双缺口的特异性引物进行荧光PCR定量检测HBV cccDNA;用10份HBV高滴度(10~7拷贝/mL)血清和梯度稀释的HBV克隆质粒标准品,验证此检测方法的特异度和灵敏度;取慢性乙型肝炎患者PBMC和肝组织穿刺标本各50份,检测其总HBV DNA和cccDNA。结果10份血清标本均无假阳性cccDNA检测结果,灵敏度可达到10~3拷贝/mL。所有PBMC中cccDNA检测均阴性;所有肝组织中总HBV DNA和cccDNA检测均阳性,总HBV DNA含量为3．19×10~2～6．69×10~7拷贝/μg人基因组DNA,cccDNA含量为7．32×10~0～6．51×10~6拷贝/μg人基因组DNA,同一患者肝组织中总HBV DNA含量是cccDNA含量的10．7倍至9．2×10~5倍。结论本方法特异度和灵敏度高。PBMC不能支持HBV的复制。在慢性乙型肝炎患者的肝组织中均可检测到cccDNA,但其水平并非与细胞内总HBV DNA水平正相关。     

外周血单个核细胞介导乙型肝炎病毒感染的transwell 小室体外模型研究

目的：观察感染 HBV 的 PBMC 经人绒毛膜癌滋养层细胞（Bewo 细胞）构建的胎盘屏障迁移情况,探讨 PBMC 作为载体转运 HBV 的生物学作用。方法培养并用细胞计数试剂盒-8检测培养 Bewo 细胞和 PBMC 的增殖和活性。用 HBV DNA 含量为5×106拷贝／mL 的乙型肝炎患者血清100μL 感染 PBMC 后,用羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）荧光染料标记感染的细胞, transwell 小室建立 Bewo 细胞和感染 HBV 的 PBMC 共培养模型。用流式细胞仪检测感染 HBV 的PBMC 迁移情况,荧光定量 PCR 法检测 transwell 下室中 PBMC HBV DNA 含量。结果 PBMC、Bewo细胞均在接种24 h 左右开始增殖,120 h 左右开始进入生长停滞期。transwell 小室共培养0、12、24和48 h,下室中绿色荧光标记的 PBMC 量分别为（0．445±0．021）％、（21．180±4．653）％、（34．830±7．156）％和（64．185±3．161）％,随着培养时间的延长,下室中检测到的标有绿色荧光的 PBMC 量越多（F ＝68．983,P ＝0．001）。共培养24、48 h 时,下室 PBMC HBV DNA 分别为（1．925±0．431）×103、（2．565±0．361）×103拷贝／mL,即下室中的 PBMC 发生感染。结论 PBMC可以作为 HBV 肝外感染的靶细胞,利用 transwell 小室构建胎盘滋养层屏障可以为体外研究 HBV 跨胎盘传播提供新思路。     

Detecting the localization of hepatitis B and C viruses in hepatocellular carcinoma by double in situ hybridization

AIM: To detect whether hepatitis B virus (HBV) and hepatitis C virus (HCV) can infect the same host cell. METHODS: We established a method of non-isotope double in situ hybridization by combining a degoxigenin-labeled probe with a biotin-labeled probe, and detected HBV and HCV infections in 10 cases of hepatocellular carcinoma. RESULTS: It was found that HBV and HCV can infect the same host cell, which is a unique biological phenomenon. CONCLUSION: Infections with HBV and HCV might not always follow the rule of “viral interference”, which provides a new clue for investigating the synergistic action of HBV and HCV in the pathogenesis of hepatocellular carcinoma.     

慢性乙型肝炎患者树突状细胞功能与单个核细胞乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的关系

目的 探讨慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血单个核细胞(PBMC)及树突状细胞(DC)内HBV共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)的存在状况,DC成熟度及功能状态与DC或PBMC中HBV cccDNA载量的关系.方法 分离29例CHB患者和10例健康对照者的PBMC,用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CS...     

肝移植患者外周血单个核细胞中HBV DNA检测及临床意义

目的研究乙型肝炎肝硬化终末期患者肝移植后外周血单个核细胞(PBMC)HBV DNA状态及临床意义.方法应用荧光PCR技术检测乙型肝炎肝硬化终末期肝移植术后30例患者血清及PBMC标本HBV DNA,并用细胞计数法和管家基因β-actin标定PBMC HBV DNA,观察PBMC HBV DNA与血清HBV DNA定量关系;观察患者肝移植术后不同时间PBMC HBV DNA水平.30例对照组为肝炎肝硬化失代偿期患者.结果移植后患者19份(63%)PBMC标本HBVDNA阳性,低于对照组(87%,26/30).以Ct值为定量参数,移植后患者PBMC HBV DNA水平显著低于对照组(P=0.02);肝移植术后患者PBMC HBV DNA长期维持于103～104拷贝/106细胞水平,与肝移植后时间无明显关系.移植后患者血清HBV DNA均阴性,而对照组血清阳性率为48%.结论乙型肝炎肝硬化终末期患者肝移植术后,经有效预防HBV再感染治疗后,虽然血清中不能测出HBV DNA,但PBMC中HBV DNA阳性,这可能成为肝外"病毒池",导致供肝再感染;对移植后患者监测PBMC HBV DNA,可能有助于早期诊断HBV再感染或复发.