γδ T细胞分泌IL-17A激活肝星状细胞促进日本血吸虫感染小鼠肝纤维化

目的研究分泌白细胞介素17A (IL-17A)的γδ T细胞对日本血吸虫诱导的早期肝纤维化形成的影响。方法将10只6～8周龄C57BL/6野生型雌性小鼠随机分为健康对照组和野生感染组,每组5只。另5只6～8周龄C57BL/6背景的T细胞抗原受体δ链基因敲除(TCR δ KO)小鼠为TCR δ KO感染组。两个感染组每鼠经腹部贴片法感染日本血吸虫尾蚴(20±2)条,健康对照组不感染。感染后6周,各组小鼠麻醉后脱颈处死,取肝组织研磨后裂解,沉淀部分经密度梯度离心收集肝非实质细胞,采用流式细胞术检测肝非实质细胞中γδT细胞表达的IL-17A含量,采用ELISA检测裂解上清中IL-17A浓度。另取部分肝组织,4%多聚甲醛固定后,行苏木精-伊红(HE)和Masson染色,观察胶原纤维沉积情况。取各组小鼠外周血,ELISA检测血清中IL-17A浓度。体外培养的人肝星状细胞系(LX-2细胞)分为3组,实验组加入终浓度为10 ng/ml的IL-17A,阳性对照组和阴性对照组分别加入终浓度为10 ng/ml的IL-13和等量PBS,荧光定量PCR检测各组LX-2细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原(Col 1) mRNA的相对转录水平。结果流式细胞术检测结果显示,野生感染组小鼠表达IL-17A的Vγ2亚型γδ T细胞百分比为(48.0±1.0)%,高于健康对照组的(17.0±1.6)%(P 0.01)。Masson染色结果显示,TCR δ KO感染组小鼠的胶原沉积面积为(3.5±0.2)×10~4μm~2,小于野生感染组的(6.4±0.5)×10~4μm~2(P 0.01)。ELISA检测结果显示,TCR δ KO感染组小鼠血清和肝组织裂解液上清中的IL-17A浓度分别为(34.0±22.3)和(101.6±18.6) pg/ml,均低于野生感染组的(143.9±33.8)(P 0.05)和(217.2±19.2) pg/ml (P 0.01)。荧光定量PCR检测结果显示,经IL-17A刺激后,实验组LX-2细胞中α-SMA和Col 1 mRNA相对转录水平较阴性对照组分别上调(4.0±0.7)和(8.7±1.2)倍(P 0.05或0.01)。结论分泌IL-17A的γδ T细胞可能参与日本血吸虫感染所致小鼠肝纤维化的进程中,其分泌的IL-17A激活肝星状细胞可能是其加据纤维化的途径。     

LAG3缺陷对多房棘球蚴感染小鼠自然杀伤细胞功能及肝纤维化的影响

目的 探讨淋巴细胞活化基因3(lymphocyte activation gene 3,LAG3)缺陷(LAG3^-/-)对多房棘球蚴感染小鼠自然杀伤(natural killer,NK)细胞功能及肝纤维化的影响。方法 取体质量为(20±2) g的C57BL/6小鼠,分为LAG3^-/-组和野生型(wild type,WT)组,分别经肝门静脉接种3 000个多房棘球蚴原头节。感染后12周,取小鼠肝脏制备肝脏组织切片,天狼星红染色观察肝脏病灶和纤维化程度。分离小鼠肝脏和脾脏淋巴细胞,流式细胞术检测小鼠肝脏和脾脏NK细胞比例,NK细胞表面CD25、CD44和CD69分子表达水平,以及γ干扰素(interferon γ,IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-4、IL-10、IL-17A等相关细胞因子分泌水平。结果 天狼星红染色结果显示,与WT组相比,LAG3^-/-组小鼠肝脏病灶周围炎性细胞带增宽、纤维化结缔组织增生,且呈现较多胶原纤...     

环鸟苷酸腺苷酸促日本血吸虫感染小鼠肝虫卵肉芽肿形成及纤维化

目的 研究第二信使分子环鸟苷酸腺苷酸(c GAMP)对日本血吸虫感染小鼠肝虫卵肉芽肿形成及纤维化的影响,并初步阐明其调控机制。方法 将C57BL/6小鼠随机分为cGAMP处理组(8只)、感染对照组(28只)、感染cGAMP处理组(28只)。cGAMP处理组尾静脉单独注射cGAMP (2μg, 100μl),感染对照组和感染cGAMP处理组经腹部皮肤贴片感染日本血吸虫尾蚴[(20±2)条/鼠]后,分别经尾静脉注射PBS (100μl)和cGAMP (2μg, 100μl),每周1次。3组小鼠各8只分别注射10次,每次注射后观察小鼠死亡情况。感染对照组和感染cGAMP处理组小鼠(各5只)于感染后7周,取小鼠眼眶血,ELISA检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)与天冬氨酸氨基转移酶(AST)的水平;取小鼠肝组织切片进行苏木精-伊红染色(HE)和Masson染色,计算单个虫卵肉芽肿面积和肝纤维化面积,并计数肝组织虫卵数。感染对照组和感染cGAMP处理组小鼠(各15只)于感染后0、 4和7周,取小鼠肝组织,提取总RNA,实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测肝组织β干扰素(IFN-β)编码基因If...     

抗IL-2抗体处理曼氏血吸虫感染鼠减轻肝脏病理学、嗜酸粒细胞增多和选择性抑制T细胞产生IL-5

IL-2在血吸虫病肉芽肿和纤维化形成和调节中作用报道各异。本文通过注射抗IL-2和抗IL-2受体(IL-2R)单抗观察IL-2对虫卵诱导的病理学影响。4～6周龄的C3H/HeV雌性小鼠,经皮肤感染曼氏血吸虫波多黎各株尾蚴50条。5周后,每周皮下注射抗IL-2的S4B6和抗IL-2R的PC61单抗5mg,另3组小鼠注射J1。2或GL113单抗或生理盐水作为对照。感染8周时解剖观察寄生虫和病理学,嗜酸粒细胞计数,IgG1和IgE水平及可溶性虫卵抗原(SEA)或ConA诱生脾细胞产生的细胞因子变化。结果:抗IL-2组鼠(n=10)每鼠成虫对数(条)、组织中和粪便中每对成虫的虫卵数(个)分别为10.9±0.8、6.52±0.45和252±26。抗IL-2R组鼠(n=10)分别为10.3     

细胞外基质蛋白1在多房棘球蚴感染小鼠肝纤维化过程中的作用

目的探讨多房棘球蚴不同感染时间小鼠肝组织细胞外基质蛋白1 (extracellular matrix protein 1,ECM1)的表达水平以及与肝纤维化过程的相关性。方法将40只雌性C57BL/6小鼠随机分为多房棘球蚴感染组和对照组(20只/组),感染组经肝门静脉接种2 000个原头节/鼠,对照组注射等量生理盐水。分别于感染后第1、 6、 12和24周,两组各取5只小鼠采集肝组织,切片后HE染色观察多房棘球蚴感染后小鼠肝组织病理学变化;天狼星红染色以及α-SMA染色检测小鼠肝纤维化程度;免疫组织化学染色检测肝组织中ECM1的表达水平与分布。采用Pearson相关系数法分析ECM1表达水平与肝纤维化水平的相关性。结果 HE染色结果显示,多房棘球蚴感染后6周,小鼠肝组织内可见具有明显生发层结构的病灶形成,周围炎性细胞浸润明显且伴有纤维组织增生。天狼星红染色结果显示,感染组小鼠肝组织内病灶周围胶原沉积面积占比在感染后1、 6、 12和24周分别为(6.97±0.07)%、(10.39±0.02)%、(17.31±1.78)%和(22.24±1.07)%,均高于对照组(P 0.05);α-SMA染色结果显示,感染组肝组织病灶周围α-SMA阳性染色面积占比在感染后1、 6、 12和24周分别为(5.31±0.39)%、(9.97±1.3)%、(16.16±0.17)%和(19.01±0.49)%,均高于对照组(P 0.05);且随着多房棘球蚴感染小鼠时间的延长病灶周围肝纤维化程度不断加重。免疫组化检测结果显示,ECM1主要表达在病灶周围的炎性细胞带中,少量表达在肝窦;感染组ECM1阳性染色面积占比在感染后1、 6、 12和24周分别为(8.60±0.44)%、(13.90±0.57)%、(16.37±0.77)%和(19.50±0.50)%,均高于对照组(P 0.05)。Pearson相关性分析显示,ECM1表达水平与天狼星红阳性染色区域面积(r=0.900, P 0.01)及α-SMA阳性染色区域面积占比(r=0.941, P 0.01)均呈正相关。结论 ECM1在多房棘球蚴不同感染时间小鼠肝组织的表达均较对照组升高,并与肝纤维化程度呈正相关。     

日本血吸虫感染小鼠肠系膜淋巴结Th17细胞的免疫应答

目的观察C57BL/6小鼠感染日本血吸虫后肠系膜淋巴结Th17细胞的免疫应答。方法 20只C57BL/6小鼠随机分为感染组和对照组,每组10只,感染组小鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴,每鼠(40±5)条。感染后5~6周分离小鼠肠系膜淋巴结的淋巴细胞,分别用抗小鼠CD3单克隆抗体(anti-CD3,1μg/ml)和抗小鼠CD28单克隆抗体(anti-CD28,1μg/ml)刺激,培养4 h后收集细胞,RT-PCR检测小鼠肠系膜淋巴结淋巴细胞中白细胞介素17(IL-17)和维甲酸相关孤独受体(ROR-γt)mRNA的转录水平;培养72 h后,ELISA检测细胞培养上清液IL-17和γ干扰素(IFN-γ)的含量。同时用佛波酯(PMA,10 ng/ml)和离子霉素(1μg/ml)刺激淋巴细胞5 h后,胞内细胞因子染色,流式细胞术检测Th17细胞的含量和其他细胞因子的产生。结果 ELISA检测结果显示,感染小鼠肠系膜淋巴结培养物上清液中IFN-γ[(214.3±62.6)pg/ml]和IL-17[(176.8±62.1)pg/ml]的含量明显高于健康小鼠[(46.7±13.9)和0 pg/ml](P<0.05)。RT-PCR检测结果显示,IL-17和ROR-γt mRNA转录水平也明显高于健康小鼠。感染小鼠肠系膜淋巴细胞CD4+T细胞中,Th17细胞的比例为(0.55±0.03)%,明显高于健康小鼠[(0.16±0.01)%](P<0.05)。在CD4+T细胞中,IL-17+IL-4+细胞占0.06%,IL-17+IFN-γ+和IL-17+IL-5+细胞各占0.02%,IL-17+IL-9+细胞占0.01%,未检测到IL-17+IL-10+和IL-17+Foxp3+细胞。结论日本血吸虫感染C57BL/6小鼠的肠系膜淋巴结能诱导Th17细胞产生。Th17细胞能分泌IL-4,及少量的IFN-γ、IL-5和IL-9,不分泌IL-10,也不表达Foxp3。     

可溶性虫卵抗原和成虫抗原刺激日本血吸虫感染小鼠肠系膜淋巴结Th17细胞的免疫应答

目的研究可溶性虫卵抗原(SEA)和可溶性成虫抗原(SWA)刺激日本血吸虫(Schistosoma japonicum)感染小鼠肠系膜淋巴结(MLN)Th17细胞的免疫应答。方法新西兰大白兔2只,经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴(约1 000条/兔),45 d后收集成虫及虫卵,制备SWA和SEA。20只C57BL/6小鼠按随机数字表法随机分为感染组和健康组(10只/组),感染组小鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴,(40±5)条/鼠,感染后5~6周ELISA检测血清中SEA和SWA特异性IgG抗体。分离两组小鼠MLN中的淋巴细胞,均给予4种不同条件刺激:无刺激组(A组),SEA(100μg/ml)+抗-CD28 mAb(1μg/ml)(B组),SWA(100μg/ml)+抗-CD28 mAb(1μg/ml)(C组),抗-CD3 mAb(1μg/ml)+抗-CD28 mAb(1μg/ml)(D组)。培养9 h后,流式细胞仪检测Th17细胞;培养72 h后,ELISA检测细胞培养上清中的白细胞介素(IL-17)和γ干扰素(IFN-γ)。结果 ELISA检测结果显示,感染组小鼠血清SEA、SWA特异性IgG抗体的吸光度(A_(450)值)分别为2.66±0.20和1.68±0.66,高于健康组的0.19±0.05和0.25±0.12(P0.01)。流式细胞术检测结果显示,B组刺激后,感染组淋巴细胞中CD4~+IL-17~+和CD4~+IFN-γ~+细胞分别占0.43%和0.56%,高于健康组的0.05%和0.20%(P0.05);C组刺激后则分别占0.39%和0.76%,高于健康组的0.04%和0.19%(P0.05)。两组小鼠的淋巴细胞体外经SEA(B组)刺激后,感染组淋巴细胞产生的IFN-γ和IL-17分别为(49.13±14.71)和(41.73±2.42)pg/ml,高于健康组的(3.27±0.33)和(9.22±0.58)pg/ml(P0.01);经SWA(C组)刺激后则分别为(46.92±16.73)和(36.14±4.82)pg/ml,高于健康组的(3.38±0.34)和(8.78±0.93)pg/ml(P0.01)。B组的IL-17含量高于C组(P0.05)。结论SEA和SWA能体外诱导日本血吸虫感染C57BL/6小鼠肠系膜淋巴结的淋巴细胞分泌IL-17和IFN-γ,SEA刺激淋巴细胞产生IL-17的含量明显高于SWA;SEA和SWA均能诱导淋巴细胞分化为CD4~+IL-17~+细胞和CD4~+IFN-γ~+细胞。     

伯氏疟原虫对小鼠脾B细胞和自然杀伤细胞及其表面分子的影响

为探讨伯氏疟原虫对小鼠脾B细胞和自然杀伤(NK)细胞及其表面分子的影响,将10只雌性C57BL/6小鼠随机分为健康对照组和感染组,每组5只。感染组小鼠经尾静脉注射伯氏疟原虫(106个/鼠)进行感染,健康对照组注射等量生理盐水。感染后6 d,取小鼠脾,制备单细胞悬液,采用流式细胞术检测小鼠B细胞和NK细胞的含量及其表面分子CD62L、CXCR3、CD69的表达水平。结果显示,感染组小鼠脾B细胞百分比含量为(79.2±3.6)%,高于健康对照组的(54.3±4.4)%(P<0.01);感染组脾NK细胞百分比为(2.2±0.7)%,低于健康对照组的(4.6±0.8)%(P<0.01)。CD62L在感染组B细胞中的百分比为(77.7±4.4)%,高于健康对照组的(72.8±7.1)%,但二者差异无统计学意义(P>0.05);CD62L在感染组NK细胞中的百分比为(61.9±4.8)%,低于健康对照组的(86.6±4.2)%(P<0.01)。CXCR3在感染组B细胞中的百分比为(4.1±0.1)%,高于健康对照组的(3.0±0.2)%(P<0.01);CXCR3在感染组NK细胞中的百分比为(2.1±0.9)%,低于健康对照组的(2.3±0.4)%,但二者差异无统计学意义(P>0.05)。CD69在感染组B细胞和NK细胞中的百分比分别为(54.3±4.7)%、(22.2±1.6)%,均高于健康对照组的(1.9±0.4)%、(1.3±0.3)%(P<0.01)。提示感染疟原虫的小鼠可能通过增加B细胞的数量以及上调其表面分子CXCR3和CD69及NK细胞表面分子CD69的表达水平发挥抗疟作用。     

自然杀伤细胞在小鼠脑型疟中对CD4~+T细胞亚群的免疫调节作用

目的探讨自然杀伤(NK)细胞在小鼠脑型疟中对CD4~+T细胞亚群的免疫调节作用。方法雌性C57BL/6小鼠随机分为健康对照组、感染组与NK消除组,每组14只。感染组与NK消除组小鼠经腹腔内注射伯氏疟原虫ANKA株(Pb A)感染红细胞1×106个;NK消除组小鼠在感染前1 d和感染后2 d腹腔内注射NK细胞封闭抗体anti-Asialo GM-1, 15μl/只,健康对照组和感染组注射等体积的PBS。感染后3 d起,采集小鼠尾静脉血,血涂片检测原虫血症,记录死亡情况。感染后3 d和5 d,各组剖杀小鼠3只,取脾脏,制备脾细胞悬液,流式细胞术检测脾细胞中Th1型细胞和调节性T细胞(Tregs);体外培养脾细胞,48 h后收集上清,ELISA检测γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素10 (IL-10)的水平。感染后6 d,各组取3只小鼠,用伊文思蓝(EB)染液处理后,取脑,体外孵育脑组织,48 h后收集上清,酶标仪检测通过小鼠血脑屏障的EB含量。结果感染组感染后6 d开始出现死亡,并伴有神经症状,8 d全部死亡;NK消除组感染后7 d开始出现死亡,12 d全部死亡。感染后7 d, NK消除组原虫血症为5.2%～10.5%,高于感染组的2.4%～5.0%(P 0.05)。感染后5 d,感染组Th1型细胞的百分率和绝对计数分别为(2.65±0.06)%和(2.09～2.25)×10~6,高于健康对照组[(1.37±0.02)%和(0.41～0.47)×10~6](P 0.01); NK消除组分别为(1.82±0.07)%和(1.48～1.86)×10~6,低于感染组(P 0.01或P 0.05)。感染后3 d和5 d,感染组Tregs的百分率分别为(1.21±0.06)%和(1.70±0.13)%,高于健康对照组[(0.90±0.01)%和(0.91±0.02)%](P 0.01);感染组Tregs的绝对计数分别为(0.63～0.73)×10~6和(1.39～1.62)×10~6,高于健康对照组[(0.27～0.31)×10~6和(0.47～0.56)×10~6](P 0.01); NK消除组Tregs百分率分别为(1.86±0.07)%和(2.15±0.04)%,绝对计数分别为(0.77～0.90)×106和(1.68～2.15)×106,均高于感染组(P 0.01或P 0.05)。感染后3 d和5 d,感染组脾细胞培养上清中的IFN-γ分别为(790.75±84.80)和(989.58±199.59) pg/ml, TNF-α分别为(2 637.47±283.50)和(3 124.58±964.70) pg/ml,均高于健康对照组[(73.69±16.67)和(75.19±15.97) pg/ml、(290.01±187.46)和(290.51±186.76) pg/ml](P 0.01或P 0.05);NK消除组培养上清中的IFN-γ分别为(15.83±4.27)和(266.63±108.62) pg/ml, TNF-α分别为(165.89±71.02)和(842.77±311.94) pg/ml,均低于感染组(P 0.01或P 0.05)。感染后3 d, NK消除组IL-10为(3 588.20±1 436.38) pg/ml,高于感染组[(1 255.77±190.01) pg/ml](P 0.05)。感染后5 d,感染组IL-10为(4 991.36±1 030.89) pg/ml,高于健康对照组[(848.50±501.79) pg/ml](P 0.05); NK消除组为(9 317.95±1 077.89) pg/ml,高于感染组(P 0.05)。感染后6 d,感染组脑组织EB含量为(4.02±0.10)μg/ml,高于健康对照组[(2.09±0.06)μg/ml](P 0.05), NK消除组为(3.14±0.02)μg/ml,低于感染组(P 0.05)。结论NK细胞消除可减弱脑型疟小鼠Th1免疫应答,增强Tregs免疫应答,降低血脑屏障通透性,延长小鼠生存时间。     

多房棘球蚴感染对小鼠肝脾淋巴细胞及其亚群的影响

目的探讨多房棘球蚴感染对C57BL/6小鼠肝和脾淋巴细胞及其亚群的影响。方法 32只C57BL/6小鼠随机分为4组,每组8只,对照组、低数量组(50个原头节/鼠)、中数量组(500个原头节/鼠)、高数量组(2 000个原头节/鼠),实验组取200μl含不同数量多房棘球蚴原头节的混悬液,采用门静脉注射法建立多房棘球蚴感染小鼠模型,对照组注射等量生理盐水。感染后4周,每组各取4只小鼠,取肝脏组织,常规Masson染色,观察病理变化。剩余4只小鼠取肝脏和脾脏,制备肝、脾细胞悬液,流式细胞术检测肝、脾CD3^+T细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞、CD4^+T细胞、CD8^+T细胞、CD4^+CD69^+T细胞、CD8^+CD69^+T细胞绝对数以及初始型CD4^+T (CD4^+Tn)细胞、效应记忆性CD4^+T (CD4^+Tem)细胞、初始型CD8^+T (CD8^+Tn)细胞、效应记忆性CD8^+T(CD8^+Tem)细胞和中心记忆性CD8^+T(CD8^+Tcm)细胞比例的变化。检测数据采用Flow-Jo软件分析,并做流式图。采用Graphad Prism 7.0软件进行作图和统计学分析。结果感染后4周,对照组小鼠肝无明显变化,低、中数量组小鼠肝组织出现急性炎症反应减弱,部分病灶炎性反应逐渐转变为纤维化修复,形成小肉芽肿结节,呈点状或灶状坏死。高数量组小鼠肝内出现小囊泡,可见生发层结构,周围大量炎性细胞浸润。小鼠肝CD3^+T细胞绝对数高、中、低数量组和对照组分别为(4.10±0.04)×10^5、(3.81±0.14)×10^5、(3.02±0.12)×10^5、(2.98±0.03)×10^5,高数量组高于其他3组(P<0.05或0.01)。小鼠脾CD3^+T细胞绝对数高、中、低数量组和对照组分别为(16.01±0.40)×10^5、(11.03±1.21)×10^5、(10.10±1.01)×10^5、(9.71±0.90)×10^5,高数量组高于其他3组(P<0.01)。小鼠肝CD4^+T、CD8^+T细胞和脾B细胞、CD8^+T绝对数高数量组高于其他3组(P<0.05或0.01)。小鼠肝CD4^+CD69^+T细胞绝对数高、中、低数量组和对照组分别为(3.23±0.10)×10^4、(1.98±0.11)×10^4、(1.51±0.26)×10^4、(1.19±0.21)×10^4,高数量组高于其他组(P<0.05)。小鼠脾CD4^+CD69^+T细胞绝对数高、中、低数量组和对照组分别为(10.10±0.41)×10^4、(8.91±0.80)×10^4、(8.20±0.41)×10^4、(6.81±0.50)×10^4,高数量组高于对照组(P<0.01)。肝、脾CD8^+CD69^+T细胞绝对数高数量组高于其他3组(P<0.05或0.01)。小鼠肝CD4^+Tn细胞比例高、中、低数量组和对照组分别为(15.52±1.51)%、(19.3±2.09)%、(20.66±1.28)%、(23.62±2.84)%,对照组高于其他组(P<0.05或0.01)。肝、脾CD8^+Tn细胞比例对照组高于其他组(P<0.05或0.01)。肝、脾CD8^+Tcm细胞比例高数量组高于对照组(P<0.05)。结论高数量多房棘球蚴感染C57BL/6小鼠,肝区域以CD4^+T细胞和CD8^+T细胞募集为主,而脾以B细胞和CD8^+T细胞募集为主。     

抑制Kupffer细胞功能减轻日本血吸虫病肝脏肉芽肿炎症反应北大核心CSCD

目的通过制备氯磷酸二钠脂质体（LE-Cl2MDP）,选择性剔除日本血吸虫感染小鼠模型中Kupffer细胞,研究抑制Kupffer细胞功能对日本血吸虫肝脏肉芽肿形成的影响。方法采用脂质体包裹CL2MDP;6～8周龄雌性BALB/c小鼠分为3组：PBS组,日本血吸虫感染组,日本血吸虫感染联合LE-Cl2BMP组;对于联合组,小鼠尾静脉注射LE-Cl2MDP（0.1mL/10g）,每周2次,连续6周;感染后第12周,剥杀小鼠,留取血清及肝脏,用于细胞因子和免疫组织化学检测等,数据统计分析。结果经过LE-Cl2MDP处理后,日本血吸虫感染肉芽肿周围Kupffer细胞细胞明显减少;无论是感染第8周,还是第12周肝组织中虫卵肉芽肿周围炎症细胞浸润明显减少,纤维化程度减轻;同时降低感染第12周小鼠血清IL-10水平,LE-Cl2MDP组为（42.6±10.4）pg/mL,感染组为（67.4±12.9）pg/mL（P〈0.05）。结论本研究建立LE-Cl2MDP剔除小鼠肝脏Kupffer细胞的日本血吸虫感染模型,抑制了肝组织中虫卵肉芽肿周围炎症反应。     

Th1和Th2型细胞因子对小鼠感染血吸虫的免疫保护性研究

目的 探讨Th1和Th2类细胞因子对小鼠感染血吸虫的免疫保护作用. 方法 C57BL/6小鼠48只,抽签法随机均分为4组,白细胞介素（interleukin,IL）-4组,给予IL-4 （200 ng）; IL-12组,给予IL-12 （200 ng）;胸腺基质淋巴生成素（thymic stromal lymphopoietin,TSLP）组,给予TSLP（200 ng）;生理盐水组,给予生理盐水（200μl）.4组均为腹腔注射,每周3次,持续注射8周.给药后2周,各组小鼠经皮攻击感染日本血吸虫尾蚴（40±2）条/鼠,感染后第3、6周剖杀,计算各组小鼠虫荷数、肝脏卵荷数.芯片检测各组小鼠感染前和感染后不同时间点血清中IL-5、IL-10、γ-干扰素（interferon-γ,IFN-γ）及肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）的动态变化.观察小鼠肝、脾的病理变化. 结果 细胞因子注射的第8周,IL-4组的Th2类细因子IL-5、IL-10依次为161.97、65.47 μg/ml; TSLP组的IL-5、IL-10依次为132.72、77.18 μg/ml; IL-12组的IL-5、IL-10依次为87.15、12.29 μg/ml;生理盐水组的IL-5、IL-10依次为188.92、167.52 μg/ml.IL-4和TSLP组Th2类细胞因子水平均高于IL-12组,但低于生理盐水组.IL-12组IFN-γ、TNF-α依次为165.7、23.64 μg/ml,水平高于其它各组.感染后3周IL-4、IL-12、TSLP、生理盐水组虫荷数依次为（9.50±4.51）、（12.83±2.32）、（6.75±2.87）、（9.80±3.03）条;感染后6周上述各组虫荷数依次为（18.83±5.91）、（24.80±9.42）、（21.67±3.67）、（17.67±6.74）条,每克肝组织虫卵数依次为（58 286.98±25 351.60）、（80 460.18±35 542.66）、（54 579.56±16 399.21）、（41 094.92±25 598.27）.与生理盐水组相比,各实验组虫荷数与每克肝组织虫卵数差异均无统计学意义.感染后第3周,IL-4、IL-12、TSLP、生理盐水组脾指数依次为（0.010±0.002）、（0.011±0.002）、（0.009±0.001）、（0.007 ±0.001）,各实验组与生理盐水组相比,差异均有统计学意义（t=3.158、5.076、6.204,P＜0.05）.感染后第6?     

日本血吸虫表位肽-DNA颗粒性疫苗对小鼠免疫应答的影响

采用已构建的日本血吸虫Sj22.6抗原CTL、Th和B细胞表位肽-DNA颗粒性疫苗(PDDV)及其混合疫苗免疫C57BL/6小鼠。36只小鼠随机均分6组,即18K对照组([K]_(18)-空质粒PDDV)、PBS对照组、C组(C-PDDV)、T组(TPDDV)、B组(B-PDDV)和C-T-B组(C-PDDV、T-PDDV和B-PDDV等量混合),每鼠分别在第0、3和6周麻醉下经尾脊部皮下注射100μl PDDV(含10μg DNA和28μg肽),对照组注射等量的空质粒DNA和[K]_(18)肽或PBS。末次免疫后7d,脱颈处死,制备脾细胞悬液,经日本血吸虫成虫抗原(SWA)刺激后根据~3H标记的胸腺嘧啶核苷(~3H-TdR)检测脾细胞增殖反应,ELISA法检测脾细胞培养上清中γ干扰素(IFN-γ)和白细胞介素-4(IL-4)的含量。ELISA结果显示,T组小鼠脾细胞中IFN-γ的含量[(76.0±11.2)pg/m1],高于PBS[(13.0±2.1)pg/ml]和18K对照组[(14.0±3.2)pg/ml](P<0.01),T组和C-T-B组小鼠脾细胞中IL-4的水平分别为(152.0±21.1)和(8...     

IL-18增强pcDNA3.1/SjOST48抗血吸虫感染的免疫保护性研究

目的探讨白细胞介素18 (IL-18)是否能增强DNA疫苗候选抗原pcDNA3.1/SjOST48对日本血吸虫病感染的免疫保护效果。方法构建pcDNA3.1/SjOST48和pcDNA3.1/IL-18真核载体,表达重组蛋白。Western blotting检测HeLa细胞内重组质粒pcDNA3.1/SjOST48和pcDNA3.1/IL-18表达情况,ELISA检测细胞培养基中IL-18的表达情况。100只雌性BALB/c小鼠随机均分为PBS组(空白对照组)、 pcDNA3.1组(空质粒组)、pcDNA3.1/IL-18组、 pcDNA3.1/SjOST48组和pcDNA3.1/SjOST48+pcDNA3.1/IL-18组等5组,各组小鼠左后腿股四头肌肌内注射相应的重组质粒(30μg),共免疫3次,每次间隔14 d。末次免疫后2周,各组取5只小鼠采集血样,ELISA检测各组小鼠血清IgG抗体及其亚类(IgG1和IgG2a)水平。末次免疫后3周,各组取5只小鼠脾组织,无菌分离小鼠脾淋巴细胞,ELISA检测小鼠脾淋巴细胞上清中TNF-α、 INF-γ、 IL-2、 IL-4、 IL-6和IL-17含量及脾淋巴细胞增殖水平。末次免疫后2周,各组取15只免疫小鼠感染血吸虫尾蚴(20±1)条/鼠。感染后6周处死小鼠,无菌分离肝,计算减卵率;门静脉灌注法收集成虫,计算减虫率;另取肝组织,切片后行HE染色,显微镜下观察肝虫卵肉芽肿数量及炎症浸润情况。结果末次免疫后2周,ELISA结果显示,pcDNA3.1/SjOST48+p cDNA3.1/IL-18组、 pcDNA3.1/SjOST48组、 pcDNA3.1/IL-18组小鼠的IgG抗体水平分别为0.82±0.07、 0.41±0.06、0. 16±0. 05,均高于pcDNA3. 1组的0. 12±0. 03 (P 0. 05); pcDNA3. 1/SjOST48+pcDNA3. 1/IL-18组较pcDNA3. 1/SjOST48组和pcDNA3.1/IL-18组均增高(P 0.05); pcDNA3.1/SjOST48+pcDNA3.1/IL-18组和pcDNA3.1/SjOST48组的IgG2a/IgG1比值分别为4.02±0.01、 2.51±0.01 (P 0.05),均1,其他3组均1。末次免疫后3周,pcDNA3.1/SjOST48+pcDNA3.1/IL-18组小鼠脾淋巴细胞上清中的IL-2、 TNF-α、 INF-γ、 IL-6和IL-17含量分别为(101.82±8.90)、(738.02±146.22)、(593.41±51.07)、(685.64±171.2)、(261.32±48.19)pg/ml,高于pcDNA3.1/SjOST48组[(55.82±9.69)、(538.21±85.26)、(393.41±51.07)、(335.64±62.63)、(118.32±8.91) pg/ml](P 0.05)和pcDNA3.1/IL-18组[(35.16±6.43)、(284.40±69.96)(141.91±24.48)、(198.44±38.15)、(47.66±14.33) pg/ml](P 0.05),三者均高于pcDNA3.1组[(12.91±8.01)、(74.86±6.64)(23.75±6.06)、(82.75±10.96)、(22.91±13.80) pg/ml](P 0.05); IL-4含量为(12.28±7.08) pg/ml,与pcDNA3.1/SjOST48组[(15.03±10.12) pg/ml]、 pcDNA3.1/IL-18组[(13.59±4.42) pg/ml]、 pcDNA3.1组[(16.13±10.08) pg/ml]比较差异无统计学意义(P 0.05)。pcDNA3.1/SjOST48+pcDNA3.1/IL-18组脾淋巴细胞增殖水平为11.84±0.16,高于pcDNA3.1/SjOST48组(5.93±0.25)(P 0.05)和pcDNA3.1/IL-18组(3.19±0.36)(P 0.05),三者均高于pcDNA3.1组(2.08±0.16)(P 0.05)。末次免疫后2周,经日本血吸虫感染后6周,pcDNA3.1/SjOST48+pcDNA3.1/IL-18组小鼠的平均检获成虫数为(14.33±1.08);与pcDNA3.1组比较,减虫率和减卵率分别为46.19%和44.68%,高于pcDNA3.1/SjOST48免疫组(32.18%和35.78%)和pcDNA3.1/IL-18组(13.22%和16.68%)(P 0.05)。各组小鼠肝组织切片HE染色结果显示,与其他4组比较,pcDNA3.1/SjOST48+pcDNA3.1/IL-18组小鼠肝组织虫卵结节较少,虫卵肉芽组织数量明显减少,炎症浸润不明显。结论 IL-18能使pcDNA3.1/SjOST48免疫小鼠诱导较高水平的Th1型和Th17型免疫应答,并且增强其抗血吸虫感染的免疫保护效果。     

Kupffer细胞对日本血吸虫病肉芽肿期CD4~+CD25~+T细胞的影响

目的探讨Kupffer细胞对日本血吸虫病肉芽肿期CD4+CD25+T细胞的影响。方法6～8周龄雌性C57BL/6J小鼠30只分为对照组、感染组与感染/氯化钆组3组,每组10只。感染组和感染/氯化钆组小鼠通过腹部感染尾蚴(10条/只),感染/氯化钆组于感染后第4周经尾静脉注射氯化钆,剂量为每次15mg/kg,每周2次;对照组通过尾静脉注射PBS。感染8周后流式细胞仪检测小鼠CD4+CD25+T细胞数量;免疫组织化学染色检测Foxp3的分布;ELISA检测血清细胞因子IL-4、IL-5、IL-10、TGF-β1与IFN-γ的水平,并进行肝功能检测。结果感染组小鼠CD4+CD25+T细胞数量为13.8%,感染/氯化钆组为9.3%;感染组IL-10为41.4pg/ml,感染/氯化钆组为22.6pg/ml;氯化钆可下调Foxp3的分布、血清丙氨酸氨基转移酶的水平,并减轻血吸虫肉芽肿周围的炎症反应。结论Kupffer细胞通过调控CD4+CD25+T细胞数量而参与日本血吸虫肉芽肿的形成。     

抑制Kupffer细胞功能减轻日本血吸虫病肝脏肉芽肿炎症反应

目的 通过制备氯磷酸二钠脂质体(LE-Cl₂MDP),选择性剔除日本血吸虫感染小鼠模型中Kupffer 细胞,研究抑制Kupffer 细胞功能对日本血吸虫肝脏肉芽肿形成的影响。方法 采用脂质体包裹CL₂MDP;6~8周龄雌性BALB/c小鼠分为3组: PBS组,日本血吸虫感染组,日本血吸虫感染联合LE-Cl₂BMP组;对于联合组,小鼠尾静脉注射LE-Cl₂MDP(0.1 mL/10 g),每周2次,连续6周;感染后第12周,剥杀小鼠,留取血清及肝脏,用于细胞因子和免疫组织化学检测等,数据统计分析。结果 经过LE-Cl₂MDP处理后,日本血吸虫感染肉芽肿周围Kupffer细胞细胞明显减少;无论是感染第8周,还是第12周肝组织中虫卵肉芽肿周围炎症细胞浸润明显减少,纤维化程度减轻;同时降低感染第12周小鼠血清IL-10水平,LE-Cl₂MDP组为(42.6±10.4)pg/mL,感染组为(67.4±12.9)pg/mL(P<0.05)。结论 本研究建立LE-Cl₂MDP剔除小鼠肝脏Kupffer细胞的日本血吸虫感染模型,抑制了肝组织中虫卵肉芽肿周围炎症反应。     

NK细胞在TLR9激动剂CpG抑制肝期约氏疟原虫发育中的作用

目的探讨NK细胞在TLR9激动剂CpG抑制肝期约氏疟原虫发育中的作用。方法小鼠尾静脉注射NK细胞拮抗剂Anti-Asialo-GM1 40μg后48h给予1 000个约氏疟原虫BY265株子孢子攻击,采用Real-time PCR检测肝脏虫荷并血检疟原虫,分析CpG在NK细胞阻断小鼠中对肝期约氏疟原虫发育的影响。结果 NK细胞阻断后GM1+CpG组小鼠肝脏虫荷与CpG组相比显著增加(t=3.539,P<0.01),与PBS对照组相比显著降低(t=3.658,P<0.01);GM1组与PBS对照组比较差异无统计学意义(t=1.768,P>0.05)。CpG组未出现原虫血症,GM1+CpG组出现原虫血症,但出现时间和PBS对照组相比推迟且原虫血症的峰值降低,小鼠逐渐自愈。PBS组和GM1组小鼠从感染第13d开始出现死亡,第15d全部死亡。结论 NK细胞参与对肝期疟原虫的杀伤过程,TLR9激动剂CpG依赖NK细胞杀伤肝期疟原虫。     

婴儿双歧杆菌与秋水仙碱抗小鼠肝纤维化的作用研究

目的研究婴儿双歧杆菌与秋水仙碱抗小鼠肝纤维化的作用。方法将实验小鼠随机分为正常组、模型组、婴儿双歧杆菌组和秋水仙碱组,正常组静脉注射生理盐水,模型组、婴儿双歧杆菌组和秋水仙碱组静脉注射12.5 mg/kg刀豆蛋白溶液,1次/周,每日给予正常组和模型组蒸馏水灌胃给药,婴儿双歧杆菌组给予0.5 g/kg婴儿双歧杆菌溶液灌胃给药,秋水仙碱组给予0.75g/kg秋水仙碱溶液灌胃给药,持续7周后,检测小鼠肝脏重量指数,小鼠血清肝功能生化指标(ALT、AST、ALB)、透明质酸(HA)、Ⅲ型前胶原肽(PCⅢ)的浓度,小鼠肝脏组织Ⅰ型胶原(ColⅠ)、Ⅲ型胶原(ColⅢ)、基质金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)、基质蛋白金属酶-1(MMP-1)、MMP-2、MMP-9、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-6、IL-10的浓度。结果婴儿双歧杆菌与秋水仙碱均能显著降低肝纤维化小鼠的肝脏重量指数(P0.05),改善肝纤维化小鼠血清肝功能生化指标(P0.05),降低肝纤维化小鼠血清HA、PCⅢ浓度(P0.05),降低肝纤维化小鼠肝脏组织ColⅠ、ColⅢ、MMP-2、MMP-9、TIMP-1浓度(P0.05),提高肝纤维化小鼠肝脏组织MMP-1浓度(P0.05),降低肝纤维化小鼠肝脏组织TNF-α、IL-6浓度(P0.05),升高肝纤维化小鼠肝脏组织IL-10浓度(P0.05)。结论婴儿双歧杆菌与秋水仙碱均具有明确的抗小鼠肝纤维化作用,均可应用于治疗小鼠肝脏肝纤维化。     

IFN-γ和IL-4抗卡氏肺孢子虫感染作用的研究

目的研究细胞因子IFN-γ和IL-4的抗卡氏肺孢子虫感染作用.方法分别用IFN-γ或IL-4基因敲除的C57BL/6小鼠(各15只作为动物模型)与未经基因敲除的C57BL/6小鼠(15只作感染对照组),以密切接触的方式,使小鼠自然感染卡氏肺孢子虫;同时设非感染组15只小鼠作阴性对照.分别于3、5和7 wk后观察各组小鼠肺内虫体数量、肺部CD4+、CD8+T细胞反应以及血清中卡氏肺孢子虫特异性IgG抗体滴度.分析基因敲除鼠对卡氏肺孢子虫的易感性.结果IFN-γ基因敲除小鼠肺内虫体数量明显高于IL-4基因敲除小鼠(P＜0.05)和对照组小鼠,而IL-4基因敲除小鼠肺内虫体数量与对照组无显著性差异(P＞0.05).T细胞亚群分析表明,两种基因敲除小鼠的CD4+和CD8+T细胞反应曲线与感染度呈正相关.而IgG抗体滴度,3组接触感染鼠均逐渐呈不同程度上升.结论IFN-γ在小鼠抗卡氏肺孢子虫中起重要作用,但缺少IL-4基因的小鼠对肺孢子虫感染的影响不明显.     

日本血吸虫感染适宜与非适宜宿主的免疫学特征初步研究

目的研究3种不同易感性宿主感染日本血吸虫后免疫应答特征的差异,初步探讨适宜和非适宜鼠类宿主感染血吸虫后免疫应答的机制。方法 C57BL/6小鼠、Sprague Dawley(SD)大鼠和东方田鼠(Microtus fortis)各12只,均随机分为感染组和未感染组,每组6只。C57BL/6小鼠、SD大鼠和东方田鼠的感染组每鼠经腹部皮肤分别感染日本血吸虫尾蚴20、200和1000条。感染后42d,剖杀各组动物,观察门脉系统成虫寄生及肝脏肉芽肿情况。收集血清,ELISA法检测细胞因子白细胞介素10(IL-10)、γ干扰素(IFN-γ)和血清特异性抗体IgG、IgG_(2a)及IgG_1的水平。结果感染日本血吸虫后42d,C57BL/6小鼠和SD大鼠均检获日本血吸虫成虫,并在宿主肝脏发现虫卵肉芽肿,而东方田鼠未检获血吸虫成虫及虫卵,肝脏正常。SD大鼠血清中IL-10的含量[(2.21±0.12)pg/ml]明显高于东方田鼠[(1.64±0.39)pg/ml](P<0.05)和C57BL/6小鼠[(0.10±0.04)pg/ml)](P<0.01),而东方田鼠也显著高于C57BL/6小鼠(P<0.01);SD大鼠血清...