细粒棘球绦虫感染小鼠肝脏髓源抑制性细胞 与调节性T细胞比例动态变化

目的　分析细粒棘球蚴感染小鼠肝脏髓源抑制性细胞（MDSCs）和调节性T（Treg）细胞比例动态变化，探讨其可能的生物学意义。方法　将30只6 周龄雌性BALB/c 小鼠随机分为感染组和对照组，每组15只。感染组每只小鼠腹腔注射细粒棘球绦虫原头节约2 000个，对照组注射等体积生理盐水。感染后3、6、12个月（感染早、中、晚期）收集小鼠肝脏白细胞，采用流式细胞术检测其中MDSCs 及其亚型M?MDSCs、PMN?MDSCs 与Treg细胞比例。结果　感染组小鼠感染后3、6、12个月肝脏白细胞中MDSCs 比例分别为（1.61 ± 0.36）%、（5.68 ± 0.69）%和（16.18 ± 0.69）%，对照组分别为（2.19 ± 0.42）%、（0.99 ± 0.07）%和（4.18 ± 0.84）%，感染后6个月和12个月两组差异均有统计学意义（P均 < 0.01）；感染组小鼠感染3、6、12个月后肝脏白细胞中M?MDSCs 比例分别为（0.69 ± 0.27）%、（5.30 ± 0.72）%和（10.75 ± 0.29）%，对照组分别为（0.42 ± 0.24）%、（0.69 ± 0.02）%和（2.12 ± 0.13）%，感染后6个月和12个月两组差异均有统计学意义（P 均< 0.01）；感染组小鼠感染后3、6、12个月肝脏白细胞中PMN?MDSCs 比例分别为（0.93 ± 0.23）%、（0.32 ± 0.02）%和（5.14 ± 1.03）%，对照组分别为（1.77 ± 0.26）%、（0.28 ± 0.05）%和（1.99 ± 0.90）%，感染后3个月和12个月两组差异均有统计学意义（P均 < 0.05）。感染组小鼠感染后3、6、12个月肝脏白细胞中Treg细胞比例分别为（3.35 ± 0.14）%、（6.24 ± 0.38）%和（3.41 ± 0.07）%，对照组分别为（3.48 ± 0.46）%、（3.65 ± 0.45）%和（3.12 ± 0.12）%，感染后6个月和12个月两组差异均有统计学意义（P均＜0.01）。结论　小鼠感染细粒棘球蚴6个月和12个月后，其肝脏白细胞中MDSCs与Treg细胞比例增加，前者比例变化更加明显，以M?MDSCs为主；以上提示M?MDSCs可能在小鼠感染细粒棘球蚴中后期发挥主要免疫抑制作用。     

细粒棘球绦虫感染小鼠肝脏髓源抑制性细胞 与调节性T细胞比例动态变化

目的　分析细粒棘球蚴感染小鼠肝脏髓源抑制性细胞（MDSCs）和调节性T（Treg）细胞比例动态变化,探讨其可能的生物学意义。方法　将30只6 周龄雌性BALB/c 小鼠随机分为感染组和对照组,每组15只。感染组每只小鼠腹腔注射细粒棘球绦虫原头节约2 000个,对照组注射等体积生理盐水。感染后3、6、12个月（感染早、中、晚期）收集小鼠肝脏白细胞,采用流式细胞术检测其中MDSCs 及其亚型M?MDSCs、PMN?MDSCs 与Treg细胞比例。结果　感染组小鼠感染后3、6、12个月肝脏白细胞中MDSCs 比例分别为（1.61 ± 0.36）%、（5.68 ± 0.69）%和（16.18 ± 0.69）%,对照组分别为（2.19 ± 0.42）%、（0.99 ± 0.07）%和（4.18 ± 0.84）%,感染后6个月和12个月两组差异均有统计学意义（P均 < 0.01）;感染组小鼠感染3、6、12个月后肝脏白细胞中M?MDSCs 比例分别为（0.69 ± 0.27）%、（5.30 ± 0.72）%和（10.75 ± 0.29）%,对照组分别为（0.42 ± 0.24）%、（0.69 ± 0.02）%和（2.12 ± 0.13）%,感染后6个月和12个月两组差异均有统计学意义（P 均< 0.01）;感染组小鼠感染后3、6、12个月肝脏白细胞中PMN?MDSCs 比例分别为（0.93 ± 0.23）%、（0.32 ± 0.02）%和（5.14 ± 1.03）%,对照组分别为（1.77 ± 0.26）%、（0.28 ± 0.05）%和（1.99 ± 0.90）%,感染后3个月和12个月两组差异均有统计学意义（P均 < 0.05）。感染组小鼠感染后3、6、12个月肝脏白细胞中Treg细胞比例分别为（3.35 ± 0.14）%、（6.24 ± 0.38）%和（3.41 ± 0.07）%,对照组分别为（3.48 ± 0.46）%、（3.65 ± 0.45）%和（3.12 ± 0.12）%,感染后6个月和12个月两组差异均有统计学意义（P均＜0.01）。结论　小鼠感染细粒棘球蚴6个月和12个月后,其肝脏白细胞中MDSCs与Treg细胞比例增加,前者比例变化更加明显,以M?MDSCs为主;以上提示M?MDSCs可能在小鼠感染细粒棘球蚴中后期发挥主要免疫抑制作用。     

细粒棘球绦虫原头蚴复合染色方法的探讨

目的 改进染色方法，制作结构清晰、颜色对比鲜明的细粒棘球绦虫原头蚴标本。方法 原头蚴经4％孔雀绿36℃初染48h后，分别用石碳酸复红、稀释石碳酸复红、沙黄、伊红，醋酸洋红，苏木精洋红，盐酸洋红染液复染。结果 经4％孔雀绿初染的原头蚴标本分别用稀释石碳酸复红或沙黄染液复染5s、伊红染液复染30s、洋红染液复染5min均能获得满意效果。染色后原头蚴头钩呈亮绿色，吸盘和其余实质部分着淡红色或浅紫红色，层次分明，立体感强。结论 用孔雀绿初染，用红色染液复染制作原头蚴标本，染色效果好，操作简单，值得推广。     

制作细粒棘球绦虫原头蚴染色标本方法的初探

目的　探索制作结构清晰、颜色鲜明、能长期保存的细粒棘球绦虫原头蚴标本的方法。　方法　孔雀绿染色法 :将原头蚴分别用 1%、2 %和 4 %孔雀绿水溶液 ,在室温或 36℃染色 2 4 h、4 8h和 72 h。　结果　 4 %孔雀绿水溶液 ,36℃ ,染色 4 8h为最佳条件。染色后原头蚴头钩呈亮绿色 ,而吸盘和实质部分无色透明 ,标本的对比性和立体感强。　结论　用孔雀绿染色法制作原头蚴标本在临床诊断和教学中有实用价值。     

细粒棘球绦虫细胞体外培养的研究：Ⅰ细粒棘球蚴生发层细胞分离

本文报道采用胰酶消化的方法分离细粒棘球蚴生发膜细胞的膜结果，在３７℃下１０分钟的效果最好，延长消化时间可使细胞浆破裂，形成较多的裸核，不利于细胞进一步培养。梯度离心的分离方法增加细胞损伤，不能达到分离不同细胞的效果。分离的生发层细胞超微结构与完整生发膜超微切片上基本相同，能表现有线粒体肿胀和数量减少等特点，表明胰酶处理的细胞代谢能力受到一定的抑制。将分离的生发层细胞接种Ｂａｌｂ／ｃ小鼠腹腔可形成棘     

制作细粒棘球绦虫原头蚴染色标本方法的初探

目的 探索制作结构清晰、颜色鲜明、能长期保存的细粒棘球绦虫原头蚴标本的方法。方法 孔雀绿染色法：将原头蚴分别用1％、2％和4％孔雀绿水溶液，在室温或36℃染色24h、48h和72h。结果 4％孔雀绿水溶液，36℃，染色48h为最佳条件。染色后原头蚴头钩呈亮绿色，而吸盘和实质部分无色透明，标本的对比性和立体感强。结论 用孔雀绿染色法制作原头蚴标本在临床诊断和教学中有实用价值。     

细粒棘球蚴原头节miR-71的分泌表达特征分析

目的分析在胰岛素、阿苯达唑和人工胃液刺激下,细粒棘球蚴原头节miR-71的分泌表达特征。方法从新疆屠宰场采集绵羊肝、肺细粒棘球蚴包囊,经固定、包埋及切片后,用miR-71探针进行杂交。与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗Digoxin抗体(Anti-Digoxin-FITC)作用,经4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)核酸染料染色后,在荧光显微镜下观察miR-71在包囊壁和原头节中的定位,分析miR-71在原头节中的分布,确定miR-71在原头节中的表达情况。在人工胃液(人工胃液组)、胰岛素(胰岛素组)或阿苯达唑(阿苯达唑组)等不同条件下培养原头节,收集上清并用差速离心法分离外泌体,采用透射电镜观察外泌体形态结构,利用纳米粒径分析仪测定外泌体的粒径分布;利用外泌体生物标志分子烯醇化酶和14-3-3蛋白的抗体蛋白质免疫印迹(Western blotting)鉴定外泌体;采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测外泌体中miR-71的丰度。结果原位杂交结果显示,miR-71在囊壁生发层和原头节中均有表达。人工胃液组、胰岛素组和阿苯达唑组原头节分泌的外泌体粒径分别为48.9、49.7和65.4 nm,均在40~120 nm内;外泌体形态呈由膜包裹的球形。Western blotting从外泌体中检出烯醇化酶和14-3-3蛋白,表明外泌体提取成功。qPCR结果显示,人工胃液组、胰岛素组和阿苯达唑组原头节分泌的外泌体中,miR-71的表达量分别是其对照组的1.84、1.87和2.38倍(t=12.8、26.7、29.3,均P<0.01)。结论miR-71在细粒棘球蚴囊壁和原头节中广泛表达,且可以通过外泌体进行分泌;经胰岛素、人工胃液和阿苯达唑刺激后其分泌表达水平升高。     

细粒棘球蚴抗原B对小鼠巨噬细胞RAW264.7的极化作用

目的探讨细粒棘球蚴抗原B (AgB)对巨噬细胞极化的调控作用。方法将RAW264.7巨噬细胞培养24 h后,分为M1、 M2、 AgB、 AgB+M1、 AgB+M2和空白对照组（M0组）,每组3孔。待所有巨噬细胞贴壁3 h后,AgB、 AgB+M1、 AgB+M2组均加入羊源细粒棘球蚴囊液提取的天然AgB （终浓度为1 000 ng/ml）,刺激1 h后,M1组和AgB+M1组加入脂多糖（LPS,终浓度为100 ng/ml）和γ干扰素（IFN-γ,终浓度为20 ng/ml）刺激分化20 h;M2组和AgB+M2组加入白细胞介素4 (IL-4)、IL-13 （终浓度均为20 ng/ml）刺激分化20 h;空白对照组不更换培养液,同步培养20 h。显微镜下观察巨噬细胞形态。提取各组巨噬细胞总RNA, RT-PCR检测刺激后巨噬细胞表面标志物精氨酸酶1 (Arg-1)、肿瘤坏死因子α (TNF-α)的mRNA相对转录水平;蛋白质免疫印迹（Western blotting）分析巨噬细胞蛋白Arg-1、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的相对表达量;ELISA检测刺激后巨噬细胞培养上清中IL-10...     

细粒棘球蚴生发细胞体外培养的实验观察

目的 :为培育人源细粒棘球蚴细胞系 (株 ) ,以供用于免疫预防研究。方法 :用外科方法从临床确诊的细粒棘球蚴患者的肝脏中取出包囊 ,以生发层和原头节为培养材料 ,采用RPMI1640、199和改良 DMEM培养液 ,用鼠尾胶原蛋白包被和不包被的培养瓶 ,对其进行初培养 ,并进行对比观察。结果 :以胶原蛋白作为支撑材料 ,应用改良 DMEM培养液培养的人源细粒棘球蚴生发层和原头节效果优于其他 ,已成功地培育了人源细粒棘球蚴细胞系 ,并传至第 2 0代。原代培养时间需 2 8d- 4 5d,3代以内细胞为多形态性。结论 :建立了适合人源细粒棘球蚴细胞体外培养的方法。     

细粒棘球蚴生发细胞体外培养的实验观察

目的 :为培育人源细粒棘球蚴细胞系 (株 ) ,以供用于免疫预防研究。方法 :用外科方法从临床确诊的细粒棘球蚴患者的肝脏中取出包囊 ,以生发层和原头节为培养材料 ,采用RPMI1640、199和改良 DMEM培养液 ,用鼠尾胶原蛋白包被和不包被的培养瓶 ,对其进行初培养 ,并进行对比观察。结果 :以胶原蛋白作为支撑材料 ,应用改良 DMEM培养液培养的人源细粒棘球蚴生发层和原头节效果优于其他 ,已成功地培育了人源细粒棘球蚴细胞系 ,并传至第 2 0代。原代培养时间需 2 8d- 4 5d,3代以内细胞为多形态性。结论 :建立了适合人源细粒棘球蚴细胞体外培养的方法。     

多房棘球蚴源性外泌体对巨噬细胞极化的影响

目的 探究不同时间及浓度多房棘球蚴源性外泌体对巨噬细胞极化的影响。方法 从60只造模BALB/c小鼠中随机选取4只,应用7.0T MRI观察腹腔病灶生长情况;解剖造模小鼠,通过腹腔病灶提取原头节进行体外培养,超速离心法从培养上清中提取外泌体,透射电镜及蛋白质免疫印迹法鉴定外泌体表征。将未加外泌体处理的巨噬细胞单独培养组设为对照组,不同浓度多房棘球蚴来源外泌体与巨噬细胞共培养组设为实验组(10μg/mL组、50μg/mL组),分别共培养48 h和72 h,显微镜下观察巨噬细胞形态变化。通过流式细胞术和酶联免疫吸附实验(ELISA)检测极化状态。符合正态分布的计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。结果 7.0T MRI显示小鼠腹腔内弥漫分布、大小不等的病灶形成;多房棘球蚴源性外泌体直径100 nm左右,呈杯型或茶托型,其表面标志物CD9、TSG101和CD63表达阳性。共培养后,实验组大部分细胞拉长,形态不规则,主要呈多角形;流式细胞术检测发现,共培养48 h,对照组CD16/32、CD206、CD369阳性率分别为(99.53±0.06)%、(90.27...     

刃天青还原法检测细粒棘球绦虫原头蚴总数

目的 建立刃天青还原法体外检测细粒棘球绦虫存活原头蚴总数的实验方法。方法 根据刃天青在活细胞线粒体酶作用下被还原成强荧光物质的原理,将体外培养的原头蚴,用2 mg/mL刃天青染色10 h后,用荧光分光光度计(激发光波长在560 nm,发射长590 nm)测定荧光值,并利用激光扫描共聚焦显微镜形态观察,通过统计学方法建立活原头蚴总数与对应的荧光值之间的数学模型,用于存活原头蚴总数的检测。结果 激光扫描共聚焦显微镜观察发现,死亡的原头蚴经刃天青染色没有荧光,活的原头蚴经刃天青染色发出红色荧光。活原头蚴总数与对应的荧光值呈线性关系,建立直线方程y=0.019x+6.453,在检验中将测得的荧光值(y)带入该公式即可获得活原头蚴总数,此数学模型相关系数r=0.994,P<0.01,说明每个浓度下活原头蚴总数与每个浓度对应的荧光值之间的相关系数r极显著。结论 本研究建立了刃天青还原法体外快速检测细粒棘球绦虫存活原头蚴总数的实验方法,该方法可应用于抗包虫病药物体外筛选,具有避免人为误差、降低人力消耗等优点。     

十种中草药体外抗细粒棘球绦虫原头节的实验研究

本文在体外培养条件下观察了仙鹤草、槟榔、山楂、鹤虱、苦楝皮、骆驼蓬、榧子、使君子、雷丸、南瓜子等１０种中草药对细粒棘球绦虫原头节的杀伤作用。其中骆驼蓬作用最强，在骆驼蓬浓度为０．２％的培养液中４８小时内原头节的校正死亡率达９０％。本文还在体外培养条件下观察到骆驼蓬杀中心有效成分一生物硷可透过棘球蚴囊壁；另用光镜和电镜观察到骆驼蓬作用主要破坏原头节的皮层和膜结构。     

细粒棘球绦虫原头蚴发育调控基因Ral基因的克隆及序列分析

目的克隆和分析细粒棘球绦虫原头蚴发育调控基因Eg Ral基因。方法根据多房棘球绦虫Em Ral基因序列设计引物,用RT-PCR方法从细粒棘球绦虫原头蚴中克隆Eg Ral基因并将其克隆至pMD19-T载体,经测序后,与线虫、多房棘球绦虫、果蝇和人类等物种Ral基因进行比对分析。结果从细粒棘球绦虫原头蚴cDNA中克隆获得Eg Ral基因,长度为603 bp,编码200个氨基酸,等电点为8.85。经比对,Eg Ral与Em Ral同源性为99%,与线虫、果蝇和人等其他种类Ral基因同源性在47.89%～50.72%之间。进化树分析表明Eg Ral与Em Ral相聚集,与其他物种同源性较低。结论成功从细粒棘球绦虫原头蚴中克隆出Eg Ral基因,其序列具有较高的保守性。     

细粒棘球蚴生发层细胞系的建立

目的：为获得能在体外稳定繁殖的细粒棘球蚴细胞系。方法：用研磨法将绵羊源细粒棘球蚴生发层处理得分散的生发细胞，将其在含10％—20％小牛血清的RPMI1640培养基在24孔培养板和包被胶原的24孔细胞培养板上交替培养至14代，随后在常规24孔培养板上连续传代培养；用倒置显微镜观察细胞形态及生长繁殖情况；将培养细胞接种BALB／c小鼠以观察其形成继发性包囊的能力；用ELISA法研究细胞系抗原的免疫学特征。结果：生发层细胞已在体外连续培养75代以上，生长良好；细胞系细胞呈圆形，具有形成合胞体乃至类组织块 的趋势，在4℃冰箱中至少可保存半个月，在液氮中至少可保存10个月；将细胞接种BALB／c小鼠后3个月至7个月，解剖未见细粒棘球蚴包囊生长; 细胞系抗原可和抗生发层体抗原、原头节可溶性抗原、囊液抗原的小鼠血清及人工感染原头节的阳性小鼠血清起反应。结论: 细粒棘球蚴生发层细胞系已经建立。     

过氧化氢体外诱导细粒棘球蚴原头节细胞凋亡的实验观察

目的 探讨过氧化氢（H₂O₂）体外诱导细粒棘球蚴原头节细胞凋亡。 方法 体外培养细粒棘球蚴原头节,实验分为2组,即RPMI 1640组及RPMI 1640添加谷氨酰胺组。分别用不同浓度的H₂O₂诱导,使其发生细胞凋亡。用原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶标记技术（TUNEL 法）检测凋亡细胞;用过氧化物酶标记链酶卵白素（SP）染色-免疫组化法检测半胱天冬氨酸蛋白酶-1（caspase-1）、半胱天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）以及FAS基因蛋白(跨膜蛋白Fas)表达情况。表达产物用二氨基联苯胺（DAB）显色,苏木素复染。TUNEL反应以细胞核黄染者为阳性细胞,caspase-1和caspase-3以细胞浆被染成棕黄色为阳性细胞,Fas以细胞膜和细胞浆被染成棕黄色为阳性细胞,无黄染者为阴性细胞。根据每个原头节中阳性细胞数所占百分比,对原头节阳性表达程度分为4个级别,即原头节中阳性细胞数＜5% 为“-”,5%～25% 为“+”,26%～50%为“++”,＞50%为“+++”。实验重复2次。各组均设空白对照组。 结果 RPMI 1640组,1 mmol/L H₂O₂诱导12 h,查见典型的TUNEL反应阳性细胞;诱导4 h,caspase-1表达86.6%为 “+ ～ ++”,caspase-3 表达77.8%为 “+ ～ ++”;诱导8 h,caspase-1表达 86.6%为 “+ ～ ++”,caspase-3表达 80.0%为 “+ ～ ++”。均比对照组明显增加（P＜0.05）。而5 mmol/L H₂O₂ 诱导4 h,caspase-1表达93.0%为 “++ ～ +++”,caspase-3表达 89.5%为 “+ ～ ++”;诱导8 h,caspase-1表达“++ ～ +++”降为53.2%,caspase-3 表达“+ ～ ++”降为48.4% 且阴性表达为46.8%,降低显著(P＜0.01)。添加谷氨酰胺（终浓度为2 mmol/L）组,5 mmol/L H₂O₂ 诱导8 h,caspase-3 100%为 “++ ～ +++” 高度阳性表达。与平行的RPMI 1640组（caspase-3 表达“++ ～ +++”为32.2%, 且阴性表达为46.8%）相比,变化明显。原头节在对照组和诱导组均可见Fas阳性表达细胞,RPMI 1640组5 mmol/L H₂O₂诱导4 h,“+ ～ ++”表达为53.0%,对照组为20.0%;RPMI 1640添加谷氨酰胺组5 mmol/L H₂O₂诱导8 h,“+ ～ ++”表达为88.7%,对照组为71.4%,诱导后均有所增加（P＜0.05）。 结论 H₂O₂可诱导细粒棘球蚴原头节细胞凋亡。     

内蒙古阿拉善左旗骆驼中细粒棘球蚴感染的调查

阿拉善盟是全国闻名的骆驼之乡 ,位于内蒙古西部 ,西南与甘肃省、东办与宁夏、东与伊克昭盟和巴彦卓尔盟相接 ,北与内蒙古人民共和国毗邻。由阿拉善左旗、阿拉善右旗和额济纳旗组成。境内有巴丹吉林沙漠和腾格里沙漠。人口 15万。主要从事农牧业生产。全盟土地面积的 68%为草场 ,其中 5 8%为可利用草场 ,靠天养畜 ,生产力低下。著名的阿拉善盟双峰驼是当地优势畜种 ,总头数最高曾达 2 5万头 ,占当地大畜总头数的 77% ,1993年曾报道过当地双峰驼中发现细粒棘球蚴感染[1] 。为了进一步查清感染情况 ,于 1998年 11月在阿拉善盟左旗巴彦浩特镇周…     

细粒棘球绦虫合胞体结构与功能的探讨

在１９９０￣１９９７年对细粒棘球绦虫成虫，细粒棘球蚴囊壁，生发囊壁和原头节的超微结构进行了一系列观察。发现合胞体结构不仅是细粒棘球绦虫不同发育阶段皮层的主要结构，而且是成虫和原头节内部器官形成的基础。其主要生理功能是保护虫体，吸收和输送营养物质，参与代谢活动、维持渗透压平衡和虫体稳定，有助于虫体的生长发育和繁殖，对转换宿主完成生活史也十分重要。作认为对细粒棘球绦虫合胞体结构的进一步研究和认识，有     

三株分泌抗细粒棘球蚴囊液抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞的建立和初步鉴定

以羊肝细粒棘球蚴囊液抗原免疫BaLb/c鼠脾细胞与SP2/o骨髓瘤细胞常规方法融合。用人肝棘球蚴囊液抗原间接ELISA法检测,获得3株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,2G_4、2F_1和2F_(10)。对人肝包囊液抗原ELISA的终点分别为1∶204800,1∶819200和1∶3200。对纯化羊肝包囊液抗原致敏羊血球IHA的终点均为1∶512,但3株单抗等量混合后IHA滴度达1∶4096。对猪囊尾蚴抗原的ELISA滴度分别为1∶4000、1∶2000和1∶2000。对泡球蚴抗原ELISA滴度分别为1∶2000、1∶1000和1∶2000。交叉阻断ELISA试验的结果初步显示此3株单抗可能识别不同的抗原表位。3株细胞在液氮中冻存两年复苏后,仍继续稳定分泌抗体。