基于重组酶介导核酸等温扩增反应的曼氏血吸虫 基因检测方法的建立

目的　建立一种可用于曼氏血吸虫特异性基因片段检测的重组酶介导的核酸等温扩增方法（Recombinase?aided amplification, RAA）。方法　以曼氏血吸虫121 bp高重复基因片段作为靶序列,根据RAA反应原理设计、合成引物及荧光探针,建立并优化荧光RAA法反应体系。分别以不同拷贝数的含121 bp基因片段的重组质粒及不同浓度曼氏血吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA法扩增,评价该方法的敏感性;分别以日本和埃及血吸虫虫卵、十二指肠钩虫虫卵、华支睾吸虫囊蚴基因组DNA为模板进行荧光RAA法检测,评价其特异性。结果　建立的荧光RAA法可在39 ℃、20 min内特异性扩增曼氏血吸虫基因组DNA。以重组质粒为模板,荧光RAA法最低可检出的质粒拷贝数为10拷贝/μL;以基因组DNA为模板,荧光RAA法最低可检测浓度为0.1 fg/μL。以日本血吸虫虫卵、埃及血吸虫虫卵、十二指肠钩虫虫卵、华支睾吸虫囊蚴基因组DNA为模板进行荧光RAA法检测,结果均为阴性。结论　成功建立了一种可用于曼氏血吸虫DNA检测的荧光RAA法,该方法反应快捷、操作简便,敏感性和特异性均较好。     

基于重组酶介导等温扩增技术的广州管圆线虫 核酸检测方法的建立

目的　建立一种基于重组酶介导等温扩增技术（RAA）的广州管圆线虫核酸检测方法。方法　选择广州管圆线虫内转录间隔区1（ITS1）基因序列作为靶基因序列,设计、合成并筛选出特异性最强的引物和探针,构建用于广州管圆线虫核酸检测的基础及荧光RAA检测方法。分别以含检测靶基因片段序列的不同拷贝数重组质粒以及不同浓度广州管圆线虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测敏感性;分别以广州管圆线虫、曼氏血吸虫、似蚓蛔线虫、华支睾吸虫、细粒棘球绦虫、十二指肠钩口线虫及小管福寿螺和藁杆双脐螺螺体基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测特异性。结果　成功建立了用于广州管圆线虫核酸检测的荧光RAA法,该方法可在37 ℃ 20 min内对广州管圆线虫特异性DNA片段实现实时扩增。以含靶基因片段序列的不同拷贝数重组质粒和不同浓度广州管圆线虫基因组DNA为模板时,该法最低检出限分别为10拷贝/μL重组质粒和100 pg/μL基因组DNA;以曼氏血吸虫、似蚓蛔线虫、华支睾吸虫、细粒棘球绦虫、十二指肠钩口线虫及小管福寿螺和藁杆双脐螺螺体基因组DNA为模板,检测结果均为阴性。结论　成功建立了一种可用于广州管圆线虫核酸检测的荧光RAA法,其检测简便快速,具备较好的敏感性和特异性。     

基于重组酶聚合酶扩增的曼氏血吸虫核酸可视化检测技术的建立及初步评价

目的 结合重组酶聚合酶扩增技术(RPA)和侧流层析试纸条(LFD)，建立一种快速、便捷的曼氏血吸虫核酸可视化检测方法，并初步评价其检测效能。方法 以曼氏血吸虫细胞色素c氧化酶亚基1(SmCOX1)基因为靶序列，利用Primer Primer 5软件结合手工辅助，设计特异性引物和探针并进行筛选，建立曼氏血吸虫核酸LFD-RPA检测方法。制备不同浓度(1 ng/μl、100 pg/μl、10 pg/μl、1 pg/μl、100 fg/μl、10 fg/μl、1 fg/μl、0.1 fg/μl)的曼氏血吸虫成虫基因组DNA和含有不同拷贝数浓度(10~5、10~4、10~3、10~2、10~1、10~0、10^-1拷贝/μl)的SmCox1重组质粒DNA，评价所建立方法的敏感度。以曼氏血吸虫成虫、日本血吸虫成虫、埃及血吸虫虫卵、感染曼氏血吸虫双脐螺(阳性双脐螺)和阴性双脐螺、感染日本血吸虫钉螺(阳性钉螺)和阴性钉螺、华支睾吸虫成虫、大片形吸虫成虫、卫氏并殖吸虫成虫基因组DNA为模板，评价所建立方法的特异性。将30只雌性BALB/c小鼠随机分为40尾感染组、80尾感染组和健康...     

结合重组酶介导的核酸等温扩增和荧光探针快速检测日本血吸虫基因片段

目的结合重组酶介导的核酸等温扩增(recombinase aided amplification, RAA)和荧光探针方法建立日本血吸虫特异性基因片段的快速检测方法。方法以日本血吸虫G28 (Sj G28)基因片段作为靶序列,应用DNAMAN 7.0软件设计合成引物及荧光探针,建立荧光RAA反应体系。扩增不同拷贝数的Sj G28重组质粒,评价荧光RAA检测的敏感性;分别以日本血吸虫、曼氏血吸虫、细粒棘球绦虫、十二指肠钩口线虫、似蚓蛔线虫、华支睾吸虫基因组为模板进行荧光RAA检测,以评价该方法的特异性。采用荧光RAA分别检测500、 200和50条日本血吸虫尾蚴感染的兔粪中虫卵DNA。分别在50只阴性钉螺中混入1、 2、 3、 4、 5、 10只阳性钉螺,并提取DNA进行荧光RAA检测。结果以不同拷贝数的Sj G28重组质粒为模板进行荧光RAA扩增,在5 min时即可观察到明显的荧光信号,随着拷贝数的不断降低,检测到荧光信号的时间也随之延长,不同拷贝数的扩增均在10 min内完成,最低可检出的质粒浓度为10拷贝/μl。以曼氏血吸虫、细粒棘球绦虫、十二指肠钩口线虫、似蚓蛔线虫及华支睾吸虫基因组DNA为模板的荧光RAA扩增结果均为阴性。不同数量尾蚴感染的兔粪中提取的DNA样品经荧光RAA检测,均能得到有效的扩增,检测可在15 min内完成。含不同数量阳性钉螺的50只阴性钉螺提取的日本血吸虫DNA经荧光RAA检测,均能得到有效的扩增,检测可在10 min内完成。结论本研究建立的可检测日本血吸虫核酸片段的荧光RAA方法,反应快捷,敏感性和特异性均较高。     

荧光定量聚合酶链反应检测输血传播病毒方法的建立及应用

[目的]建立输血传播病毒(transfusion transmitted virus,TTV)荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测方法,为快速、准确地定量检测TTV奠定基础.[方法]根据TTV ORF2区基因序列,设计并合成引物和荧光标记探针.将PCR扩增的TTV的ORF2区基因片段克隆入载体,重组质粒经筛选、鉴定后,作为阳性模板,用于标准曲线的制定和样品检测.[结果]应用重组质粒制作的定量曲线循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系.与定量对照曲线比较计算,10例TTV标本中TTV拷贝数为3.8×105～8.9×1O8拷贝/μl.[结论]检测TTV的FQ-PCR方法较常规PCR技术更为简便、快速、准确,有很好的应用前景和研究价值.     

犬库布病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用北大核心CSCD

目的建立可检测狐狸物种中犬库布病毒(CaKoV)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。方法利用PCR方法扩增狐狸CaKoV的3D基因504bp,将其克隆到pEASY-Blunt载体,构建重组质粒作为阳性质粒,以其为模板建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,验证其灵敏度、特异性和重复性。结果建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法检测目的基因在6.12×10^(1)~6.12×10^(8)拷贝/μl时呈良好的线性关系,相关系数为0.994,斜率为-4.369,灵敏度6.12×10^(1)拷贝/μl。该方法对于CPV、CDV和CCV未出现特异性扩增。所有标准曲线在溶解温度为86.49℃时出现单一的特异峰。使用本方法检测2021年辽宁、山东地区的253份狐狸临床标本,总阳性率为7.91%。结论建立的CaKoV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法敏感、特异,用于狐狸CaKoV感染的快速检测。     

重组酶介导的蓝氏贾第鞭毛虫特异性等温核酸扩增方法的建立及评价

目的　建立基于重组酶介导的等温扩增技术（RAA）的蓝氏贾第鞭毛虫核酸检测方法,并评价其检测敏感性和特异性。方法　选择蓝氏贾第鞭毛虫β?贾第素（β?giardin）基因作为检测靶基因,设计、合成特异性检测引物及荧光探针,建立荧光RAA检测体系。分别以不同拷贝数的重组质粒（含β?giardin基因靶序列）和不同浓度蓝氏贾第鞭毛虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测敏感性;分别以蓝氏贾第鞭毛虫、日本血吸虫、华支睾吸虫、微小隐孢子虫、似蚓蛔线虫、沙门氏菌及志贺氏菌基因组DNA为模板进行扩增,评价其检测特异性。结果　成功建立了蓝氏贾第鞭毛虫荧光RAA检测方法,其可在等温（39 ℃）条件下实现对靶基因片段的快速、特异性扩增（20 min内）。分别以重组质粒和蓝氏贾第鞭毛虫基因组DNA为模板,该方法的检测敏感性可达102拷贝/μL和1 pg/μL;以日本血吸虫、华支睾吸虫、微小隐孢子虫、似蚓蛔线虫、沙门氏菌及志贺氏菌基因组DNA为模板的RAA检测结果均为阴性,具备较好特异性。结论　建立了一种操作简便、敏感、特异的可用于蓝氏贾第鞭毛虫核酸检测的荧光RAA方法。     

重组酶介导的华支睾吸虫特异性核酸等温扩增方法的建立及初步评价

目的　建立一种可用于华支睾吸虫检测的重组酶介导的等温核酸扩增方法（RAA）。方法　以华支睾吸虫18S rRNA基因序列作为靶序列，设计、合成、筛选特异性引物和探针，建立快速检测华支睾吸虫的荧光RAA检测方法。分别以含不同拷贝数DNA片段的重组质粒和不同浓度华支睾吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增，评价其检测敏感性；分别以似蚓蛔线虫、细粒棘球绦虫、日本血吸虫、十二指肠钩虫、曼氏血吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增，评价其检测特异性；通过抽提含华支睾吸虫虫卵的粪便及含囊蚴的淡水鱼肉样本DNA并进行荧光RAA扩增，初步评价其检测现场样本的能力。结果　成功建立了华支睾吸虫检测荧光RAA法，其可在39 ℃ 20 min内实现对华支睾吸虫DNA的特异性扩增。以含不同拷贝数DNA片段的重组质粒为模板，该方法最低检出限为10 拷贝/μL；以不同浓度华支睾吸虫基因组DNA为模板，该方法最低检出限为3 pg/μL；以似蚓蛔线虫、细粒棘球绦虫、日本血吸虫、十二指肠钩蚴及曼氏血吸虫基因组DNA为模板，检测结果均为阴性。该方法可成功检出感染华支睾吸虫的人体、大鼠粪便样本以及麦穗鱼样本，具备较好的现场样本检测能力。结论　成功建立了一种简便、快速、敏感、特异的可用于华支睾吸虫检测的RAA法。     

西尼罗病毒荧光RT-PCR检测方法的建立

目的用TaqMan技术建立荧光RT-PCR方法,用于检测西尼罗病毒(WNV)。方法从GenBank上调取WNV的基因序列,设计WNYA、WNYB、WNYC三套荧光RT-PCR,经优化后用于WNV灭活苗、乙型脑炎病毒(JEV)、黄热病毒(YFV)等11种病毒核酸的检测,同时用10倍倍比稀释的双链DNA、质粒DNA、cDNA、RNA进行扩增,以检测其灵敏度。结果建立的WNYA、WNYC荧光RT-PCR检出WNV灭活苗阳性,而JEV等10种非WNV病毒均为阴性,能检出30个拷贝和65个拷贝的双链DNA、420个拷贝和460个拷贝的质粒DNA;WNYB的反转录效率明显低于WNYA和WNYC。结论建立的WNYA、WNYC荧光RT-PCR可作为检测WNV的技术储备。     

重组酶介导的隐孢子虫属特异性等温核酸扩增 方法的建立及评价

目的　建立一种可用于隐孢子虫检测的重组酶介导的等温核酸扩增（RAA）方法，并对其检测敏感性和特异性进行评价。方法　以隐孢子虫属特异性18S rRNA核酸序列作为检测靶标，采用Amplfix软件设计、合成引物及荧光检测探针，构建并优化RAA荧光反应体系；分别以不同拷贝数的含18S rRNA靶序列的重组质粒、不同浓度隐孢子虫卵囊基因组DNA及不同数量隐孢子虫卵囊基因组DNA为模板进行RAA荧光法检测，以评价其敏感性；分别以隐孢子虫卵囊、蓝氏贾第鞭毛虫包囊、日本血吸虫虫卵、似蚓蛔线虫虫卵、华支睾吸虫虫卵、沙门氏菌、志贺氏菌基因组DNA为模板进行RAA荧光法检测，以评价其特异性。结果　成功建立了隐孢子虫检测RAA法，该方法可在39 ℃、20 min内得到隐孢子虫属18S rRNA基因片段的有效扩增。以不同拷贝数的含18S rRNA靶序列的重组质粒、不同浓度隐孢子虫卵囊基因组DNA及不同数量隐孢子虫卵囊基因组DNA为模板，该方法最低检出限分别为102拷贝/μL、1 pg/μL和1个/50 μL；以蓝氏贾第鞭毛虫包囊、日本血吸虫虫卵、似蚓蛔线虫虫卵、华支睾吸虫虫卵、沙门氏菌、志贺氏菌基因组DNA为模板的荧光RAA扩增结果均为阴性。结论　成功建立了一种可用于检测隐孢子虫卵囊DNA的RAA法，该方法操作简便、反应快速，敏感性和特异性均较好。     

Preliminary study on detection method of MTB DNA by PCR amplification combined with CRISPR-Cas13a system

目的 建立一种聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)联合CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas13a识别靶基因核酸序列对结核分枝杆菌脱氧核糖核酸(Mycobacterium tuberculosis deoxyribonucleic acid,MTB DNA)进行检测的方法。方法 将MTB保守序列IS6110片段插入pMD^TM19-Tsimple Vector克隆载体,构建含待检测靶序列的模拟MTB质粒。同时针对待检测靶序列MTB保守序列IS6110设计可以检测MTB DNA的3条不同的特异性规律成簇间隔短回文重复序列RNA(CRISPR RNA, crRNA)探针(IS6110-1crRNA、IS6110-2crRNA、IS6110-3crRNA),引导CRISPR-Cas13a识别转录产物。将筛选出的特异性crRNA、不同待检测标本的PCR扩增转录产物、Cas13a、crRNA和Background RNA等按比例混合构建PCR-CRISPR反应体系。利用荧光定量PCR仪对含有MTB DNA不同稀释浓度的质粒模板、标准菌株H37Rv及6种非结核分枝杆菌进行检测。通过测定的相对荧光强度值分析检测的敏感度及特异度,最终建立基于MTB CRISPR-Cas13a系统的PCR-CRISPR检测方法。结果 选择相对荧光强度值最大的IS6110-1crRNA[相对荧光强度值为197680.64(98364.94,304271.25)]作为后续MTB DNA 检测的crRNA探针。PCR-CRISPR检测最低拷贝数为10¹拷贝/μl的质粒和10⁰拷贝/μl的H37Rv扩增产物的相对荧光强度值[分别为38655.34(31975.51,45410.32)和17691.50(17612.36,17793.29)]明显高于阴性对照[29989.48(29435.72,30263.20)和13725.83(13652.43,13804.95)](Z=-6.713、-9.448;P值均<0.001),显示敏感度较好;阴性对照[37635.57(37168.74,38199.20)]和戈登分枝杆菌[39351.83(38903.70,39769.53)]、胞内分枝杆菌[39191.30(39018.51,39434.95)]、堪萨斯分枝杆菌[25172.20(24586.95,26046.45)]、脓肿分枝杆菌[37328.03(36959.01,37546.78)]、鸟分枝杆菌[37942.29(37455.63,38401.13)]、偶发分枝杆菌[29491.19(29148.63,30058.62)] 等6种非结核分枝杆菌的相对荧光强度值均明显低于10⁶拷贝/μl的MTB DNA质粒的相对荧光强度值[89204.07(66253.60,108819.13)](Z值均=-9.448,P值均<0.001),显示特异度良好。结论 首次成功建立并验证了针对MTB的PCR-CRISPR检测技术,具有敏感度及特异度高、稳定性好、成本低等特点,有望进一步用于临床样本的检测。     

重组酶介导的华支睾吸虫特异性核酸等温扩增方法的建立及初步评价

目的　建立一种可用于华支睾吸虫检测的重组酶介导的等温核酸扩增方法（RAA）。方法　以华支睾吸虫18S rRNA基因序列作为靶序列,设计、合成、筛选特异性引物和探针,建立快速检测华支睾吸虫的荧光RAA检测方法。分别以含不同拷贝数DNA片段的重组质粒和不同浓度华支睾吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测敏感性;分别以似蚓蛔线虫、细粒棘球绦虫、日本血吸虫、十二指肠钩虫、曼氏血吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测特异性;通过抽提含华支睾吸虫虫卵的粪便及含囊蚴的淡水鱼肉样本DNA并进行荧光RAA扩增,初步评价其检测现场样本的能力。结果　成功建立了华支睾吸虫检测荧光RAA法,其可在39 ℃ 20 min内实现对华支睾吸虫DNA的特异性扩增。以含不同拷贝数DNA片段的重组质粒为模板,该方法最低检出限为10 拷贝/μL;以不同浓度华支睾吸虫基因组DNA为模板,该方法最低检出限为3 pg/μL;以似蚓蛔线虫、细粒棘球绦虫、日本血吸虫、十二指肠钩蚴及曼氏血吸虫基因组DNA为模板,检测结果均为阴性。该方法可成功检出感染华支睾吸虫的人体、大鼠粪便样本以及麦穗鱼样本,具备较好的现场样本检测能力。结论　成功建立了一种简便、快速、敏感、特异的可用于华支睾吸虫检测的RAA法。     

肝组织中β-actin定量检测方法的建立

目的构建检测肝组织中内参基因β-actin的标准品。方法以成人外周血细胞的总RNA为模板、反转录合成cDNA,用该cDNA为模板PCR扩增人β-actin基因相应的cDNA目的片段,以pMD18-T为载体,构建形成重组质粒,电泳、鉴定测序后,用荧光定量PCR制作标准曲线。结果外周血提取的总RNA完整性良好,构建的β-actin质粒经PCR扩增后得到1条285 bp的清晰条带,测序结果与目的片段完全一致,且质粒的原始浓度为5.0×10~(13)拷贝数/mL,倍比稀释至1.0×10~2拷贝数/mL均能得到良好的标准曲线(R~2=0.999)。结论构建β-actin基因荧光定量PCR标准质粒成功。     

基于重组酶介导核酸等温扩增技术的日本血吸虫特异性基因片段核酸试纸条检测方法的建立

目的　结合重组酶介导核酸等温扩增技术（recombinase⁃aided isothermal amplification assay,RAA）和核酸试纸条建立一种快速检测日本血吸虫特异性基因片段的方法。方法　以日本血吸虫SjG28基因片段作为靶序列,设计并合成引物、荧光探针,建立日本血吸虫核酸试纸条检测方法。通过检测不同拷贝数的含SjG28基因片段的重组质粒和不同浓度的日本血吸虫成虫基因组DNA,对该方法敏感性进行评价;通过检测华支睾吸虫、曼氏血吸虫、十二指肠钩口线虫、埃及血吸虫、巴贝斯虫和卫氏并殖吸虫基因组DNA,对该方法特异性进行评价。结果　以重组质粒为模板,建立的日本血吸虫特异性基因片段核酸试纸条检测方法最低检测限为10拷贝/μL;以成虫基因组DNA为模板,最低检测限为1 pg/μL。该方法检测华支睾吸虫、曼氏血吸虫、十二指肠钩口线虫、埃及血吸虫、巴贝斯虫和卫氏并殖吸虫基因组DNA结果均为阴性。结论　本研究结合RAA技术和核酸试纸条建立了一种可快速、简便、可视化检测日本血吸虫特异性基因片段的核酸试纸条法。     

基于无性期18S rDNA特异性引物检测5种疟原虫qPCR的建立和应用

目的建立基于疟原虫无性期(A期)18S rDNA检测感染人的5种疟原虫的qPCR，并评价其检测效果。方法从GenBank中下载5种疟原虫A期、子饱子期(S期)、卵囊期(O期)和人的18S rDNA序列进行比对，划分保守区和变异区，在保守区设计疟原虫属特异性引物，在变异区设计种特异性引物。以5种疟原虫DNA、田鼠巴贝虫和婴儿利什曼原虫DNA为模板进行qPCR扩增，筛选特异性引物对。应用qPCR法筛选特异性引物对的最佳退火延伸温度和引物浓度。分别构建5种原虫A期18S rDNA短片段(筛选出的引物对扩增产物)和长片段(属特异性引物扩增产物)质粒，以连续浓度梯度的短片段质粒DNA[(5×10¹)～(5×10⁸)拷贝/μl]、长片段质粒DNA[(5×10⁴)～(5×10⁹)拷贝/μl]为模板分别进行qPCR扩增，测定筛选出的引物对的扩增效率、最低检出限[包括最低质粒浓度、循环数阈值(Ct值)、变异系数]、无扩增时非目标DNA的最高浓度、可检出的混合DNA中不同虫种间的最大拷贝浓度比值。以5倍稀释的18份疟原...     

Real-time RT-PCR检测西尼罗病毒一步法的建立

目的建立针对西尼罗病毒E基因的一步法Real-time RT-PCR检测方法,用于西尼罗病毒感染样本的快速准确检测和定量。方法针对西尼罗病毒的保守基因E设计引物和探针,建立一步法Real-time RT-PCR反应方法并分析敏感性和特异性。结果本研究建立的一步法Real-time RT-PCR方法可以特异性检测出西尼罗病毒,不与日本脑炎病毒及其他病毒产生交叉反应。该方法的最低检出浓度为3.6×102copies/μl,标准曲线的线性范围为3.6×102～3.6×107copies/μl。结论本研究建立的一步法real-time RT-PCR方法敏感性和特异性较高,且不易出现污染引起的假阳性结果,适合用于西尼罗病毒感染样本的检测。     

基于重组酶介导等温扩增技术的细粒棘球绦虫核酸检测方法的建立

目的　建立一种基于重组酶介导等温扩增技术（RAA）的细粒棘球绦虫核酸检测方法。方法　针对细粒棘球绦虫12S rRNA基因序列片段,设计、筛选并合成RAA特异性扩增引物和荧光检测探针,构建细粒棘球绦虫荧光RAA检测方法。分别以含靶序列的不同拷贝数重组质粒和不同浓度细粒棘球绦虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测灵敏度;分别以细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、日本血吸虫、曼氏血吸虫、十二指肠钩虫、华支睾吸虫、牛带绦虫、曼氏迭宫绦虫、猪带绦虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测特异性。结果　成功建立了细粒棘球绦虫荧光RAA检测法,在39 ℃条件下20 min内可以实现对细粒棘球绦虫基因组DNA特异性扩增,最低可以检测出10拷贝/μL含靶序列的重组质粒DNA和0.1 ng/μL细粒棘球绦虫基因组DNA样本,具备较高敏感性;对多房棘球绦虫、日本血吸虫、曼氏血吸虫、十二指肠钩虫、华支睾吸虫、牛带绦虫、曼氏迭宫绦虫、猪带绦虫基因组DNA均无阳性扩增,具备较高特异性;且该荧光RAA法可成功检出细粒球绦虫包囊中DNA。结论　成功建立了一种快速、灵敏、特异的可用于细粒棘球绦虫核酸检测的荧光RAA法。     

重组酶介导的隐孢子虫属特异性等温核酸扩增 方法的建立及评价

目的　建立一种可用于隐孢子虫检测的重组酶介导的等温核酸扩增（RAA）方法,并对其检测敏感性和特异性进行评价。方法　以隐孢子虫属特异性18S rRNA核酸序列作为检测靶标,采用Amplfix软件设计、合成引物及荧光检测探针,构建并优化RAA荧光反应体系;分别以不同拷贝数的含18S rRNA靶序列的重组质粒、不同浓度隐孢子虫卵囊基因组DNA及不同数量隐孢子虫卵囊基因组DNA为模板进行RAA荧光法检测,以评价其敏感性;分别以隐孢子虫卵囊、蓝氏贾第鞭毛虫包囊、日本血吸虫虫卵、似蚓蛔线虫虫卵、华支睾吸虫虫卵、沙门氏菌、志贺氏菌基因组DNA为模板进行RAA荧光法检测,以评价其特异性。结果　成功建立了隐孢子虫检测RAA法,该方法可在39 ℃、20 min内得到隐孢子虫属18S rRNA基因片段的有效扩增。以不同拷贝数的含18S rRNA靶序列的重组质粒、不同浓度隐孢子虫卵囊基因组DNA及不同数量隐孢子虫卵囊基因组DNA为模板,该方法最低检出限分别为102拷贝/μL、1 pg/μL和1个/50 μL;以蓝氏贾第鞭毛虫包囊、日本血吸虫虫卵、似蚓蛔线虫虫卵、华支睾吸虫虫卵、沙门氏菌、志贺氏菌基因组DNA为模板的荧光RAA扩增结果均为阴性。结论　成功建立了一种可用于检测隐孢子虫卵囊DNA的RAA法,该方法操作简便、反应快速,敏感性和特异性均较好。     

荧光重组酶聚合酶扩增/CRISPR-Cas12a快速检测恶性疟原虫方法的建立与初步评价

目的 建立一种基于重组酶聚合酶扩增(recombinase-aided amplification,RAA)和CRISPR-Cas12a系统的荧光快速检测恶性疟原虫方法,并对其检测效能进行初步评价。方法 选择恶性疟原虫18S核糖体RNA(rRNA)基因为靶序列,设计和合成3组RAA引物及CRISPR来源RNA(crRNA),选择最佳组合并优化反应条件,建立荧光RAA/CRISPRCas12a检测方法。构建包括靶标区的恶性疟原虫3D7株18S rRNA基因质粒,将质粒浓度分别稀释成1 000、100、10、1拷贝数/μL进行荧光RAA/CRISPR-Cas12a反应,评价荧光RAA/CRISPR-Cas12a法检测敏感度;分别以间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫、乙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、梅毒螺旋体基因组DNA为模板,进行荧光RAA/CRISPR-Cas12a反应,评价荧光RAA/CRISPR-Cas12a法检测特异度。分别采用荧光RAA/CRISPR-Cas12a法和巢式PCR法对50份疟疾临床样本进行检测,比较两种方法检测一致性。体外培养恶性疟原虫3D7株,经培养后获得的培养物...     

重组酶介导的日本血吸虫特异性基因片段核酸等温扩增检测方法的建立

目的 建立一种可用于日本血吸虫特异性基因片段检测的重组酶介导的核酸等温扩增方法（RAA）。方法 以日本血吸虫SjG28基因片段作为靶序列,根据RAA反应原理设计合成引物,建立并优化RAA反应体系。应用此方法与聚合酶链式反应（PCR）同时扩增梯度稀释的含不同拷贝数的SjG28基因片段TA克隆质粒及不同浓度的基因组DNA,以评价其敏感性;应用此方法检测曼氏血吸虫、似蚓蛔线虫、十二指肠钩口线虫基因组DNA及健康人血基因组DNA,以评价其特异性。结果 建立的RAA法可特异性扩增日本血吸虫中国大陆株成虫及虫卵基因组DNA,反应可在30 min内完成。以重组质粒为模板,RAA法最低可检出的质粒拷贝数为20个/μL;以基因组DNA为模板,RAA法最低可检测浓度为0.01 ng/μL。建立的RAA法以健康人全血基因组DNA及曼氏血吸虫成虫、似蚓蛔线虫、十二指肠钩口线虫基因组DNA为模板的扩增结果均为阴性。结论 本研究建立了一种反应快捷、敏感性和特异性均较高的RAA方法,其具有应用于日本血吸虫病基因诊断的价值。