双基因干扰对MCF-7细胞基因表达抑制及细胞凋亡影响的研究

背景与目的：肿瘤细胞具有端粒酶高表达及端粒稳定性强两大特点。人端粒酶逆转录酶（hTERT@是端粒酶的催化亚单位,端粒重复序列结合因子2（TRF2@对维持端粒长度及端粒稳定性非常重要。本实验研究针对hTERT和TRF2的特异性RNAi腺病毒表达载体单独和联合转染乳腺癌MCF-7细胞后,对两基因的抑制效率以及对细胞凋亡的影响,探索针对端粒的多基因干扰对乳腺癌基因治疗的可行性。方法：构建RNA干扰腺病毒载体rAd-hTERT和rAd-TRF2,单独和联合转染MCF-7细胞后实时荧光定量PCR检测hTERT和TRF2基因表达情况,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。结果：①转染后48h,与PBS组相比,rAd-hTERT对hTERT基因mRNA的抑制率约86%,对TRF2基因表达无明显抑制（P〉0.05@;rAd-TRF2对TRF2基因mRNA的抑制率约80%,对hTERT基因表达无明显抑制（P〉0.05@;rAd-hTERT/rAd-TRF2联合干扰组对hTERT基因表达抑制率约88%,TRF2基因表达抑制率约85%,联合干扰与单基因干扰相比,对hTERT和TRF2基因的表达抑制差异无显著性（P〉0.05@。②干扰组转染后1～6d均能促进细胞凋亡。单基因干扰组转染后3～5d凋亡最明显,第5天达凋亡高峰;凋亡率rAd-hTERT组为46.2%,rAd-TRF2组为43.5%。联合组转染后第1天凋亡率为46.2%,第2天为68.5%,第3～6天均维持在较高水平,第6天达77.6%。转染后1～6d,联合干扰细胞凋亡率与单基因干扰细胞凋亡率相比,差异均有显著性（P〈0.05@。结论：①rAd-hTERT和rAd-TRF2转染MCF-7细胞48h后可分别显著抑制hTERT和TRF2基因mRNA表达,但rAd-hTERT和rAd-TRF2在抑制hTERT和TRF2基因mRNA表达上无相互协同或相互抑制作用。②rAd-hTERT和rAd-TRF2均能有效促进MCF-7细胞凋亡,且两者联合干扰效果具有累加效应。因此利用联合干扰技术靶向抑制端粒酶活性和端粒稳定性相关的多基因的表达能更高效地促进乳腺癌细胞凋亡,抑制肿瘤细胞的增殖与生长。     

siRNA沉默hTERT基因表达对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的应用小干扰RNA（small interferingRNA，siRNA）抑制乳腺癌MCF-7细胞hTERT的表达，探讨其对乳腺癌细胞增殖和凋亡的效应。方法体外化学合成针对hTERT基因的siRNA序列，在脂质体介导下转染MCF-7细胞，实时定量PCR检测hTERTmRNA表达水平，Westernblot检测hTERT蛋白表达水平，流式细胞仪检测细胞凋亡状况，MTT法检测细胞增殖活性，平板克隆形成实验检测克隆形成率。结果所设计的3对针对不同靶点的siRNA与对照组相比均可有效抑制hTERT的表达，hTERTsiRNA转染MCF-7细胞48h后，siRNAl-siRNA3组hTERTmRNA表达分别为（35．3±4．2）％、（30．7±2．8）％、（31．3±3．6）％，与阴性对照组（96．4±2．8％）相比，差异有统计学意义。MTT结果显示MCF-7细胞增殖能力显著降低，转染48h后，siRNAl～siRNA4细胞抑制率分别为（57．6±3．6）％、（61．3±4．3）％、（65．6±6．3）％和（3．1±4．5）％，细胞克隆形成能力下降，凋亡率明显增加。结论体外化学合成的hTERTsiRNA可以有效地抑制MCF-7细胞hTERT的表达，从而抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。     

siRNA-TRF2对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响

目的 构建表达端粒重复序列结合因子2基因小干扰RNA的腺病毒表达载体（rAd-shRNA-TRF2）,探讨其对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响。方法 根据预实验筛选出的针对人TRF2 mRNA的特异性siRNA靶序列,构建表达siRNA-TRF2的重组腺病毒载体rAd-shRNA-TRF2,转染人乳腺癌MCF-7细胞后,用MTT比色法检测MCF-7细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期分布情况。结果 rAd-shRNA-TRF2转染MCF-7细胞后,MCF-7细胞增殖抑制、细胞周期阻滞于G₀/G₁期、增殖指数显著下降。结论 通过RNAi抑制TRF2基因表达进而抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖的方法有望成为肿瘤基因治疗的一个新策略。     

KAI1基因对乳腺癌细胞体外增殖的抑制作用

目的研究KAI1基因对乳腺癌细胞体外增殖的抑制作用。方法应用脂质体法将pCMV-KAI1质粒转染人高转移性人乳腺癌细胞株MDA-MB-231中,免疫印迹方法检测蛋白表达;利用四甲基偶氮唑盐(MTT)法、平板克隆形成实验、体外黏附及侵袭力实验判断细胞增殖能力及黏附、侵袭力的变化。流式细胞术检测细胞生长周期的变化。结果获得了稳定表达KAI1基因的MDA- MB-231乳腺癌细胞克隆。MTT法显示,转染KAI1基因组的集落形成率(25.33%±2.36%)较转染前(43.17%±2.75%)明显降低(P<0.05)。体外黏附及侵袭力实验表明,转染组的细胞黏附侵袭能力低于未转染组和转染空载体组(P<0.05)。流式细胞术显示,转染KAI1后,G_0/G_1期细胞数量增高,从36.78%±0.61%升高至64.00%±7.56%;G_2/M期数量降低,由17.88%±0.76%降至7.63%±0.60%,差异有统计学意义。结论KAI1基因可以抑制乳腺癌细胞的增殖黏附和侵袭能力,并可能通过调节细胞周期来影响细胞的增殖。     

线粒体融合素基因-2对人乳腺癌MCF-7细胞株增殖与化疗敏感性的影响

背景与目的:线粒体融合素基因-2(mitofusin-2 gene,mfn2)是作用于线粒体外膜的一种增殖抑制基因,mfn2过表达可抑制血管平滑肌细胞的增殖.本研究探讨外源性mfn2对人乳腺癌细胞MCF-7增殖以及化疗敏感性的影响.方法:将含有mfn2 cDNA的质粒在阳离子聚合物的介导下体外转染MCF-7细胞,Western blot法检测绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达,细胞计数及MTT法检测mfn2对MCF-7细胞增殖的影响,流式细胞术检测MCF-7细胞周期分布及喜树碱处理前后细胞凋亡的变化.结果:转染mfn2基因的MCF-7细胞可以稳定高表达GFP.MTT实验提示转染mfn2 cDNA后,MCF-7细胞增殖明显受到抑制,DNA直方图显示细胞停滞于S期,转染mfn2 cDNA组S期细胞比率为(42.7±1.3)%,高于转染空质粒组的(17.2 2.0)%和空白对照组的(19.6±1.7)%(P＜0.05).mfn2基因转染后诱导的细胞凋亡率从(3.6±0.6)%升高到(16.0±0.3)%;加入喜树碱4 h后转染mfn2基因的细胞凋亡率为(69.6 4.3)%,高于转染空质粒组的(31.0±1.8)%和空白对照组的(23.4 2.8)%(P＜0.05).结论:转染mfn2基因可以明显抑制MCF-7细胞的增殖,增强MCF-7细胞对喜树碱的敏感性.     

iRNA沉默Chk1基因对乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响及其作用机制的探讨

目的 探讨siRNA沉默检测点激酶1（Chk1）基因对乳腺癌细胞MCF 7增殖和周期的影响及其作用机制。方法 采用RNAi技术将乳腺癌细胞MCF 7中Chk1基因沉默,用Western blotting检测转染前后MCF 7细胞中Chk1蛋白表达情况;采用MTT比色法和流式细胞术分析Chk1基因沉默对乳腺癌细胞MCF 7增殖和周期的影响。结果 Chk1 siRNA转染后,MCF-7细胞中Chk1蛋白表达下降约82％,明显低于未转染组和脂质体转染组（P＜0.05）。Chk1 siRNA转染组转染48h的MCF-7细胞增殖活性下降,其增殖抑制率为44.7％,明显高于脂质体转染组的5.26% （P＜0.05）。流式细胞仪检测显示,Chk1 siRNA转染组G2／M期比例为（11.3±0.7）％,明显低于未转染组（44.2±1.9）％和脂质体转染组（45.3±2.1）％,差异均有统计学意义（P＜0.05）。 结论 siRNA沉默Chk1基因可明显抑制人乳腺癌细胞MCF-7增殖,并且其抑制增殖作用与减弱G2／M期阻滞有关。     

短发夹RNA沉默促肝细胞再生磷酸酶-3基因表达对乳腺癌MCF-7细胞生长和侵袭能力的影响

目的构建以促肝细胞再生磷酸酶-3（PRL-3）为靶基因的短发夹状小干扰RNA（short hairpin RNA,shRNA）表达载体,并探讨PRL-3-shRNA表达载体对人乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响。方法 构建PRL-3基因特异性shRNA表达载体,使用脂质体法将PRL-3-shRNA表达载体转染入MCF-7细胞。采用Real-ti me PCR和Western blot分别检测转染后MCF-7细胞中PRL-3基因mRNA和蛋白的表达;运用四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）比色法检测转染后MCF-7细胞的增殖水平,用流式细胞仪检测细胞凋亡的情况;采用Transwell小室法检测细胞侵袭力变化。计量资料采用单因素方差分析或重复测量方差分析。结果 酶切鉴定和测序分析证实PRL-3-shRNA表达载体成功构建。转染成功后,shRNA-1~3组PRL-3基因mRNA表达分别为（0.31±0.27）、（0.15±0.14）和（0.31±0.03）,与空白组和阴性组（1.00±0.00、0.98±0.18）相比,差异有统计学意义（P〈0.05）。PRL-3-shRNA-2组PRL-3蛋白的表达量明显低于阴性组和空白组（0.50±0.02比0.91±0.03和0.89±0.02,P〈0.05）;PRL-3-shRNA-2转染入MCF-7细胞后能明显降低其增殖水平（P〈0.05）;PRL-3-shRNA-2组凋亡率明显高于空白组和阴性组[（8.37±1.85）%比（1.60±1.58）%和（0.16±0.05）%,P〈0.05];Transwell小室侵袭实验显示,PRL-3-shRNA-2组穿膜细胞数明显低于阴性组和空白组（P〈0.05）。结论 沉默PRL-3基因表达可抑制MCF-7细胞的增殖,促进凋亡,抑制其侵袭能力     

干扰iASPP基因对转染MCF-7细胞凋亡变化的观察

目的:观察iASPP基因干扰RNA转染乳腺癌细胞MCF-7后的干扰效果及细胞凋亡变化。方法:设计特异性siRNA序列,将序列克隆至PGCsilencerTM H1/Neo/GFP质粒中,用脂质体将重组子转染至MCF-7细胞中,用RT-PCR方法检测i ASPP的表达,蛋白质印迹法检测蛋白表达的变化,流式细胞仪检测细胞凋亡的情况。结果:iASPP干扰质粒转染MCF-7细胞后,iASPP的mRNA表达和蛋白表达减少40%～50%;p53蛋白相对表达量由转染阴性质粒的0.37增加到转染干扰质粒的0.64;细胞凋亡率由原来的17.8%和16.2%分别增加到53.5%和51.3%。结论:抑制内源性i ASPP能有效地恢复乳腺癌细胞MCF-7中p53的抑癌功能,为乳腺癌的治疗提供新的思路。     

碱性成纤维细胞生长因子小分子干扰RNA对胶质瘤细胞株U251增殖与凋亡的影响

背景与目的:碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors,FGFs)家族中的重要一员,bFGF是多功能细胞因子,参与创伤愈合、组织修复、未成熟神经细胞的增殖和分化过程.本课题组前期对bFGF在胶质瘤中的表达做过研究,证实bFGF在胶质瘤细胞中过表达,并刺激胶质瘤细胞的增殖和新生血管生成.本研究检测bFGF小分子干扰RNA对胶质瘤细胞的增殖和凋亡的影响.方法:用化学法合成四条针对bFGF的siRNA和一条阴性对照siRNA,并用脂质体法转染胶质瘤细胞系U251;以Opti-MEM I无血清培养基培养的U251细胞作为正常对照.通过RT-PCR和免疫组化的方法检测bFGF的表达,并用流式细胞术、MTT法检测转染后U251细胞的凋亡和增殖活性的变化.结果:转染48 h后,正常对照、阴性对照、siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3和siRNA-4组U251细胞中的bFGF mRNA水平分别为0.95 0.02、0.95±0.02、0.85 0.02、0.76±0.04、0.65±0.04和0.56±0.03;转染72 h后,分别为0.95±0.04、0.89±0.05、0.81±0.05、0.80±0.05、0.77±0.04和0.53±0.05.四条bFGF siRNA中,siRNA-4作用最显著.转染48 h后,siRNA-4和阴性对照组细胞增殖抑制率分别为(66.4±1.2)%和(56.3±1.4)%;转染72 h后,分别为(40.0±2.6)%和(14.7±0.6)%,siRNA-4与阴性对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05).结论:理想的bFGF小分子干扰RNA 能够抑制该基因的表达并抑制胶质瘤细胞的增殖活性.     

HER2基因转染MCF-7细胞及生物学特性观察

目的:建立共表达HER2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2)基因和ER(Estrogen Receptor)基因的细胞模型,并观察转染细胞的生物学活性.方法:构建真核表达载体pcDNA3.1-HER2,利用脂质体介导将其转染ER阳性的乳腺癌MCF-7细胞,经G418筛选阳性克隆.用RT-PCR、Western blot及免疫细胞化学等方法检测HER2基因在MCF-7细胞中的稳定表达情况,并通过MTT法和肿瘤细胞侵袭实验,观察转染细胞的生物学活性.结果:在mRNA和蛋白水平证实,转染细胞内有HER2基因的高表达,转染后细胞的增殖能力和侵袭能力明显增强.结论:构建含HER2基因的重组载体,导入乳腺癌MCF-7细胞后,获得生物学活性稳定的HER2基因和ER基因高表达的细胞模型,为进一步研究奠定了基础.     

人端粒酶逆转录亚单位(hTERT)基因特异性siRNA对MCF-7细胞生长抑制作用的研究

目的 研究人端粒酶逆转录亚单位（hTERT）特异性siRNA对MCF-7细胞体外生长及体内肿瘤形成能力的抑制作用。方法 设计并化学合成针对hTERT的siRNA，用脂质体转染法将其导入MCF-7细胞内，通过软琼脂克隆形成试验及接种裸鼠的肿瘤形成实验，观察hTERT-siRNA对人乳腺癌MCF-7细胞体外及体内的生长抑制作用。结果 软琼脂克隆形成试验显示，hTERT-siRNA转染的MCF-7细胞克隆形成数量明显少于对照组，抑制率达到84．1％。裸鼠体内实验结果显示，hTERT-siRNA转染组肿瘤生长速度也明显慢于对照组。结论 hTERT-siRNA在体内外均显示可以有效、特异地抑制肿瘤细胞的生长。     

4-氨基吡啶与多西紫杉醇抗人乳腺癌细胞MCF-7 作用及相互关系探讨*

目的:通过研究钾离子通道阻断剂4- 氨基吡啶（4-AP ）对肿瘤化疗药物多西紫杉醇（docetaxel ,DOC ）的抗人乳腺癌细胞MCF-7 作用的影响,探讨4-AP 能否增强DOC 的作用。方法:用MTT 比色法分析DOC 、4-AP 以及两药联合应用对人乳腺癌细胞MCF-7 增殖的影响;用流式细胞术PI 单染法及Annexin V-FITC/PI双染法检测上述两种药物对人乳腺癌细胞MCF-7 的细胞周期及早期凋亡的影响。结果:DOC 能明显抑制人乳腺癌细胞株MCF-7的增殖,并呈剂量和时间依赖性。4-AP 对MCF-7 细胞增殖亦具有一定的抑制作用,在用药后24h、48h 及72h 的抑制率分别为11.9%±1.7% 、42.1%±3.2% 、44.2%±1.6% 。且5mmol/L 4-AP 可使DOC 的作用增强,使25μ mol/L DOC 对人乳腺癌细胞株MCF-7 最大杀伤作用时间从72h 提前至24h。5 μ mol/L DOC 能够使MCF-7 G2/M期细胞比率明显增加（53.58%±1.44% 与对照组8.83%±0.44% 相比,P<0.01）,使G0/G1 期细胞减少（11.48%±0.14% 与对照组63.89%±0.98% 相比,P<0.01）,说明DOC 主要在G2/M期阻滞MCF-7 细胞的增殖。5mmol/L 4-AP 作用于MCF-7 使其G0/G1 期细胞比率增加,G2/M期细胞明显减少,甚至消失（0.42%±0.17% 与对照组8.83%±0.44% 相比,P<0.05）。 而两药联用可见4-AP 使MCF-7 G2/M期细胞比率有所减少,而G0/G1 期细胞比率有所增加。DOC 单独作用于人乳腺癌细胞株MCF-7 细胞24h 后,能明显增加晚期凋亡和死亡率（由6.97%±0.75% 增加到20.77%±0.75% ,P<0.05）;而两药联合时,与对照组相比,早期凋亡比例由4.60%±0.91% 增加到12.20%±0.82%（P<0.05）,晚期凋亡和死亡细胞比例由6.97%±0.75% 增加到58.42%±0.31%（P<0.05）,提示4-AP（5mmol/L ）能明显增加DOC 诱导的MCF-7 早期凋亡。结论:DOC 和4-AP 分别在G2/M期和G0/G1 期抑制MCF-7 细胞增殖,4-AP 通过促进DOC 诱导细胞凋亡发挥抑制MCF-7 细胞增殖的作用。      

Midkine表达水平对人乳腺癌MDA．MB一231细胞转移潜能影响研究

目的：观察中期因子（midkine,MK）基因对人乳腺癌MDA—MB-231细胞增殖、迁移、黏附和侵袭能力的影响。方法：实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测人乳腺癌细胞株MCF-7、Bcap-37和MDA-MB-231中MKmRNA及蛋白表达,筛选出MK表达丰度较高的细胞株。采用脂质体2000将MKshRNA干扰质粒pSilencer-3．1-H1一MK和空载体对照质粒pSilencer-3．1-H1-NC转染到该细胞株,并设未处理对照组。实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测干扰后MK基因和蛋白表达;CCK一8检测细胞增殖能力,与胞外基质蛋白作用30min后检测其黏附能力,Transwell检测细胞侵袭能力和迁移能力。结果：实时荧光定量PCR和蛋白质印迹检测结果显示,MDA—MR231细胞株适合做敲减验证。pSilencer-3．1-H1-MK干扰MDA—MB231细胞MK表达后,MK基因相对表达量为0．384-0．02,低于对照组0．76±0．04和空载体转染组0．84±0．04,F=144．85,P〈0．001;MK蛋白相对表达量为0．39±0．07,低于对照组0．95±0．04和空载体转染组0．99±0．02,F=26．49,P=0．001。CCK-8结果显示,细胞培养24、48和72h,MK基因干扰组细胞增殖能力明显低于低于对照组和空载体转染组,差异有统计学意义,P〈0．05。细胞黏附实验结果显示,与胞外基质蛋白作用30rain后,MK基因干扰组黏附细胞数为（21．87±5．17）％,低于对照组（38．74±4．98）％和空载体转染组（42．37±5．74）％,F=27．60,P〈0．001。Transwell迁移实验中,MK基因干扰组穿越Transwell小室的细胞个数为26．6±6．67,低于对照组（47．0±4．32）和空载体转染组（52．0±6．98）,F：44．98,P〈0．001。侵袭实验中,MK基因干扰组穿越Tr—answell小室的细胞个数为13．2±3．46,低于对照组（19．4±4．43）和空载体转染组（19．9±3．90）,F=8．94,P=0．001。结论：干扰MK的表达可显著抑制人乳腺癌MDA—MB-231细胞体外增殖     

Effect of plasmid-mediated RNA interference targeting telomerase reverse transcriptase on lung cancer cells

In the present study, a plasmid-mediated siRNA interference vector targeting the hTERT gene was constructed and stably transfected into H1299 lung cancer cells. Using real-time quantitative fluorescent PCR technology, western blotting and flow cytometry-based cell cycle profiling, the silencing effect of this vector and its inhibitory effect on proliferation in lung cancer cells were explored. Based upon the results of our previous study, a pair of siRNA sequences was selected, and a DNA template primer was designed and synthesized. After cloning of the template primer into the promoter of the pGenesil-1.1 expression vector, the constructed interference vector was validated using enzyme digestion and gene sequencing. The recombinant interference vector and empty vector were separately transfected into H1299 lung cancer cells with cationic liposomes, and stable monoclonally transfected cells were obtained after selection with G418. After stable transfection, hTERT mRNA and protein expression levels were detected using real-time RT-PCR technology and western blotting. Using the MTT method and a colony formation assay, the growth and proliferation of the stably transfected lung cancer cells were determined. Changes in the cell cycle profile of the stably transfected lung cancer cells were detected using flow cytometry. An interference vector targeting the hTERT gene (pGenesil.1-hTERT) was successfully constructed. Enzyme digestion and gene sequencing confirmed that the sequence insertion met the criteria of the design. After transfection of H1299 cells with pGenesil.1-hTERT or an empty vector, the stably transfected monoclonal cell lines H1299-pGenesil.1-hTERT and H1299-pGenesil.1 were obtained. Compared to the control cells transfected with the empty vector, the H1299-pGenesil.1-hTERT cells had significantly lower mRNA expression of hTERT (93.97±0.83% inhibition, with P<0.001). The protein expression of hTERT in H1299-pGenesil.1-hTERT cells was significantly lower compared to that in H1299-pGenesil.1 cells. The rate of proliferation of H1299-pGenesil.1-hTERT cells was lower compared to that of H1299-pGenesil.1 lung cancer cells. In H1299-pGenesil.1-hTERT cells, the number of cells in the G1 phase increased by 18.3% (P<0.05) compared to the control group; the number of cells in the S and G2 phases decreased by 10.4 and 7.9%, respectively (P<0.05). A recombinant plasmid that interfered with the expression of the hTERT target gene was successfully constructed. Upon transfection of the recombinant interference plasmid into H1299 lung cancer cells, hTERT mRNA and protein expression were down-regulated effectively, telomerase activity and cell proliferation were inhibited, and the cell cycle profile was altered.     

Notch1通路活化抑制EC109细胞的增殖及机制探讨

背景与目的：Notch1的活化可以通过下调人类乳头状瘤病毒（human papillomavirus,HPV）早期蛋白E6和E7基因的表达抑制HPV阳性HeLa细胞系的增殖。人食管鳞状细胞癌细胞系EC109细胞为HPV18阳性细胞。本研究将Notch1胞内段（intracellular domain of Notch,ICN）转入EC109细胞,导致EC109细胞中Notch通路的组成性活化,从而探讨Notch通路活化与EC109细胞增殖的关系及机制。方法：用脂质体转染法将ICN转入体外培养的EC109细胞,用MTT法检测细胞增殖率;用流式细胞仪检测细胞周期;用RT—PCR检测HPV18E6／E7基因的表达;用Western印迹法检测周期蛋白激酶抑制因子p53的表达。结果：ICN转染入EC109细胞后,EC109细胞增殖受抑;细胞周期阻滞在G2／M期,转目的基因组G2／M期细胞所占比例[（42．57&#177;1．57）％]与未转染组[（1．88&#177;0．66）％]及转空质粒组[（1．99&#177;1．02）％]相比差异均有显著性（P〈0．01）。E6／E7基因表达降低;p53表达升高,转ICN组（2．15&#177;0．23）与未转染组（0．45&#177;0．07）及转空质粒组（0．46&#177;0．02）相比差异均有显著性（P〈0．01）。结论：Notch1通路活化可以NNHPV18 E6／E7基因的表达,导致p53通路的活化,使HPV18阳性EC109细胞增殖周期阻滞于G2／M期,抑制EC109细胞的生长。     

新型光敏剂联合阿霉素对乳腺癌细胞增殖及周期的影响

目的:研究新型光敏剂叶绿素衍生物(Chlorophyl derivative4,CPD4),联合阿霉素对人乳腺癌MCF-7细胞增殖及周期的影响,初步探讨联合用药的作用机制,为临床开辟新的治疗方法提供实验依据.方法:以人乳腺癌MCF-7细胞系为研究对象,新型光敏剂和乳腺癌传统化疗药物阿霉素(ADM)联合给药.采用流式细胞仪检测ADM组(2个浓度组分别预处理24小时、48小时)、光动力效应组、联合用药组细胞凋亡率和周期分布:流式细胞仪分析ADM(20ng/mL)预处理24小时、48小时对细胞平均荧光强度的影响以及ADM预处理24小时、48小时后加入CPD4 1.5μg/mL孵育不同时间细胞平均荧光强度的变化.结果:联合用药组细胞凋亡率明显高于单药组,差异有统计学意义(P＜0.01);光动力效应可造成MCF-7细胞G_0/G_1期阻滞,低浓度ADM预处理后GdM期细胞增加,联合用药时G_2/M期细胞升高.ADM预处理MCF-7细胞24小时、48小时细胞平均荧光强度与对照组荧光强度比较差异无统计学意义(P＞0.05);ADM预处理MCF-7后能增加光敏剂CPD4进入细胞的量,在CPD4孵育2小时细胞平均荧光强度最强,且ADM预处理48小时组＞预处理24小时组＞对照组.结论:ADM预处理MCF-7细胞后能够增加光敏剂CPD4进入细胞的量;光动力效应联合ADM具有协同作用.     

RNA干扰乙醛脱氢酶1A1表达对胃癌细胞生物学行为的影响

目的 研究小RNA干扰乙醛脱氢酶1A1基因（ALDH1A1）表达对胃癌细胞生物学行为包括增殖、克隆形成和侵袭能力的影响。方法 构建表达ALDH1A1的siRNA的PGPU6／GFP／Neo-ALDH1A1真核细胞表达载体,转染人胃癌细胞系MKN-45细胞为实验组,同时设阴性对照组和空白对照组,Western blotting检测干扰ALDH1A1基因表达的效果。MTT法、克隆形成实验、Transwell 小室侵袭实验检测ALDH1A1表达下降后MKN-45细胞增殖、克隆形成和侵袭能力的情况。结果 Western blotting检测显示实验组MKN-45细胞ALDH1A1蛋白表达低于阴性对照组（0.36±0.04 vs. 0.72±0.08,P＜0.05）;MTT法显示实验组MKN-45细胞的增殖抑制率高于阴性对照组［（52.56±1.81）％ vs.（30.32±2.23）％,P＜0.05］;克隆形成实验显示实验组MKN-45细胞的克隆形成能力低于阴性对照组（21.67±2.00 vs. 36.78±3.53,P＜0.05）;Transwell 小室侵袭实验显示实验组胃癌细胞的侵袭能力低于阴性对照组（55.11±7.98 vs. 84.78±6.00,P＜0.05）。结论 通过RNA干扰技术可明显下调ALDH1A1蛋白在MKN-45细胞中表达,并抑制肿瘤细胞的增殖、克隆形成和侵袭能力。ALDH1A1有望成为胃癌治疗的一个新的靶点。     

siRNA抑制HER2/neu过表达肺腺癌细胞生长和增殖

背景与目的：30％NSCLC存在HER2／neu过表达，与肿瘤发生、转移、肿瘤血管形成、抗凋亡及化疗耐药等有关。本文通过RNA干涉抑制肺腺癌细胞SPC—A-1 HER2／neu过表达，观察肿瘤细胞周期、增殖及集落形成能力的变化。方法：构建针对HER2／neu的siRNA重组质粒，稳定转染SPC—A-1，通过RT—PCR和Western Blot检测HER2／neu表达；FCM分析细胞周期；MTT法观察细胞增殖，绘制细胞生长曲线；平板集落形成实验检测肿瘤细胞的集落形成能力。结果：成功构建了HER2／neu的siRNA重组质粒，稳定转染靶细胞后可显著降低HER2／neu表达；与亲代细胞相比，G0／G1期细胞增加17．1％，S期细胞减少12．8％；细胞生长速度减慢，集落S1抑制率达到49．0％。结论：针对HER2／neu的siRNA可以显著降低肺腺癌细胞过表达HER2／neu，肿瘤细胞阻滞于G0／G1期，造成细胞增殖减慢，集落形成能力明显下降。因此，siRNA对过表达HER2／neu肺癌的治疗具有潜在应用价值。     

抑制CC类趋化因子配体5基因表达对乳腺癌细胞增殖能力的影响

目的 探讨抑制CC类趋化因子配体5(CCL5)基因表达对人乳腺癌细胞增殖能力的影响.方法 用特异性CCL5 RNA干扰(RNAi)序列慢病毒载体感染人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231,分别为KD1组和KD2组;另在MCF-7和MDA-MB-231细胞中分设阴性病毒载体感染的阴性对照组(NC1组和NC2组)和未感染组(CON1组和CON2组).采用实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染病毒后乳腺癌细胞中CCL5的表达,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法和流式细胞术(FACS)分析细胞的增殖情况,平板克隆形成实验观察细胞的克隆形成能力.结果 CCL5 RNAi慢病毒可显著降低MCF-7和MDA-MB-231细胞中CCL5基因的表达.MTF法检测结果显示,在不同的培养时间,MCF-7和MDA-MB-231细胞的KD组、NC组与CON组细胞培养上清A值差异均无统计学意义(均P＞0.05).FACS分析结果显示,KD1组、NC1组和CON1组的增殖指数(PI)值分别为0.48±0.03、0.43±0.01和0.45±0.02;KD2组、NC2组和CON2组的PI值分别为0.48±0.02、0.44±0.05和0.47±0.02(两两比较,均P＞0.05).荧光显微镜下观察显示,KD组的克隆体积及每克隆的细胞数明显小于NC组和CON组.KD1组和KD2组克降数目(0.34±0.08和0.33±0.10)明显少于NC1组(0.81±0.12)、NC2组(0.97±0.09)、CON1组(0.92±0.12)和CON2组(1.04±0.07),差异有统计学意义(P＜0.05).结论 CCL5基因的表达下调对乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞群体倍增时间无明显影响,但可显著降低细胞的克隆形成能力,从而使肿瘤细胞的恶性增殖受到抑制.

Abstract：

Objective To investigate the effect of suppression of CCI5 ligand gene on the proliferation of human breast cancer cells. Methods A lentiviral vector carrying a short interfering RNA (siRNA) targeting CCL5 was transfected into human breast cancer cell line MCF-7 and MDA-MB-231 cells.The expression of CCL5 mRNA in the cells was detected by real-time PCR. The proliferation of MCF-7 and MDA-MB-231 cells was assessed by MTT assay and FACS assay, and the colony formation ability of both cell lines were measured, respectively. Results Real time PCR showed a good knockdown effect of CCL5 in both cell-lines. Colony-forming assay showed that the ability of colony formation of MCF-7/CCL5-siRNA and MDA-MB-231/CCL5-siRNA was decreased markedly. The colony number of MCF-7/CCL5-siRNA group was (0. 34 ± 0. 08), significantly lower than 0. 81 ± 0. 12 in the MCF-7/CCL5-N group and 0.92 ± 0.12 in the MCF-7 group (P ＜ 0. 05). The colony number of MDA-MB-231/CCL5-siRNA group was 0. 33 ± 0. 10,significantly lower than 0.97 ±0.09 in the MDA-MB-231/CCL5-N group and 1.04 ±0.07 in the MDA-MB-231 group (P ＜0.05). However, MTT assay revealed that the proliferation of MCF-7/CCL5-siRNA cells was not significantly different from that of MCF-7/CCL5-N or MCF-7 cells, respectively (P ＞0.05), and the same result was found in MDA-MB-231 cells. FACS assay showed that the proliferation index (PI) of groups MCF-7/CCL5-siRNA, MCF-7/CCL5-N and MCF-7 were 0.48 ± 0. 03, 0. 43 ± 0. 01 and 0.45 ±0. 02. The PI of groups MDA-MB-231/CCL5-siRNA, MDA-MB-231/CCL5-N and MDA-MB-231 cells were 0. 48 ± 0.02, 0.44 ± 0.05 and 0. 47 ± 0. 02. There was no statistical difference among them ( P ＞ 0.05 ).Conclusion The down-regulation of CCL5 gene in human breast cancer cells may significantly suppress their colony formation ability, rather than affecting their population doubling time to some extent.