人端粒重复序列结合因子cDNA全长克隆及在大肠杆菌中的高效表达

端粒和端粒酶表达以及调控研究是当前国际上关于肿瘤和白血病发生、发展机理研究中非常活跃的领域。人端粒重复序列结合因子 (ｈＴＲＦ1)是 1995年新发现的ＤＮＡ结合蛋白 ,在人端粒重复序列稳定性及端粒酶活性中起重要调节作用[1] 。但是其中的机制还不清楚。迄今尚未见抗ｈＴＲＦ1单克隆抗体的报道 ,也未见ｈＴＲＦ1与白血病和其他恶性肿瘤相互关系的报道。我们克隆并表达ｈＴＲＦ1,旨在制备抗ｈＴＲＦ1特异性抗体 ,以进一步研究ｈＴＲＦ1作用机理和ｈＴＲＦ1与恶性肿瘤的发生、发展的相互关系。一、材料与方法1 引物设计 :根据人ＴＲＦ1…     

人端粒酶逆转录亚单位(hTERT)基因特异性siRNA对MCF-7细胞生长抑制作用的研究

目的 研究人端粒酶逆转录亚单位（hTERT）特异性siRNA对MCF-7细胞体外生长及体内肿瘤形成能力的抑制作用。方法 设计并化学合成针对hTERT的siRNA，用脂质体转染法将其导入MCF-7细胞内，通过软琼脂克隆形成试验及接种裸鼠的肿瘤形成实验，观察hTERT-siRNA对人乳腺癌MCF-7细胞体外及体内的生长抑制作用。结果 软琼脂克隆形成试验显示，hTERT-siRNA转染的MCF-7细胞克隆形成数量明显少于对照组，抑制率达到84．1％。裸鼠体内实验结果显示，hTERT-siRNA转染组肿瘤生长速度也明显慢于对照组。结论 hTERT-siRNA在体内外均显示可以有效、特异地抑制肿瘤细胞的生长。     

bcl-2及RNA干扰对人端粒酶逆转录酶的调节效应

近年来,恶性肿瘤的发生呈上升的趋势,由于端粒酶在85%以上的肿瘤细胞和组织中高度表达,而在正常细胞中几乎不表达,因而是较理想的抗肿瘤靶标[1].     

人端粒酶逆转录酶(hTERT)特异性siRNA对乳腺癌细胞hTERT水平及细胞生长影响的研究

背景与目的:在肿瘤细胞中端粒酶高水平的表达是肿瘤细胞永生化的重要因素。本研究利用人端粒酶逆转录酶(hTERT)的小干扰RNA(siRNA)特异性地抑制乳腺癌细胞的hTERT,通过研究该效应对细胞生长、凋亡和永生化相关基因的影响,来进一步阐述端粒酶在肿瘤细胞永生化可能的作用。方法:通过实时定量RT-PCR(Real-TimeRT-PCR)测定各乳腺癌细胞系中内源性hTERT的表达水平及测定RNA干扰对与细胞永生化相关基因的调节;通过脂质体转染法将hTERTsiRNA导入MCF7细胞;通过细胞生长曲线和流式细胞仪(FACS)评价该特异性的siRNA所诱导的hTERT水平下调对细胞生长和凋亡的影响。结果:所检测的乳腺癌细胞系中,hTERT均相对高表达。hTERTsiRNA可抑制MCF7中hTERT的水平,并在抑制后的第4天开始表现出显著的细胞生长抑制,并出现凋亡,以及多个细胞永生化相关的基因,如RAC1、PCYT2、FDFT1和ATP5G2,表达水平均下调50%以上。结论:hTERTsiRNA可特异性地抑制hTERTmRNA水平,从而抑制细胞生长,导致细胞凋亡,并下调多个细胞永生化基因。     

RNA干扰抑制Hep-2细胞人端粒酶逆转录酶基因表达对放射敏感性的影响

目的构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因特异性短发夹样RNA(shRNA)真核表达载体,观察其联合射线对人喉癌Hep-2细胞端粒酶活性和细胞存活的影响,研究hTERT基因在放射增敏中的作用。方法根据hTERT mRNA编码序列设计RNA干扰(RNAi)靶点,构建重组表达质粒pshRNA-hTERT,构建成功后,转染Hep-2细胞并作射线处理,用端粒重复序列扩增方法(TRAP-PCR- EHSA)检测端粒酶活性的动态变化,采用克隆形成分析方法观察质粒pshRNA-hTERT对Hep-2细胞放射敏感性的影响,计算放射增敏比SER_(SF2)。结果转染质粒pshRNA-hTERT后,Hep-2细胞的hTERT mRNA表达抑制率为60.8%,质粒pshRNA-hTERT不仅能够抑制Hep-2细胞的端粒酶活性(P<0.05),而且还可以抑制辐射诱导的端粒酶活性上升(P<0.05)。照射前经pshRNA-hTERT处理24h,明显降低了2Gy照射后Hep-2细胞的存活分数(85.7%),与单纯放射组(67.7%)相比,差异有统计学意义(P<0.05),pshRNA-hTERT的放射增敏比SER~(SF2)为1.27。结论RNAi显著抑制了靶基因hTERT的表达,质粒pshRNA-hTERT能明显抑制2Gy照射诱导的Hep-2细胞端粒酶活性升高,并显著提高其体外放射敏感性;质粒pshRNA-hTERT的放射增敏作用可能与端粒酶活性受抑制有关。     

端粒酶逆转录酶小干扰RNA对结肠癌SW480细胞体外抑制作用的观察

目的:探讨RNA干扰(RNAi)对结肠癌SW480细胞人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的抑制效应。方法:化学合成靶向于hTERT基因的4个小分子干扰RNA(siRNA)序列,用阳离子脂质体为载体转染SW480细胞,分为siRNA1～4、siRNA阴性对照和空白对照6组。通过RT-PCR和蛋白质印迹法分别检测结肠癌细胞转染后细胞hTERT mRNA和蛋白水平,并用MTS法检测细胞生长增殖。结果:siRNA1～4组hTERT mRNA相对表达量分别为0.54±0.18、0.56±0.19、0.46±0.10和0.84±0.18,端粒酶相对活性分别为0.57±0.18、0.56±0.19、0.09±0.08和0.70±0.19,siRNA1～4组hTERT蛋白相对表达量分别为0.41±0.18、0.45±0.17、0.08±0.07和0.82±0.16,其中siR-NA1～3组的hTERT mRNA表达量、端粒酶活性和蛋白表达量与空白对照组的差异有统计学意义,P<0.05。SW480细胞在转染后48h时的细胞增长平均抑制率分别为42.14%、39.12%、48.05%和35.85%。提示不同siRNA序列对SW4...     

反义端粒酶RNA对人胃癌细胞端粒长度及端粒酶活性调控的研究

 目的　探讨反义端粒酶RNA(hTR)对人胃癌细胞 端粒长度(TRF)及端粒酶活性的调控作 用。方法　应用反义hTR真核表达载体经脂质体介导转染胃癌细胞SGC7901 ,通过分子杂交及端粒重复扩增PCR方法检测hTR表达及端粒、端粒酶活性变化。结 果　经HYR筛选,转染细胞形成稳定克隆,反义hTR表达增强、正义hTR表达下调,平 均TRF缩短、端粒酶活性受抑。结论　反义hTR对胃癌细胞TRF及端粒酶活性 的调控可能是通过其对hTR模板的“封闭”而发挥作用的,反义hTR可以作为胃癌基因治疗的 一种新靶点。     

双基因干扰对MCF-7细胞基因表达抑制及细胞凋亡影响的研究

背景与目的：肿瘤细胞具有端粒酶高表达及端粒稳定性强两大特点。人端粒酶逆转录酶（hTERT@是端粒酶的催化亚单位,端粒重复序列结合因子2（TRF2@对维持端粒长度及端粒稳定性非常重要。本实验研究针对hTERT和TRF2的特异性RNAi腺病毒表达载体单独和联合转染乳腺癌MCF-7细胞后,对两基因的抑制效率以及对细胞凋亡的影响,探索针对端粒的多基因干扰对乳腺癌基因治疗的可行性。方法：构建RNA干扰腺病毒载体rAd-hTERT和rAd-TRF2,单独和联合转染MCF-7细胞后实时荧光定量PCR检测hTERT和TRF2基因表达情况,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。结果：①转染后48h,与PBS组相比,rAd-hTERT对hTERT基因mRNA的抑制率约86%,对TRF2基因表达无明显抑制（P〉0.05@;rAd-TRF2对TRF2基因mRNA的抑制率约80%,对hTERT基因表达无明显抑制（P〉0.05@;rAd-hTERT/rAd-TRF2联合干扰组对hTERT基因表达抑制率约88%,TRF2基因表达抑制率约85%,联合干扰与单基因干扰相比,对hTERT和TRF2基因的表达抑制差异无显著性（P〉0.05@。②干扰组转染后1～6d均能促进细胞凋亡。单基因干扰组转染后3～5d凋亡最明显,第5天达凋亡高峰;凋亡率rAd-hTERT组为46.2%,rAd-TRF2组为43.5%。联合组转染后第1天凋亡率为46.2%,第2天为68.5%,第3～6天均维持在较高水平,第6天达77.6%。转染后1～6d,联合干扰细胞凋亡率与单基因干扰细胞凋亡率相比,差异均有显著性（P〈0.05@。结论：①rAd-hTERT和rAd-TRF2转染MCF-7细胞48h后可分别显著抑制hTERT和TRF2基因mRNA表达,但rAd-hTERT和rAd-TRF2在抑制hTERT和TRF2基因mRNA表达上无相互协同或相互抑制作用。②rAd-hTERT和rAd-TRF2均能有效促进MCF-7细胞凋亡,且两者联合干扰效果具有累加效应。因此利用联合干扰技术靶向抑制端粒酶活性和端粒稳定性相关的多基因的表达能更高效地促进乳腺癌细胞凋亡,抑制肿瘤细胞的增殖与生长。     

survivin基因的RNA干涉抑制人乳腺癌SKBr-3细胞体外增殖的作用

目的:研究RNA干涉(RNAinterference,RNAi)抑制survivin基因表达后对人乳腺癌SKBr3细胞体外增殖能力的影响。方法:通过RTPCR和间接免疫荧光检测转染survivin靶向的小干涉RNA表达载体pSUPERS1后SKBr3细胞中survivin基因的表达;集落形成实验、MTT比色法检测细胞体外增殖能力;流式细胞仪检测细胞周期。结果:转染pSUPERS1后,SKBr3细胞中survivin的mRNA和蛋白表达水平明显降低;克隆形成率(38±16.70)%比对照组(90.3±4.04)%显著降低;细胞增殖减慢,主要阻滞于G1期(74.03±8.91)%。结论:RNA干涉沉寂survivin基因表达后明显抑制了人乳腺癌SKBr3细胞的体外增殖能力。     

siRNA沉默hTERT基因表达对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的应用小干扰RNA（small interferingRNA，siRNA）抑制乳腺癌MCF-7细胞hTERT的表达，探讨其对乳腺癌细胞增殖和凋亡的效应。方法体外化学合成针对hTERT基因的siRNA序列，在脂质体介导下转染MCF-7细胞，实时定量PCR检测hTERTmRNA表达水平，Westernblot检测hTERT蛋白表达水平，流式细胞仪检测细胞凋亡状况，MTT法检测细胞增殖活性，平板克隆形成实验检测克隆形成率。结果所设计的3对针对不同靶点的siRNA与对照组相比均可有效抑制hTERT的表达，hTERTsiRNA转染MCF-7细胞48h后，siRNAl-siRNA3组hTERTmRNA表达分别为（35．3±4．2）％、（30．7±2．8）％、（31．3±3．6）％，与阴性对照组（96．4±2．8％）相比，差异有统计学意义。MTT结果显示MCF-7细胞增殖能力显著降低，转染48h后，siRNAl～siRNA4细胞抑制率分别为（57．6±3．6）％、（61．3±4．3）％、（65．6±6．3）％和（3．1±4．5）％，细胞克隆形成能力下降，凋亡率明显增加。结论体外化学合成的hTERTsiRNA可以有效地抑制MCF-7细胞hTERT的表达，从而抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。     

RNA干扰对乳腺癌MCF-7细胞株WT 1基因表达的抑制作用

目的：为探索治疗乳腺癌新途径，研究RNA干扰（RNA interferance，RNAi）对MCF-7细胞株WT 1基因表达的抑制作用。方法：设计制备多对针对WT 1基因的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA），转染MCF-7细胞，采用实时定量PCR（real—time quantitative polymerase chainreaction，RQ-PCR）法测定WT1 mRNA的表达，western blot测定WT1蛋白的表达，流式细胞仪检测加入长春新碱后的MCF-7细胞凋亡率。结果：siRNA能有效抑制WT1基因的表达，但不呈剂量关系，在较低浓度可维持RNAi至少4d时间，WT1基因表达下调的MCF-7细胞凋亡率增加。结论：RNAi能有效抑制MCF-7细胞中WT1基因的表达，同时转染siRNA后细胞对长春新碱敏感。     

Synergistic apoptosis of MCF-7 breast cancer cells by 2-methoxyestradiol and bis(ethyl)norspermine

2-Methoxyestradiol (2ME) is an estradiol metabolite with anti-tumor and anti-angiogenic properties. We studied the effect of 2ME on apoptosis of MCF-7 breast cancer cells and explored a combination therapy using 2ME and a polyamine analogue, bis(ethyl)norspermine (BE-3-3-3). Determination of viable cells on day 4 of treatment with 2ME/BE-3-3-3 combinations showed synergistic effects by Chou–Talalay analysis. APO-BRDU analysis showed that there was only 1.5 ± 0.5% apoptosis at 200 nM 2ME and 3.7 ± 1.7% in the presence of 2.5 μM BE-3-3-3. Combination of 200 nM 2ME and 2.5 μM BE-3-3-3 resulted in 52.2 ± 2.6% apoptosis. Up to 90% of the cells underwent apoptosis in the presence of 1000 nM 2ME and 2.5 μM BE-3-3-3. Combination treatments resulted in total disruption of microtubules and depletion of putrescine, spermidine and spermine. In addition, phosphorylation of Akt and nuclear localization of cyclin D1 were altered by 2ME/BE-3-3-3 combination. Our results suggest an important strategy to induce apoptosis of breast cancer cells, with potential applications in therapy.     

下调Skp2表达诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡

目的 探讨在乳腺癌细胞系MCF-7中下调S期激酶相关蛋白(Skp2)表达诱导细胞凋亡及其机制。方法 应用RNAi方法在体外下调乳腺癌细胞系MCF-7中Skp2的表达水平,48小时后表阿霉素处理细胞,TUNEL和Hoechst 33258染色检测凋亡,Western Blot检测细胞周期调控相关因子及凋亡相关蛋白表达情况,研究其机制。结果 下调MCF-7中Skp2表达水平后,乳腺癌细胞凋亡增加。下调Skp2使p27、p21和CyclinE蛋白表达水平升高。表阿霉素处理MCF-7细胞后,Skp2蛋白水平下调。Skp2 siRNA与表阿霉素有协同诱导凋亡的作用,p53蛋白水平升高。结论 p27、p21和CyclinE在通过下调Skp2诱导的凋亡中发挥作用。Skp2 siRNA和表阿霉素协同诱导细胞凋亡,与p53依赖的凋亡途径有关。Skp2可能是乳腺癌治疗的靶点。     

stathmin基因的RNA干涉抑制人白血病K562细胞体外增殖的作用

目的：研究RNA干涉（RNA interference，RNAi）抑制stathmin基因表达后对人白血病K562细胞体外增殖的作用。方法：将合成的寡核苷酸链退火形成双链，连接入经BamHI和HindIII双酶切后的pSilencer4．1-CMV neo真核表达载体。酶切及测序鉴定。脂质体法转染重组质粒入K562细胞，RT—PCR检测其对mRNA的干涉效果；MTT比色法检测K562细胞体外增殖能力。结果：经酶切及测序鉴定，成功构建重组质粒。RT—PCR显示所构建的干涉载体成功地抑制了目的基因的转录，同时细胞增殖活性降低。结论：RNA干涉成功抑制stathmin基因表达并使人白血病K562细胞体外增殖活性明显降低。     

RNA干扰技术在乳腺癌基因治疗中的研究进展

 【摘要】　RNA干扰技术作为一种简单、有效的代替基因敲除的手段为肿瘤的基因治疗提供了新思路,文章综述RNA干扰的机制、特点及在乳腺癌基因治疗等方面的应用进展。