小鼠胚胎干细胞自我更新的机制

小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES细胞）来源于早期胚胎囊胚期的内细胞团（inner cell mass，ICM），它具有向小鼠胚胎3个胚层细胞分化的能力，它的另一个特点就是维持未分化的状态即自我更新的能力。小鼠ES细胞自我更新依赖于白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）、血清或骨形成蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）等等。除了外源性的信号通路外，内源性的转录因子对于维持小鼠ES细胞自我更新也十分重要。     

白血病抑制因子的研究进展

白血病抑制因子(Leukemia inhibitory fa-ctor,LIF)是80年代初发现的一种新的细胞因子。由于它具有广泛的生物学活性,所以人们曾根据其某一方面的活性给了它很多相应的命名。如:肝细胞生长因子Ⅲ、DA细胞介素、破骨细胞刺激因子、分化诱导因子及白血病抑制因子等。随着上述因子的最终纯化及氨基酸     

肝细胞生长因子诱导小鼠胚胎干细胞分化的实验研究

目的探讨肝细胞生长因子（HGF）诱导小鼠胚胎干细胞（ESC）体外定向分化为肝细胞的能力。方法对ESC体外悬浮培养5～7天形成的拟胚体,观察ESC自主分化、HGF诱导分化的情况。观察和检测经诱导4周的细胞的HE染色,糖原染色,尿素氮及甘油三酯合成,心肌MHC、白蛋白、AFP、CK18的表达,以及吲哚氰绿（ICG）染色情况。结果ESC自主分化难以控制。HGF可促进ESC向内胚层进一步分化,但更可能诱导其向心肌分化。表达白蛋白、AFP、CK18、ICG和FDA染色阳性。结论HGF可诱导ESC分化出肝细胞,但HGF的单一作用能力有限,提示肝细胞的诱导分化可能需要多种因素共同作用。     

人白血病抑制因子的分子克隆及其在大肠杆菌中的表达

白血病抑制因子（ＬＩＦ）是一种多功能的细胞因子，正常生理条件下，人体各组织细胞并不产生ＬＩＦ，只有在一定条件刺激下，一些细胞如淋巴细胞、单核细胞、成纤维细胞才产生ＬＩＦ，此外，一些白血病细胞系如Ｕ９３７、ＨＬ－６０在一定条件刺激下亦产生ＬＩＦ。该实验根据Ｍｏｒｅａｕ报道的ＬＩＦｃＤＮＡ序列，通过激活ＬＩＦ基因、逆转录ＰＣＲ等步骤成功地克隆了ＬＩＦｃＤＮＡ后，将ＬＩＦｃＤＮＡ亚克隆至表达载体ｐＢＶ２２０形成重组表达质粒ｐＢＶ２２０／ＬＩＦｌ，该重组质粒转化ＤＨ５α大肠杆菌，经过诱导后ＬＩＦ在ＤＨ５α中的表达量达１０％。     

硒促进小鼠胚胎干细胞分化为胰岛细胞的实验研究

目的：探讨硒在体外诱导小鼠胚胎干细胞向胰岛细胞分化中的促进作用。方法：将ES-D3小鼠胚胎干细胞悬浮培养7d形成拟胚体，然后进行贴壁培养，加入分化培养液1诱导6d，然后用分化培养液2诱导6d。最后用含不同浓度的亚硒酸钠的培养基诱导20d。对诱导后获得的胰岛素产生细胞团(IPCC)细胞进行双硫腙染色，对染色结果进行体视学分析。进行胰岛素刺激释放试验，用ELISA法测定胰岛素释放量。RT-PCR法检测胰腺细胞相关基因的表达。结果：亚硒酸钠浓度在0．03～810μmol／L之间时，经过系列诱导后获得的IPCC其DTZ阳性率随着亚硒酸钠浓度的提高而显著升高。当亚硒酸钠浓度为270μmol/L时DTZ阳性率上升至最高点，随后开始缓慢下降；胰岛素分泌释放试验也证实270μmol/L亚硒酸钠诱导的细胞释放的胰岛素最多。RT-PCR结果进一步表明诱导获得的IPCC具有类胰岛组织的功能。结论：硒对胚胎干细胞向胰岛细胞分化具有促进作用。     

胚胎干细胞在脊髓损伤中的应用

神经干细胞具有自我增殖、分化、迁移及建立突触联系的特征,并可促进损伤神经组织的修复与再生。最近发现,经胚胎干细胞诱导的神经前体细胞植入受损伤的脊髓中,可分化为神经元和神经胶质细胞,并能促进脊髓功能的恢复,提示胚胎干细胞在中枢神经系统的治疗中具有广阔的应用前景。     

绿色荧光蛋白在胚胎干细胞研究中的应用

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein．GFP)作为一种方便、有效的活性标记物，无需外源反应底物，无需进行细胞或组织的固定和渗透处理．使检测更加方便。是细胞生物学和分子生物学研究的一个重要工具，已得到了广泛的应用。胚胎干细胞(Embryonic StemCell．ES cell)是从早期胚胎中分离得到的多能细胞，在胚胎发育、细胞移植、组织器官构建、药物研制、基因治疗等研究方面发挥着巨大的作用。本文就GFP的特性及其在ES细胞研究中的应用作一简述。     

骨形成蛋白家族成员2、7对小鼠胚胎肝干细胞分化的体外研究

目的 探讨骨形成蛋白2、7(BMP2、BMP7)对小鼠胚胎肝干细胞(HP14.5)定向诱导分化为肝细胞样细胞的影响.方法 将表达BMP2、BMP7、肝细胞生长因子(HGF)和绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺病毒作为4个组分别感染HP14.5,诱导其分化,在病毒感染后的第1、4、7天通过检测荧光素酶报告基因读数,在第7天通过细胞免疫荧光染色,观察肝细胞标志物白蛋白(ALB)的表达情况;并在第4、7、10天通过PAS染色、尿素氮合成功能检测,观察诱导后HP14.5向肝细胞方向的分化成熟度.结果 BMP2组、HGF组荧光素酶读数较GFP对照组明显上升;免疫荧光染色显示,诱导7d后BMP2组、HGF组细胞质内表达肝细胞特有的ALB,而GFP对照组几乎无表达;糖原染色可见BMP2组、HGF组胞质存在紫红色颗粒,呈阳性反应;尿素合成功能检测显示BMP2组、HGF组培养液中尿素氮随时间而升高.BMP7组诱导后,细胞免疫荧光染色、荧光素酶活性、PAS染色和尿素合成检测均呈阴性或弱阳性反应.结论 BMP2具有一定的诱导HP14.5向成熟肝细胞分化的作用,并初步具备肝细胞的合成分泌功能,而BMP7对其无诱导作用.     

细胞凋亡抑制因子在心肌病血清中的表达

 目的探讨细胞凋亡抑制因子对心肌病的影响和作用机制.方法运用细胞免疫学方法,检测了66例心肌病患者细胞凋亡抑制因子APO-1/Fas和调节因子IL-6,TNFa等指标.结果心肌病各组APO-1/Fas,IL-6,TNFa等指标较对照组有不同程度升高,心功能愈差,升高愈明显.结论 APO-1/Fas,IL-6,TNFa等细胞凋亡抑制因子在心肌病细胞凋亡病变中有明显抑制或调节作用.     

VEGF、bFGF联合应用对胎鼠大脑皮质神经干细胞分化的影响

目的观察血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)联合应用对胎鼠大脑皮质神经干细胞(NSCs)分化的影响。方法取孕14dSD大鼠,收集胎鼠大脑皮质NSCs,采用无血清培养基传代培养,取P3代细胞,分别加入200μg/LVEGF和(或)20μg/LbFGF进行诱导分化,并设对照组(不加VEGF和bFGF),7d后采用免疫细胞化学方法检测巢蛋白(Nestin)、β微管蛋白-Ⅲ(β-tubulin-Ⅲ)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况。结果从胎鼠大脑皮质中分离的细胞在体外悬浮生长,形成致密的球形细胞团,传代后能形成新的细胞球,免疫细胞化学染色显示细胞球nestin表达阳性。诱导分化后的细胞部分表达β-tubulin-Ⅲ,部分表达GFAP。与对照组比较,VEGF和(或)bFGF均可使NSCs向神经元方向分化的比例增加,其中VEGF+bFGF联合作用后NSCs的β-tubulin-Ⅲ阳性率(80.3%)最高,GFAP阳性率(18.6%)最低。bFGF作用后NSCs的β-tubulin-Ⅲ阳性率(60.4%)和GFAP阳性率(38.5%)与VEGF作用后(分别为60.3%、38.7%)比...     

5-氮胞苷联合碱性成纤维生长因子诱导人胚胎干细胞定向心肌样细胞分化的实验研究

目的探讨5-氮胞苷（5-azacytidine,5-aza）联合碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）体外诱导人胚胎干细胞（human embryonic stem cells,hESCs）定向分化为心肌样细胞的可行性。方法采用小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts,MEF）作为饲养层细胞体外培养hESCs,经悬浮培养形成拟胚体（embryoid bodies,EB）,贴壁后分为无诱导剂组（对照组）、5-aza诱导组、bFGF诱导组、5-aza+bFGF联合诱导组4组诱导培养。诱导时间为2周。倒置相差显微镜下连续动态观察细胞形态学变化,并计算各组出现自发搏动的EB,以定量聚合酶链反应检测心肌细胞特异性基因NKX2.5、GATA4、α-actin,免疫荧光法检测心肌特异性肌钙蛋白T（cardiac troponin T,cTnT）。结果EB克隆贴壁诱导3～4 d后部分细胞出现自发性节律性搏动,以5-aza+bFGF联合诱导组为著。14 d后定量聚合酶链反应检测示5-aza+bFGF联合诱导组NKX2.5、GATA4、α-actin表达显著高于其他3组（P＜0.05）。免疫荧光法示5-aza+bFGF联合诱导组cTnT的表达最为明显（P＜0.05）。结论hESCs在体外经5-aza+bFGF联合诱导后可定向心肌细胞分化,该诱导方案为心肌再生与组织工程领域的研究奠定了基础。     

仿生电刺激在心肌细胞诱导胚胎干细胞向心肌样细胞分化中的作用

目的 探讨仿生电刺激对离体心肌微环境诱导胚胎干细胞(ESCs)向心肌样细胞分化的作用.方法 原代分离培养SD大鼠乳鼠心肌细胞及昆明小鼠ESCs,根据是否给予ESCs仿生电刺激及心肌微环境诱导分为5组:对照组、电刺激组、心肌细胞组、电刺激+心肌细胞条件培养液组、电刺激+心肌细胞组.分别于实验第5、7、14天在相差显微镜下...     

腺病毒介导的人HGF转染大鼠骨髓间充质干细胞及其作用研究

目的：评价携带HGF基因的腺病毒栽体转染鼠骨髓间充质干细胞(MSC)的效率，以及转染HGF基因对MSC增殖与分化的影响。方法：采用荧光显微镜及流式细胞术检测转染效果和转染率；采用ELISA方法检测转染后HGF的表达情况；细胞增殖分析采用MTT法；MSC向成骨细胞分化采用碱性磷酸酶染色法。结果：转染效率与病毒滴度(MOI)具有量效关系，随着MOI的增加，转染率明显增高，当MOI=400时，转染率可达99．99％。转染HGF后，MSC表达HGF明显增高，48h可达128ng/ml，随后逐渐下降并维持2周以上；转染HGF对MSC的增殖以及向成骨分化没有影响。结论：MSC是一种理想的基因载体细胞，可用于HGF的基因治疗。     

In vitro comparison of the biological effects of three transfection methods for magnetically labeling mouse embryonic stem cells with ferumoxides.

In vivo MRI of stem cells (SCs) is an emerging application to evaluate the role of cell therapy in restoring the injured myocardium. The high spatial and temporal resolution combined with iron-oxide-based intracellular labeling techniques will provide a sensitive, noninvasive, dual imaging modality for both cells and myocardium. In order to facilitate this novel imaging approach, much effort has been directed towards developing efficient transfection methods. While techniques utilizing poly-L-lysine (PLL), protamine sulfate (PS), and electroporation (ELP) have been proposed, the fundamental biological effects of these methods on mouse embryonic SCs (mESC) have not been investigated systematically. In this study a longitudinal in vitro evaluation of cellular viability, apoptosis, proliferation, and cardiac differentiation of magnetically labeled mESC was conducted. No significant difference was seen in these biological parameters among the three transfection methods. However, cardiac differentiation was most attenuated by ELP, and iron uptake was most effective by PS.     

表皮细胞生长因子在体诱导猪骨髓间充质干细胞向皮肤组织分化作用的研究

目的观察表皮细胞生长因子(EGF)在体内是否具有诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)向皮肤组织分化的作用,及其在皮肤创面愈合中的作用。方法抽取小型猪骨髓,体外分离、纯化和培养MSCs,并用5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)进行标记。6只小型猪共48个创面,随机分为EGF MSCs治疗组(A组)、MSCs治疗组(B组)、EGF治疗组(C组)和生理盐水对照组(D组)。观察伤后治疗3、7、14、21及84天的创面,并用病理学、免疫组化方法对创面的修复质量进行评估。结果A组的皮肤创面愈合速度明显快于其它治疗组,并且在皮肤愈合的组织病理等级评分上优于B、C和D组。A组表皮层BrdU和CKp双染阳性细胞比B组更为多见。结论EGF具有在体促进猪骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化,加快皮肤创面愈合速度和提高愈合质量的作用。     

骨髓间充质干细胞培养并向骨骼肌诱导分化的实验研究

目的 研究大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的定向分化及其在体内的形态发育情况。方法 Wistar大鼠24只，向其左胫前肌处注射0．2ml无水乙醇，致其无菌坏死，右胫前肌注射等渗盐水0．2ml作为对照，制成动物模型后备用；取大鼠第3代BMSCs，5-氮杂胞苷、成肌调节因子（MyoD）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）联合进行诱导分化。诱导后第9天，收集BMSCs，用BrdU标记并诱导后注射到大鼠双下肢胫前肌处，分别在3，6，9和12d取材进行形态观察和免疫组织化学检查。结果 注射诱导后3d，实验组的成活率明显高于注射单纯注射BMSCs的对照组，BrdU标记细胞向骨骼肌分化，结蛋白、骨骼肌特异肌球蛋白均为弱阳性表达，6，9d可见BrdU标记细胞向骨骼肌分化，结蛋白、骨骼肌特异肌球蛋白阳性表达，第9天更为明显，注射后12d后可见新生骨骼肌细胞形成肌小管，细胞核结蛋白、骨骼肌特异肌球蛋白强阳性表达。结论 大鼠损伤肌肉的微环境中，BMSCs可向骨骼肌定向分化，并伴有结蛋白和骨骼肌肌球蛋白阳性表达；定向诱导后BMSCs在体内成活率高，增殖速率快，向骨骼肌分化纯度更高。     

同种Beagle狗循环血造血干细胞移植治疗急性放射病的实验研究

实验中用Ｂｅａｇｌｅ狗１０只，以０．０２４７～０．０２７８Ｃ·ｋｇ－１·ｍｉｎ－１照射量率，全身照射６．５Ｇｙ，分３组：第１组３只，作为对照，不给任何治疗，照射后全部死亡，平均活存７．５天。第２组４只，移植性别相反的同种血造血干细胞。供受体混合淋巴细胞培养刺激指数小于０．６９，红细胞交叉凝集试验阴性，未在体外去除供体血细胞中的Ｔ淋巴细胞。结果表明，照射后１１，２０和２６天检查性染色体，均为供体核型。４只狗死于严重ＧＶＨＤ，平均活存４ｌ．６天。第３组３只，移植去除Ｔ淋巴细胞的同种血干细胞，２只死亡，１只发生轻度ＧＶＨＤ，长期活存４年以上。