脂肪间充质干细胞治疗复杂性肛瘘的机制探讨

复杂性肛瘘是一种病因复杂、治疗难度大且复发率高的肛肠疾病,如何提高复杂性肛瘘治愈率一直是临床治疗的难点。间充质干细胞移植是近年来临床研究的热点之一,来源广、易获取,具有增殖分化潜能和调节免疫、抗炎、促进创面组织再生等功能,对于复杂性肛瘘患者的治疗凸显出其独特的治疗优势。本文对脂肪间充质干细胞的生物学特性及其治疗复杂性肛瘘的潜在作用机制做一综述,以期为今后的研究和临床应用奠定基础。     

大鼠骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化潜能的研究

目的 体外研究大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)分化为血管内皮细胞的潜能.方法 采用密度梯度离心法分离rMSCs,体外扩增并进行鉴定.在内皮细胞生长培养基(EGM-2)中以血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)定向诱导rMSCs向血管内皮细胞分化,观察细胞形态学变化.采用免疫细胞化学法和Dil荧光标记法,分别检测诱导后rMSCs的内皮细胞表型表达及对乙酰化低密度脂蛋白(Ac-LDL)的摄取能力.结果 形态学观察显示,诱导后的rMSCs可见类似内皮细胞样改变,并表达血管内皮细胞特异的表面标志vWF和CD31,但仅少数细胞具有摄取Dil-Ac-LDL的能力.结论 VEGF和bFGF在体外能够诱导rMSCs出现内皮细胞表型,但尚不完全具备成熟内皮细胞的功能特性.rMSCs具有向血管内皮细胞分化的潜能.     

大鼠骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化潜能的研究

目的体外研究大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)分化为血管内皮细胞的潜能。方法采用密度梯度离心法分离rMSCs,体外扩增并进行鉴定。在内皮细胞生长培养基(EGM-2)中以血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)定向诱导rMSCs向血管内皮细胞分化,观察细胞形态学变化。采用免疫细胞化学法和Dil荧光标记法,分别检测诱导后rMSCs的内皮细胞表型表达及对乙酰化低密度脂蛋白(Ac-LDL)的摄取能力。结果形态学观察显示,诱导后的rMSCs可见类似内皮细胞样改变,并表达血管内皮细胞特异的表面标志vWF和CD31,但仅少数细胞具有摄取Dil-Ac-LDL的能力。结论VEGF和bFGF在体外能够诱导rMSCs出现内皮细胞表型,但尚不完全具备成熟内皮细胞的功能特性。rMSCs具有向血管内皮细胞分化的潜能。     

大鼠骨髓间充质干细胞培养方法的比较

目的：比较4种培养条件下大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的生长与增殖性差异。方法采用密度梯度离心法提取大鼠BMSCs ,分别在DMEM-LG培养基、DMEM/F12培养基、DMEM-LG＋10 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（ bFGF）与DMEM/F12＋10 ng/mL bFGF培养条件下贴壁培养,观察各代细胞的形态特征,绘制第4代细胞的生长曲线,利用流式细胞仪对各培养条件下的BMSCs进行细胞表面标志CD45、CD29和CD90的检测。结果不同培养条件下的 BMSCs 生长速度不同。加入 bFGF 培养条件下细胞增殖速度较单用 DMEM -LG 或DMEM/F12培养条件下更快（P＜0．05）。 DMEM-LG＋10 ng/mL bFGF的培养效果最佳,细胞密度高,生长状态良好。4种条件下培养的细胞均阳性表达CD29及CD90,阴性表达CD45。结论短期培养过程中加入bFGF不引起BMSCs分化,DMEM-LG＋10 ng/mL bFGF是较理想的BMSCs培养条件。     

脂肪间充质干细胞对小鼠创面组织超氧化物歧化酶及血管内皮生长因子、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子表达的影响

目的:探讨脂肪间充质干细胞(hASCs)对小鼠创面组织超氧化物歧化酶(SOD)及血清血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达的影响。方法:选取24只裸鼠建立创面损伤模型后分为三组,实验组给予基底膜基质(Matrigel)复合hASCs注射治疗,细胞组给予hASCs注射治疗,对照组给予磷酸液缓冲液(PBS)注射治疗,记录创面愈合情况。结果:所有裸鼠都造模成功,无动物因麻醉或手术而死亡。与对照组相比,实验组与细胞组术后7 d与14 d的创面愈合率、创面组织的SOD水平显著升高(均P<0.05),而丙二醛(MDA)水平显著降低(P<0.05)。与对照组相比,实验组与细胞组术后14 d的血清VEGF、EGF及bFGF表达水平显著升高(均P<0.05),且实验组与细胞组对比差异有统计学意义(均P<0.05)。MASSON染色结果为实验组创面完全愈合,表皮修复情况良好,可见部分炎性细胞浸润,呈复层上皮排列;细胞组已修复部分的表皮修复情况良好,表皮呈复层上皮排列,仍有部分创面未能愈合,肉芽组织生长良;对照组尚未愈合的创口周围...     

骨髓间充质干细胞促进大鼠皮肤创面愈合的作用及机制研究

目的 探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)对大鼠皮肤创面的促愈作用及机制,为临床皮肤损伤修复提供新的治疗方法.方法 建立大鼠背部皮肤全层切割伤模型,将大鼠分为2组:空白对照组,MSCs处理组,分别于伤后3、6、9、12 d采用大体观察,常规组织学检查观察2组大鼠背部皮肤伤口愈合状况及RT-PCR观察转化生长因子(TGF-β1)、表皮生长因子(EGF)mRNA在愈合中的变化特点.结果 MSCs处理组大鼠皮肤愈合快,愈合指数高,创伤后第3天MSCs处理组大鼠皮肤TGF-β1上调明显,第6天EGF上调明显.结论 MSCs能促进大鼠皮肤创面愈合,其机制可能与其引起各种生长因子的合成和分泌有关.     

脂肪干细胞调节创面炎症反应并促进创面愈合

目的利用脂肪组织来源的干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)促进创面愈合并初步探讨其机制。方法采用胶原酶消化GFP转基因小鼠(GFP-C57BL)腹股沟处脂肪组织,获得ADSCs,并在体外证明其具有成骨和成脂的多向分化能力。14只C57BL小鼠随机分为两组并制作创面,实验组注射PBS缓冲液悬浮的ADSCs,对照组注射相同体积的PBS缓冲液。观察并分析创面愈合情况,通过荧光显微镜观察移植细胞的存活情况,利用real-time PCR检测创面组织中促炎因子白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(TCP-1)以及抗炎因子白细胞介素-10(IL-10)的表达。结果分离的细胞具有较强的增殖能力,并具有多向分化潜能。同种异体移植ADSCs可以显著促进创面的愈合速度。移植两周后,荧光显微镜观察创面区域有少量ADSCs存活。与对照组相比,实验组小鼠的创面组织中促炎因子IL-1、IL-6和TCP-1表达下降,抗炎因子IL-10表达上升。结论通过同种异体局部注射ADSCs可以显著促进皮肤创面的愈合,其机制可能与AD-SCs降低了创面局部的炎症反应相关。     

创面微环境对植入骨髓间充质干细胞的影响研究

目的 探讨创面局部微环境对植入的骨髓间充质干细胞(MSC)的影响。方法 采用常规的细胞培养传代技术、超微结构观察、免疫组化、RT-PCR和细胞增殖活性检测等方法。结果 将MSC植入到创面后，可见肉芽组织中有大量成纤维细胞形成，排列成“瀑布”状，成纤维细胞胞浆中有大量原胶原颗粒形成；免疫组化显示碱性成纤维因子(bFGF)、Ⅰ型胶原在新生的成纤维细胞中表达增强；伤口液促进MSC的增殖活性和迁移能力；局部微环境促进MSC基质源性因子(SDF-1)、IL-8、Ⅰ型胶原的基因表达。结论 MSC在创面局部微环境的作用下MSC表现出向成纤维细胞分化的表型。     

脂肪干细胞结合碱性成纤维细胞生长因子辅助颗粒脂肪移植的实验研究

目的探讨脂肪间充质干细胞(ASCs)结合碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)辅助颗粒脂肪移植是否能提高移植脂肪存活率.方法采集人颗粒脂肪及人脂肪间充质干细胞ASCs分离、培养、标记,对照组以ASCs直接与同一患者颗粒脂肪混合.实验组以ASCs加bFGF后与同一患者颗粒脂肪混合.各组细胞颗粒脂肪混合物注射移植至裸鼠皮下,6周后检测脂肪形成,形态学及分子生物学方法检测比较两组脂肪标本.结果成功获得ASCs用于移植实验.在实验组(ASCs+bFGF+颗粒脂肪组)及对照组(ASCs+颗粒脂肪组)均形成脂肪组织,新生组织湿重实验组明显高于对照组(P<0.01).Western blot检测结果显示实验组VEGF,bFGF表达均高于对照组.结论脂肪间充质干细胞结合碱性成纤维细胞生长因子辅助颗粒脂肪移植,通过改善脂肪间充质干细胞存活、增殖及移植组织血运,提高了移植脂肪存活率.     

大鼠脂肪间充质干细胞体外培养及其分化研究

目的:建立大鼠脂肪间充质干细胞体外分离培养体系并研究其多向分化潜能。方法:取6周龄大鼠双侧腹股沟和附睾处脂肪,酶解法分离培养原代脂肪间充质干细胞,绘制第三代细胞生长曲线。成脂诱导4 d,成骨诱导培养18 d,分别通过油红O染色、碱性磷酸酶活性检测和钙盐沉积VonKossa染色来观察细胞成脂、成骨表型转化。结果:大鼠脂肪中能分离培养出一定量的脂肪间充质干细胞,其群体倍增时间为(60±3.2)h。在成脂诱导培养液作用下可分化为脂肪细胞;成骨诱导培养液作用下,可特异性表达成骨分化标志碱性磷酸酶,同时也具有矿化细胞外基质的能力。结论:脂肪间充质干细胞具有易于取材、大量分离培养和定向诱导成骨分化的特点,是骨组织工程理想的种子细胞的来源。     

脂肪干细胞与碱性成纤维细胞生长因子在颗粒脂肪移植中应用的研究进展

自体移植颗粒脂肪的成活率受到再血管化及组织细胞分化不足等问题的影响,对脂肪组织来源干细胞(ASCs)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在自体颗粒脂肪移植中应用的研究中发现,两者能明显提高自体颗粒脂肪移植后的成活率。现广泛查阅近年ASCs和bFGF在颗粒脂肪移植中作用的相关文献,并进行综合分析,探讨ASCs和bFGF在颗粒脂肪移植中的研究进展。     

脂肪间充质干细胞移植对兔心肌梗死后微血管生成及心功能的影响

目的 探讨脂肪间充质干细胞(adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,ADMSCs)移植对兔心肌梗死后微血管生成的可能机制及心功能的变化情况.方法 30只健康日本大耳白兔,完全随机分为假手术组、心肌梗死对照组和ADMSCs移植组(ADMSCs组).结扎兔前室间支,建立急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)动物模型,AMI 1 h 内将4',6-二脒-2-苯基吲哚(4',6-diamidio-2-phenylindole,DAPI)标记的第3代ADMSCs植入ADMSCs组梗死心肌,对照组及假手术组注射等量磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution, PBS).术前及术后4周分别做超声心动图检查其心功能变化.处死动物,取其心脏,采用免疫组织化学法检测梗死区新生血管微血管密度,RT-PCR 检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)的表达.结果 ADMSCs组荧光显微镜下可以观察到DAPI标记细胞存在,部分分化为心肌样细胞;超声心动图证实移植后4周ADMSCs组心功能较心肌梗死对照组改善(P<0.05);ADMSCs组较心肌梗死对照组梗死区微血管密度明显增高[(20.00±2.65)vs(7.75±2.12),P<0.05];ADMSCs组bFGF和VEGF的表达水平均较心肌梗死对照组明显增高[(0.590±0.028)vs(0.569±0.021),(0.913±0.030)vs(0.886±0.049),P<0.05].结论 ADMSCs移植促进心肌梗死区微血管的生成,并改善心脏功能,其机制可能与促进bFGF、VEGF的表达有关.     

脂肪间充质干细胞复合人工真皮修复大鼠深度烧伤创面的研究

目的探讨脂肪间充质干细胞（ADSCs）复合人工真皮（皮耐克）修复大鼠深度烧伤创面的作用。方法用胶原酶法消化SPF级绿色荧光蛋白转基因大鼠腹股沟脂肪,获得ADSCs,用流式细胞仪分析鉴定其表面特异性标志物,并观察ADSCs向成骨细胞、成脂细胞分化的潜能。建立大鼠深度烧伤模型,将大鼠对称的左、右创面分为实验组和对照组。实验组采用人工真皮+ADSCs治疗,对照组采用人工真皮+0.9%氯化钠注射液治疗。分别于术后7、14、21d观察创面最大直径以评估创面愈合情况,术后21d时荧光显微镜下观察创面冷冻切片评估实验组与对照组创面情况。结果成功获得大鼠ADSCs,具有较强的增殖能力及多向分化能力。ADSCs对间充质干细胞标志物CD29、CD90、CD44呈现高表达;对造血干细胞表面标志物CD34、白细胞共同抗原CD45则呈低表达。治疗后14d时,实验组创面最大直径明显小于对照组（P＜0.05）,即实验组创面愈合速度比对照组明显增快。治疗后21d,实验组创面可见散在点状绿色荧光,而对照组未观察到明显荧光。结论ADSCs联合人工真皮作用于深度烧伤创面可显著促进创面愈合,是一种有效的治疗深度烧伤的方法。     

脐带间充质干细胞对重度糖尿病足溃疡创面愈合的促进作用

目的 探讨脐带间充质干细胞(UCMSCs)对重度糖尿病足溃疡(DFU)患者创面愈合的改善作用及其对肝肾功能的影响.方法 选择2019年6月于新乡市第二人民医院伤口治疗科接受常规治疗的1例女性DFU患者为研究对象,入院时患者创面宽度约为2 cm,长度8 cm,第1跖骨处向内连接,中间约有0.5 cm距离,正常组织暴露约有...     

p62基因缺失对人脂肪间充质干细胞成脂的促进作用

目的：探讨p62基因缺失对人脂肪间充质干细胞（hADSCs）自噬活性的影响,阐明脂肪分化的分子机制。方法：应用Ⅰ型胶原酶消化法从人大腿皮下脂肪抽吸液中分离培养hADSCs,使用80 μmol·L^-1油酸（OA）联合地塞米松和胰岛素对hADSCs进行成脂诱导;将hADSCs分为对照组和p62基因缺失组,p62基因缺失组hADSCs转染p62 shRNA慢病毒载体,对照组hADSCs转染hADSCs空载体。采用CCK-8实验绘制2组细胞的生长曲线并观察细胞增殖活性变化;应用尼罗红染色观察脂滴的形成（尼罗红脂滴染色阳性细胞数）,Western blotting法检测成脂标志转录因子C/EBPα和微管相关蛋白1轻链3Ⅱ型/微管相关蛋白1轻链3Ⅰ型（LC3Ⅱ/LC3Ⅰ）蛋白表达,磺酰成二胺（MDC）染色检测2组细胞成脂中的自噬活性（MDC染色阳性细胞数）,采用LC3与Mitotracker Red荧光共定位检测2组细胞的线粒体自噬活性,使用环孢菌素A（CsA）分别抑制2组细胞线粒体自噬活性并进行成脂诱导,光镜下计数含脂滴细胞数。结果：分离培养的细胞呈多角形或梭形,传代后细胞呈漩涡状排列;OA诱导hADSCs成脂后,细胞内有大量脂滴形成。CCK-8实验,在培养6 d后p62基因缺失组细胞增殖活性较对照组明显降低（P<0.01）。2组细胞诱导成脂后,与对照组比较,p62基因缺失组hADSCs中尼罗红脂滴染色阳性细胞数增多,C/EBPα蛋白表达水平升高（P<0.01）,MDC染色阳性细胞数明显升高（P<0.05）,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达水平升高（P<0.01）,细胞中LC3的点状化和颗粒化增多,与线粒体的共定位现象增加。使用CsA抑制线粒体自噬后,光镜下观察,p62基因缺失组含脂滴细胞数降低到与对照组接近的水平。结论：p62基因缺失可通过增强总自噬及线粒体自噬促进hADSCs的成脂。     

两种成脂诱导培养基诱导人和大鼠脂肪干细胞的研究

目的：比较两种培养基诱导人和大鼠脂肪干细胞(Adipose-derived stem cell, ADSC)的成脂分化能力,探寻更为适宜的ADSC成脂诱导方案。方法：提取3例临床患者的脂肪干细胞(hADSCs)及出生6周大鼠的脂肪干细胞(rADSCs)。将hADSCs、rADSCs分别接种于六孔板,分为未诱导组、成脂诱导Ⅰ组和Ⅱ组,分别使用普通培养基,成脂诱导培养基Ⅰ和Ⅱ,培养10天后以油红O染色,镜下观察及检测490nm吸光度值(OD490),比较脂滴形成情况。结果：未诱导的hADSCs和rADSCs均呈成纤维细胞样生长。成脂诱导培养3天后出现脂滴;油红O染色显示,成脂诱导组脂滴呈橘红色。hADSCs和rADSCs的成脂诱导Ⅱ组形成的脂滴均明显大于诱导Ⅰ组,统计学分析显示hADSCs的成脂诱导Ⅱ组测得的OD490明显高于诱导Ⅰ组（P<0.01); 而两组的rADSCs的OD490无明显差异（P>0.05）。结论：hADSCs和rADSCs在两种诱导培养基中均可成脂分化,但成脂诱导Ⅱ组优于成脂诱导Ⅰ组。     

脂肪来源的间充质干细胞对大鼠心肌梗死后心功能的保护作用

目的探讨脂肪来源的间充质干细胞(ADSCs)对大鼠急性心肌梗死(AMI)后心功能的影响。方法结扎SD大鼠左冠状动脉前降支制备心肌梗死模型。同种异体ADSCs体外分离、培养、纯化、扩增,在大鼠AMI区域周围进行心外膜下移植。将24只大鼠随机分为3组,每组8只:A组为AMI模型组,只给予前降支结扎;B组为细胞培养基(DMEM)移植组,结扎后心外膜注射DMEM;C组为ADSCs治疗组,结扎前降支后接受ADSCs移植治疗。术后7 d、28 d各组大鼠行心脏超声检测左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(FS),28 d超声检测后行血流动力学测量左室收缩压、左室舒张末压、左心室压力最大变化速率,评价ADSCs移植对AMI后大鼠心功能的影响;心脏组织行TTC染色,观察AMI面积。结果与AMI模型组比较,ADSCs治疗组的LVEF、FS及血流动力学指标明显提高(P0.01)。TTC染色观察心肌梗死面积,ADSCs治疗组心肌梗死面积明显减小(P0.01)。结论 ADSCs可减少AMI的面积,改善心功能。     

自体脂肪及脂肪干细胞填充治疗面部老化的疗效

目的 观察改良方法制备含有较多脂肪干细胞的自体脂肪进行移植填充治疗面部老化的临床效果。方法 选取在广州医科大学附属第三医院整形外科进行抗面部老化治疗的患者96例,根据脂肪提取与移植方法不同分为对照组和观察组。对照组患者（60例）接受传统自体颗粒脂肪移植治疗;观察组患者（36例）接受改良的脂肪移植治疗术。术后随访12个月,观察两组移植脂肪成活率、患者满意度、并发症与后遗症。结果 移植术后6个月,观察组脂肪成活率（71.04±5.42）%高于对照组的（59.78±7.26）%（P?<0.05）;移植术后12个月,观察组患者总满意率（91.67%）高于对照组（81.67%）（P?<0.05）;移植术后1年内,对照组患者出现硬结6例,纤维囊肿2例,观察组出现硬结1例,两组患者均未出现其他并发症与后遗症。结论 改良的自体脂肪移植术提高了移植脂肪的成活率和患者满意度。     

大鼠脂肪间充质干细胞向成肌细胞诱导分化的研究

目的探索在不使用5-氮杂胞苷的情况下,体外诱导大鼠脂肪间充质干细胞向成肌细胞的分化。方法取SD大鼠附睾处脂肪垫组织,酶消化分离获间充质干细胞,传至第3代,加入成肌细胞诱导液,在体外诱导8周,应用间接免疫荧光法、激光共聚焦显微镜进行成肌细胞的鉴定。结果大鼠脂肪组织来源的间充质干细胞经诱导5d后,显微镜下见细胞形态发生变化。2～8周的诱导细胞Myosin染色阳性。逆转录聚合酶链反应检测诱导3周的细胞有MyoD1和Myosin表达。结论大鼠脂肪组织来源的间充质干细胞在体外经诱导具有向成肌细胞分化的潜能。     

不同诱导时间下大鼠脂肪间充质干细胞成骨的差异

目的观察诱导时间的不同对大鼠脂肪间充质干细胞分化为成骨细胞的影响。方法脂肪间充质干细胞（ADSCs）分诱导组和非诱导组。诱导组在细胞接种同时（A组）、50%～60%融合时（B组）、85%～95%融合时（C组）分别加入同一浓度的由地塞米松、维生素C和β-甘油磷酸钠。非诱导组的A、B、C组由普通培养基培养不加入诱导剂。结果经钙钴染色后,诱导组大部分细胞呈阳性反应,以细胞达85%～95%融合时的结节体积最大。非诱导组未见片状阳性细胞。茜素红染色后可见红色结节,以细胞达85%～95%融合时诱导培养组形成结节较早。细胞内碱性磷酸酶活性检测表明诱导组与同期非诱导组相比细胞内碱性磷酸酶活性明显提高。结论 ADSCs经过诱导后,可向成骨细胞方向分化;诱导组细胞内碱性磷酸酶活性明显高于同期非诱导组;初始接种密度相同的情况下,ADSCs间相互接触程度越高,成骨能力越强。