三叶崖爬藤叶绿体基因组的组装与序列分析

目的以药用植物三叶崖爬藤为材料,在利用高通量技术测定DNA序列的基础上,对叶绿体基因组进行组装和序列分析,为进一步开展群体遗传学和多样性研究奠定基础。方法利用HiSeqXTen测定三叶崖爬藤的DNA序列,用NOVOPlasty组装叶绿体基因组,在基因注释的基础上开展序列分析。结果三叶崖爬藤叶绿体基因组的全长为160 189 bp,GC值37.5%,具1个典型的四分区域结构,包括1个大单拷贝区、1对反向重复区和1个小单拷贝区,序列长度分别为88 184、26 519、18 967 bp。三叶崖爬藤的叶绿体基因组共有133个基因,其中编码蛋白基因、rRNA基因与tRNA基因的数量分别为88、8、37个。位于反向重复区和小单拷贝区的ycf1基因3’端发生缺失,是1个假基因。结论三叶崖爬藤的叶绿体基因组的组装和序列分析为后续开展群体遗传学和遗传多样性研究奠定了基础。     

灰毡毛忍冬CHI和CHS基因的克隆及功能研究北大核心CSCD

该研究基于灰毡毛忍冬常规品种和湘蕾品种转录组数据,筛选到黄酮生物合成关键限速酶基因CHI和CHS的Unigene序列并克隆全长cDNA序列,通过在线生物信息学分析软件和qRT-PCR分析编码蛋白特性和不同花期、不同部位下CHI、CHS基因的表达模式,HPLC测定木犀草苷含量并结合表达量做相关性分析。结果显示,灰毡毛忍冬2个品种中CHI、CHS基因,分别包含627、1170 bp的ORF区,且CHI蛋白和CHS蛋白均为稳定、带亲水性的非分泌型蛋白。qRT-PCR结果表明2个品种CHI、CHS基因在不同花发育阶段及茎、叶中均有差异表达,且在关键花期表达差异明显,结合HPLC数据,木犀草苷含量与基因相对表达量之间呈现负相关性。推测灰毡毛忍冬中CHI、CHS基因参与调控黄酮化合物的累积,可进一步进行其功能研究。该研究首次克隆了灰毡毛忍冬中CHI、CHS基因并进行表达分析,丰富了灰毡毛忍冬黄酮生物合成研究,为进一步探究灰毡毛忍冬中木犀草苷等黄酮类成分差异的分子机制以及良种选育提供研究基础。     

杭菊CHI基因的克隆及原核表达

从杭菊转录组数据库中筛选并通过PCR技术成功克隆得到3条杭菊査尔酮异构酶基因(Cm CHI)分别命名为:CmCHI1,Cm CHI2,Cm CHI3。生物信息学分析表明:Cm CHI1～3开放阅读框的碱基数分别为708,633,681 bp分别编码235,210,226个氨基酸。利用原核表达技术成功诱导得到3条30 k Da左右的融合蛋白,同时使用Ni-NTA树脂柱分离纯化得到相应的重组融合蛋白。聚类分析表明,筛选得到的3条Cm CHI与菊科植物同源性较高,Cm CHI1与Cm CHI3属于Ⅰ型CHI; Cm CHI2属于Ⅳ型CHI。以β-actin为内参基因,使用RT-qPCR检测并分析Cm CHI1～3基因在杭菊中的表达量差异,结果表明Cm CHI1,Cm CHI3表达量较高,Cm CHI2表达量较低;淹水处理能显著促进Cm CHI1,Cm CHI3基因的表达,而对Cm CHI2无调控作用,由此得出CmCHI1,Cm CHI3是主要参与杭菊黄酮类化合物合成的查尔酮异构酶基因,Cm CHI2为辅助基因。以上研究结果为进一步研究CHI基因在杭菊黄酮类化合物代谢中的分子调控机制提供依据,从而为提高杭菊黄酮含量及最终提高杭菊药用品质奠定基础。     

狭叶崖爬藤化学成分的研究

目的 研究我国特有药用植物狭叶崖爬藤Tetrastigma hypoglaucum的化学成分，为阐明其有效成分提供依据。方法 利用各种色谱技术进行分离，根据化合物的光谱数据（IR，MS，^1HNMR,^13CNMR)和化学方法鉴定其结构。结果 从狭叶崖爬藤地上部分分离并鉴定了10个化合物，分别为β-谷甾醇（β-sitosterol,I)，棕榈酸（palmitic acid,Ⅱ），正二十五烷（pentacosane,Ⅲ），胡萝卜苷（daucosterol,Ⅳ），白藜芦醇（resveratrol,Ⅴ），没食子酸（gallic acid,Ⅵ），没食子酸乙酯（ethyl gallate,Ⅶ），儿茶素（catechin,Ⅷ），7-氧-没食子酰基-儿茶素（7-O-galloylcate-chin,IX）和3，3′-二甲氧基鞣花酸-4-氧-葡萄糖苷（3，3′-dimethoxy ellagic acid-4-O-β-D-glucopyranoside,X)。结论 所有化合物均系首次从该植物中分离得到。     

基于代谢组学和转录组学探究草珊瑚叶和根中黄酮类成分差异积累的转录调控机制北大核心CSCD

为了探究草珊瑚叶和根中黄酮差异积累的分子调控机制,该研究以草珊瑚叶和根为材料,采用液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术和高通量转录组测序(RNA-seq)技术进行转录组学和代谢组学联合分析,筛选黄酮类差异代谢物和关键差异代谢酶基因,并随机选取其中8个差异表达基因进行qRT-PCR验证。结果表明,通过代谢组学分析发现在草珊瑚叶和根中共获得37个黄酮相关差异代谢物,包括乔松素、根皮苷、柚皮素、山柰酚、无色矢车菊素、5-O-咖啡酰莽草酸等;通过转录组学分析发现草珊瑚叶和根中共获得36条黄酮相关差异基因,包括2条PAL、3条4CL、2条CHS、4条CHI、2条FLS、1条DFR、1条CYP73A、1条CYP75B1、3条PGT1、6条HCT、2条C3′H、1条CCOAOMT、1条ANR、1条LAR、2条3AT、1条BZ1、2条IFTM7、1条CYP81E9。同时,预测了C2H2、bHLH、bZIP等6个转录因子参与调控草珊瑚叶和根中黄酮合成差异积累。qRT-PCR结果显示,随机选取的8个参与黄酮合成的酶基因在草珊瑚叶和根中上下调表达趋势与转录组测序结果一致。该研究初步解析了草珊瑚叶和根中黄酮类成分差异积累的转录调控机制,为进一步阐明其中关键酶基因及相应转录因子对草珊瑚中黄酮类成分积累的调控作用奠定基础。     

中药三叶青的研究现状

三叶青（Tetrastigmatis hemsleyani），又名：有角乌蔹莓、石老鼠，为葡萄科崖爬藤属植物三叶崖爬藤（Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg）。其块根称为蛇附子，异名：石猴子、石抱子、拦山虎、雷胆子、破石珠、土经丸、搜夹风、三叶对、小扁藤、阴灵子、三叶扁藤、金丝吊葫芦、丝线吊金钟、金线吊葫芦、金线吊马铃薯，为民间常用的中草药。     

多穗柯查耳酮异构酶基因的克隆与序列分析

目的克隆多穗柯的查耳酮异构酶(chalcone isomerase,CHI)基因,并了解其表达情况。方法根据转录组测序结果,利用PCR扩增技术获取多穗柯CHI基因的c DNA全长,并对其进行生物信息学分析,采用qRT-PCR法检测CHI基因在多穗柯不同器官的表达量。结果多穗柯CHI基因的c DNA全长为772 bp,开放阅读框长为696 bp,编码231个氨基酸的蛋白。该蛋白不存在跨膜区域,定位于细胞质中。多穗柯CHI基因在不同部位均有表达,叶片的表达量最高,是根部最低量的9.75倍。结论首次克隆获得多穗柯的CHI基因,明确该基因属于CHI II型。且多穗柯CHI基因在各器官中的表达量具有显著差异。     

中国特有植物三叶崖爬藤化学成分的研究

 目的 研究我国特有植物三叶崖爬藤的化学成分,为阐明其有效成分提供科学依据。方法采用溶别提取和硅胶柱层析法进行分离,根据化合物的理化性质和光讲数据鉴定其结构。结果从中分离得到9个化合物,分别鉴定为:a-香树脂醇(a-amyrine,Ⅰ),三十二酸(lacceroic acid,Ⅱ),水杨酸(salicylic acid,Ⅲ),丁二酸(succinic acid,Ⅳ),胡萝卜苷(daucosterol,Ⅴ)山奈酚-7-O-β-L-吡喃李糖-3-O-D-吡喃葡萄糖苷(kaempferol-7-O-(β-L-rhamnopyranosyl-3-O-β-D-glucopyranoside,Ⅵ),没食子酸乙酯(ethyl gallate,Ⅶ),甘露醇(mannitol,Ⅷ)和环四谷氨肽(cyclotetraglutamipeptide,Ⅸ)。结论 9个化合物均系首次从该植物中分离得到。     

怀玉山产三叶青叶绿体基因组特征及其系统进化关系

目的 解析怀玉山产三叶青Tetrastigmahemsleyanum叶绿体基因组信息序列特征和确定其在崖爬藤属的系统位置。方法 用Illumina高通量测序平台Nova Seq6000进行测序获得怀玉山产三叶青叶绿体基因组序列,借助Ge Seq、t RNAscan-SE、MISA、VISTA tools、DNADna SP6.0、JSHYCloud、CodonW1.4.2、Pasteur Galaxy、mafft 7.0、fasttree 2.1.10等生物信息学工具进行序列分析、密码子偏好分析、崖爬藤属基因组比较分析和系统发育研究。结果 怀玉山产三叶青Tetrastigma hemsleyanum叶绿体基因组为共价闭合双链环状分子,长160 165 bp,包含1个大单拷贝区（large single copy region,LSC）、1个反向重复区a(inverted repeat region a,IRa)、1个反向重复区b(inverted repeat region b,IRb)和1个小单拷贝区（small single copy region,SSC）;怀玉山产三叶青叶绿体基...     

三叶青的组织培养与快速繁殖研究

三叶青又名有角乌蔹莓、石老鼠，为葡萄科崖爬藤属植物三叶崖爬藤。主要分布于长江以南地区，但多年来三叶青被毁灭性挖取，种源稀少。笔者应用组织培养进行快速繁殖研究，以期解决资源紧缺问题。     

三叶青种质资源遗传多样性的ISSR分析

目的对我国三叶青种质资源64个样本的遗传多样性进行分析。方法利用ISSR-PCR技术进行扩增,然后利用POPGENE 32软件及NTSYS软件分析三叶青种质资源64个样本的遗传多样性及亲缘关系,并根据UPGMA法,构建亲缘关系树状图。结果从30条引物中筛选出10条条带清晰、重复性好的引物对64份供试材料的基因组DNA进行扩增。扩增出了83个多态位点,多态百分数为71.43%～100.00%,平均多态百分数为94.31%,引物S17扩增得到的多态位点最多,为11个;引物P6扩增得到的多态位点最少,为5个,10条引物扩增得到的多态位点平均为8.3个;遗传多样性分析显示,平均检测等位基因数(N_a)为1.943 1,平均有效等位基因数(N_e)为1.381 08,64个样本的平均Nei’s基因多样性指数(H)为0.242 98,平均Shannon多样性指数(I)为0.385 83。64个样本遗传相似系数的变异范围为0.431 8～0.988 6。根据相似系数矩阵按UPGMA法进行聚类,在遗传相似性系数为0.715 5处,64份供试材料可分为6组;另外,根据10个ISSR引物的扩增结果,筛选出引物ISSR 20、UBC857和S17扩增的DNA指纹图谱可用于64个三叶青样本种质的鉴定。结论我国三叶青种质资源拥有丰富的遗传多样性和基因的相对稳定性,ISSR分析可揭示我国三叶青种质资源间的亲缘关系,为评价、鉴定和新品种选育提供一定的参考依据。     

三叶青扩展蛋白家族基因全长cDNA的克隆及其生物信息学和表达分析

目的克隆三叶青Tetrastigma hemsleyanum的扩展蛋白家族基因,对其进行器官表达分析,并初步探讨其功能。方法根据Gen Bank中登录的扩展蛋白基因保守区域序列设计1对简并引物,以三叶青球形块根c DNA为模板进行RT-PCR扩增,再结合RACE技术,获得三叶青扩展蛋白基因全长c DNA序列,命名为Th-exp。采用半定量RT-PCR和荧光定量PCR分析Th-exp基因在不同器官中的表达情况。结果克隆获得扩展蛋白家族基因,共782 bp,其中包含630 bp开放阅读框,编码209个氨基酸(Gen Bank登陆号KP693606)。Th-exp编码的蛋白质具有典型的扩展蛋白结构特征,N端含有8个半胱氨酸的结构域,C端含有4个保守的色氨酸结构域,中间含有组氨酸功能域。Blast分析显示,Th-exp与葡萄、醉蝶花中扩展蛋白基因具有相似性。半定量RT-PCR和荧光定量PCR分析表明,Th-exp在三叶青叶、茎、普通细根和球形块根中均有表达,但球形块根中表达强于其他器官。结论克隆得到三叶青扩展蛋白家族基因Th-exp全长c DNA,初步预测其参与了三叶青块根的发育过程。     

红花查耳酮异构酶基因植物表达载体的构建及拟南芥转化

目的构建红花查耳酮异构酶(CHI)基因的植物表达载体并在拟南芥中进行超表达验证该基因的功能。方法将已经分离的红花CHI基因作为目的基因,在其两端引入Bam H I和Eco R I酶切位点,构建含有35S启动子的植物超表达载体p BASTA-CHI,通过Flora-dip法将其转化到拟南芥中,并对转基因拟南芥T2代植株进行PCR和总黄酮量检测。结果转基因拟南芥T2代植株的PCR检测,红花CHI基因已经初步整合到拟南芥基因组中,黄酮量检测表明,转红花CHI基因的拟南芥比野生型拟南芥中的黄酮量有所提高,最高提高到2.3倍。结论成功构建了含有红花CHI基因的植物表达载体,并在拟南芥中进行超表达,获得了转基因拟南芥T2植株。     

基于多模式识别结合指纹图谱的三叶青产地鉴别比较研究

目的比较不同模式识别方法结合化学指纹图谱对不同产地三叶青Tetrastigma hemsleyanum的鉴别效果,提出三叶青产地鉴别的新方法。方法收集浙江、云南和贵州3个产区的72批三叶青样品,采集HPLC指纹图谱,标注18个共有峰,比较主成分分析、正交偏最小二乘法-判别分析和随机森林算法在处理不同产地样品复杂数据中的差异效果。结果 72批三叶青样品经主成分分析只能分为2类,正交偏最小二乘法-判别分析的结果优于主成分分析,随机森林法能将3个产区的样品完全分开。利用随机森林算法结合指纹图谱能有效地对不同产区的三叶青进行鉴别和区分。结论本研究可作为三叶青产区和质量控制的有效方法,为多指标的复杂指纹图谱鉴别不同产地药材提供有效的参考。     

基于灰色关联度法分析刺五加种子中胚率、内源激素和酶活力的相关性

目的:研究刺五加种子在层积过程中的内源激素含量、相关酶活力与胚率的相关性研究,为生产和科研中应用内源激素和相关生理指标来调控刺五加种子萌发提供理论依据。方法:采用刺五加内生真菌,不同浓度的一氧化氮和过氧化氢溶液进行浸种处理后对刺五加种子进行变温层积处理,利用高效液相色谱法测定刺五加种子中内源激素[赤霉素(GA3),脱落酸(ABA),吲哚乙酸(IAA),吲哚丁酸(IBA)及水杨酸(SA)]的含量,并且检测体内酶[过氧化氢酶(CAT),超氧化物歧化酶(SOD),过氧化物酶(POD),丙二醛(MDA)]活力变化。通过灰色关联度法探讨胚率和刺五加种子中激素和其酶活力的相关性。结果:胚率与IAA,GA3,CAT有显著正相关联,关联系数分别为1.086,0.935,1.067,IAA,GA3,CAT,IBA,SA之间存在显著的正相关性,与ABA,MDA,POD之间具有明显的负相关性,SOD的活性与其他含量之间无显著的相关性。关联度大小比较为IAA>CAT>GA3>IBA>SA>SOD>ABA>POD>MDA。结论:IAA,GA3,CAT对胚率有明显促进作用,激素含量与酶活力之间有明显的相关性,可为探讨刺五加种子萌发机制提供理论依据。     

三叶青种质资源遗传多样性的SSR荧光标记分析

目的研究三叶青64个种质的遗传多样性和亲缘关系。方法利用SSR荧光标记对其进行PCR扩增,利用POPGENE32软件分析三叶青64个种质的遗传多样性和亲缘关系,利用UPGMA法构建其亲缘关系树状图,利用NTSYS软件构建其主成分分析二维图和三维散点图。结果从14对引物中筛选出8对条带清晰、重复性好的引物,对64份供试材料的基因组DNA进行扩增。8个SSR标记的观察等位基因数(Na)变化范围为3～13,均值为7.875 0;有效等位基因数(Ne)变化范围为1.424 9～6.087 4,均值3.605 2;Shannon信息指数(I)变化范围为0.689 5～2.082 4,均值1.424 0;观测杂合度(Ho)变化范围为0.206 3～0.734 4,均值0.524 7;期望杂合度(He)变化范围为0.300 6～0.842 4,均值0.658 4;Nei’s基因多样性(H)0.298 2～0.835 7,均值0.653 2;多态信息含量(PIC)变化范围为0.288 0～0.817 5,均值0.614 5,遗传相似系数变化范围为0.115 4～0.954 5,遗传距离变化范围为0.000 0～3.218 1,说明64份三叶青种质亲缘关系较远,遗传分化程度较大。在遗传距离1.018 9处,64份三叶青种质可分为5大组。结论地理差异与种质遗传差异无必然联系。三叶青种质资源具有丰富的遗传多样性,SSR荧光标记分析结果可为三叶青种质资源的利用和品种选育提供一定的参考。     

内生真菌对刺五加种子萌发过程激素及酶含量变化的影响

目的研究内生真菌破除刺五加种子休眠的方法及其内源激素和酶的变化规律。方法用内生真菌侵染刺五加种子后对种子进行变温层积处理,利用高效液相色谱法测定刺五加种子中内源激素赤霉素(GA3)、脱落酸(ABA)、吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)及水杨酸(SA)的含量,并且检测体内酶[过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、丙二醛(MDA)]活力变化。结果 5株刺五加内生真菌对种子萌发有明显的促进作用,在变温层积过程中,GA3、IAA、IBA、SA均有不同程度的上升,ABA呈现明显的下降趋势。POD活力和MDA水平显著下降,CAT和SOD的酶活力显著上升。结论内生真菌可调控刺五加种子激素和酶的含量,促进种子萌发。     

马蓝BcASB基因的克隆、生物信息学及表达分析

目的克隆马蓝邻氨基苯甲酸合成酶(anthranilate synthase,AS)BcASB基因(GenBank登录号QCF61930.1),并对其进行生物信息学分析、时空表达分析以及检测马蓝有效成分靛蓝、靛玉红积累量随时间的变化。方法通过RT-PCR和RACE技术,克隆BcASB基因全长,应用生物信息学的方法对该基因编码的蛋白进行各种理化性质测定,二级结构和三级结构预测分析以及对核苷酸和氨基酸序列进行比对;利用qRT-PCR技术检测BcASB基因在马蓝不同器官(根、茎、叶)中的表达模式以及在外源诱导子茉莉酸甲酯(methyl-jasmonate,MeJA)、脱落酸(abscisic acid,ABA)、水杨酸(salicylic acid,SA)和乙烯利(ethylene,ETH)诱导下的表达情况;同时运用HPLC测定吲哚类生物碱靛蓝、靛玉红含量的变化情况。结果克隆获得BcASB基因,开放阅读框(open reading frame,ORF)长度为765 bp,编码256个氨基酸,生物信息学表明,该蛋白不含信号肽且无跨膜区,亚细胞结构定位于叶绿体;qRT-PCR检测结果表明,BcASB基因在马蓝叶和茎中的表达量较高,在根中表达较低;BcASB基因可响应不同外源诱导处理,而影响其转录;HPLC检测结果显示靛蓝、靛玉红含量有着明显的变化。结论成功克隆马蓝邻氨基苯甲酸合成酶BcASB基因,为进一步阐释该基因在马蓝吲哚类生物碱合成途径的作用及表达调控研究奠定基础。     

金荞麦查尔酮异构酶的基因克隆及其花期表达与黄酮量分析

目的 获取金荞麦总黄酮合成途径的关键酶查尔酮异构酶(chalcone isomerase,CHI)基因的全长序列,并进行序列分析;对花期金荞麦CHI基因在各组织中的表达与总黄酮量进行分析.方法 利用同源克隆技术获得金荞麦查尔酮异构酶基因(FdCHI)的cDNA序列;采用半定量RT-PCR对CHI表达量进行分析,并采用AlCl3法测量总黄酮量.结果 金荞麦FdCHI基因cDNA包含一个750 bp的ORF,编码249个氨基酸,命名为FdCHI.生物信息学分析表明该编码蛋白与其他植物CHI氨基酸序列同源率较高.FdCHI在花期金荞麦不同组织中的表达量分析表明,其表达量花＞根＞叶＞茎,总黄酮量为花＞叶＞茎＞根.结论 在金荞麦中首次获得CHI基因的cDNA序列,编码蛋白具有CHI同源蛋白的典型特征.FdCHI基因在金养麦茎、叶和花中的表达量与总黄酮量具有相关性,但在根中表达量与总黄酮量相关性较小.