实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应在脊髓灰质炎病毒型内鉴定中的应用

目的应用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(rRT-PCR)对脊髓灰质炎病毒(PV)进行型内鉴定,为进行常规rRT-PCR型内鉴定方法奠定基础。方法采用世界卫生组织(WHO)推荐的rRT-PCR方法,对WHO发放的PV株和实验室分离的PV株进行型内鉴定(ITD)和疫苗衍生PV株(VDPV)筛选。结果 ITD rRT-PCR的实验结果与毒株的VP1编码区序列测定结果完全相符,VDPV rRT-PCR的结果与VP1编码区序列测定结果大部分相符,但有2株Ⅱ型脊髓灰质炎疫苗类似株(SL)PV2-SL被错判为非疫苗类似株(NSL),假阳性率为3.03%;1株Ⅲ型SL被错判为NSL,假阳性率为1.92%。结论在新疆脊髓灰质炎实验室rRT-PCR可以应用于脊髓灰质炎病毒的常规监测及型内鉴定。     

新疆喀什市健康人群及环境污水中肠道病毒检测分析

目的研究肠道病毒在健康人群及环境水体中的分布情况,为指导脊髓灰质炎疫苗衍生病毒(VDPV)事件的调查处理,以及研究水中肠道病毒对公众健康带来的风险提供依据。方法选择新疆喀什市作为监测点,在同一个月份内采集150份健康人群粪便标本及1份污水处理厂入水口水样进行肠道病毒分离和鉴定。结果 150份粪便标本中,检出肠道病毒(EV)15株,阳性率10.0%;环境污水中检出肠道病毒(EV)11株,其中脊髓灰质炎病毒(PV)2株,埃可病毒(ECHOV)9株。结论新疆喀什市健康人群及环境污水中肠道病毒广泛存在,环境污水监测能了解脊髓灰质炎疫苗衍生病毒(VDPV)流行分布范围,有效指导VDPV事件的调查处理,同时也为进一步研究污水中肠道病毒为公众健康带来的风险提供重要的背景信息。     

脊髓灰质炎病毒检测方法的比较研究

目的比较不同的脊髓灰质炎病毒(Poliovirus,PV,以下简称脊灰病毒)检测方法,为选择合理的优化检测方案提供参考。方法选取广西壮族自治区柳州市1200名2～3月龄健康婴儿,分为IPV和OPV不同序贯免疫共12组,每组100人,按照0、28、56d免疫程序接种疫苗,随机抽取各组入组时前10%的受试对象在第二剂疫苗接种前和第二、三剂疫苗接种后第7、14、28d采集粪便标本,利用实时荧光定量PCR和细胞培养法对粪便中可能存在的PV进行初筛对比,对细胞培养法分离出的阳性标本,分别用中和试验、单克隆抗体间接ELISA法和逆转录-PCR鉴定其型别,并比较3种方法分型结果的一致性。结果实时荧光定量PCR检测PV阳性率为76.4%,细胞培养法为59.7%,差异有统计学意义(χ~2=32.998,P0.01)。中和试验、ELISA、RT-PCR 3种方法对细胞培养物中PV的检出率具有高度的一致性(Kappa0.8)且具有较高的鉴别诊断准确性(ROC曲线面积A接近1),分型结果差异无统计学意义(P0.05)。结论实时荧光定量PCR法对粪便中PV的检出率较细胞培养法高,但不能判断PV是否具有感染性。中和试验、ELISA、RT-PCR 3种方法对PV的分型一致性较高,可根据实验室和临床需求合理选择使用。     

实时荧光RT-PCR与细胞培养法在流感病毒检测中的应用

目的探讨实时荧光逆转录聚合酶链式反应(rRT-PCR)在流感病毒检测中的应用,并比较与常规细胞培养方法的差异,以确定两种检测方法各自更适合的应用领域。方法收集烟台市两所国家级哨点医院就诊的流感样病例(ILI)咽拭子标本,应用实时荧光RT-PCR检测流感病毒核酸,阳性标本用狗肾传代细胞(MDCK)培养、分离流感病毒,比较两种检测方法的灵敏度及相关性差异。结果在617份标本中,实时荧光RT-PCR检测阳性152份,阳性率为24.64%;MDCK细胞培养法分离流感病毒79株,阳性率为12.80%。两者的阳性率差异有统计学意义(χ2=28.38,P<0.01)。结论实时荧光RT-PCR和细胞培养方法检测流感病毒具有一致的特异性。实时荧光RT-PCR可作为一种快速有效的流感病毒核酸检测法,适用于公共卫生应急疫情的实验室快速诊断;细胞培养法作为流感病原学监测的基础,用于核实暴发疫情的实验室诊断,对病毒进行抗原性和基因特性分析。     

广东省1999年急性迟缓性麻痹相关肠道病毒的分型鉴定分析

目的运用分子生物学检测方法对从广东省1999年AFP(Acute Flaccid Paralysis)病例中分离到的28株非脊灰肠道病毒进行分型鉴定。方法采用简并引物RT-PCR对分离到的28株非脊灰肠道病毒进行目的基因片段扩增,然后序列测定,将测定结果与GenBank数据库进行BLAST比较分析,运用CLUSTALW进行同源性分析,并构建基因树。结果序列分析的结果表明,在AFP病例中除脊髓灰质炎病毒外,也分离到多种其它型别的肠道病毒,包括CA21、CA24、E7、E13、E11、E29、E25等15个型别,其中E13有5株,E7有4株,E21、E25、E27、E19、、E11、E14各2株,CA21、CA24、E2、E3、E20、E29、E30各1株。结论运用分子生物学检测方法可以对传统方法无法确定的肠道病毒进行分型鉴定,弄清非脊灰肠道病毒的血清型别,了解其流行规律。     

实时荧光定量PCR在手足口病肠道病毒快速检测中的应用

目的建立快速检测手足口病肠道病毒的实时荧光定量PCR法,并作出应用分析。方法采用卫生部《手足口病预防控制指南》(2008年版)推荐的RT-PCR法,对丽水市2008年4～5月间发生的172例临床诊断手足口病患者的324份标本进行人肠道病毒、柯萨奇病毒A组16型和肠道病毒EV71型特异性核酸的检测,同时采用实时荧光定量PCR法进行平行检测,比较两者的实验结果,分析实时荧光定量PCR方法的特异性和灵敏度。结果实时荧光定量PCR检测324份标本,肠道病毒通用核酸阳性70份,柯萨奇A16核酸阳性22份,肠道EV71病毒核酸阳性15份,与RT-PCR结果一致,符合率100%。结论实时荧光定量PCR法具有特异性强、灵敏度高等优点,是一种理想的手足口病肠道病毒的检测方法。     

基于VP1区基因序列测定的肠道病毒分型方法在手足口病病原鉴定中的应用

目的应用基于VP1区基因序列测定的分子分型方法鉴定手足口病相关肠道病毒病原型别。方法使用肠道病毒VP1区种属特异性,采用逆转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)方法扩增VP1区基因序列,对扩增产物进行序列测定,运用Chromas Pro1.7.6、MEGA 5.05等生物信息学软件进行序列核对及拼接,将序列提交肠道病毒分型网站(Enterovirus Genotyping Tool 0.5)鉴定型别。结果 40份其他肠道病毒(非EV-A71、非CVA16)核酸阳性的手足口病病例临床标本,先行采用商品化实时荧光RT-PCR试剂盒鉴定出31份柯萨奇病毒A组6型(CVA6)、2份柯萨奇病毒A组10型(CVA10);对其余待鉴定的7份样本,采用肠道病毒特异性引物进行VP1基因序列扩增和测序并分析,鉴定出柯萨奇病毒A组4型(CVA4)4株和A组9型(CVA9)、埃可病毒14(E-14)各1株,另1株为EV-A71。结论基于VP1区基因序列测定的肠道病毒分型方法具有较好的敏感性和简便、快速的特点,可用于手足口病及其他肠道病毒感染的实验室诊断和相关的研究。     

间日疟原虫环子孢子蛋白基因型的鉴别研究

[目的 ]建立间日疟原虫环子孢子蛋白 (CSP)基因分型法用于地理株的鉴定。[方法 ]Chelex 10 0离子交换法提取滤纸血样中的微量DNA ;套式PCR和等位特异PCR技术、琼脂糖电泳分析法、斑点印迹和Southern印迹 探针杂交技术分别用于判别性片段的扩增、分析和鉴定。[结果 ]用本文描述的套式 等位 特异PCR分型法 ,从一小片滤纸血样提取的微量DNA中 ,扩增出不同长度范围的 3种判别性片段 :6 5 0～ 770bp(间日疟种特异 ) ,15 0～2 30bp(温带族特异 ) ,5 88～ 6 15bp(PV 2型特异 )。用本法检测参考虫株出现的带型和长度与设计的靶序列完全吻合。检测 5 9份国内感染血样 ,42份鉴定为温带族虫株 ,15份为热带族虫株 ,2份为PV 2型虫株。 4份境外感染血样中 ,2个巴基斯坦分离株均为温带族 ,缅甸和老挝各 1株均为热带族虫株。 [结论 ]①本法能同时区分PV 1型 ,PV 2型以及温带族与热带族虫株 ,且较现有 (PCR 探针杂交 )法更为简便、快捷 ;②现场血样初步检测结果显示 :我国存在PV 1型 (温带族与热带族 )虫株和PV 2型虫株 ,也可能存在温带族东南亚组虫株。     

山东半岛地区贝类中诺如病毒污染状况与病毒鉴定初报

目的调查研究山东半岛沿海地区双壳贝类中诺如病毒污状况并对阳性株进行鉴定。方法应用常规RT-PCR与实时荧光定量RT-PCR,对2007年9月到2008年8月间在山东半岛沿海8个地区收集的186份双壳贝类样品进行了诺如病毒的定性和定量检测,并对阳性株核酸片段进行克隆、转化和序列分析,使用DNAStar软件进行核酸序列同源性比较,经MEGA4绘制系统进化树。结果 186份样品中检出5份诺如病毒阳性,检出率为2.67%,诺如病毒含量为大于102拷贝RNA,序列分析与遗传进化树显示5份诺如病毒阳性株均为GGII型NVs,与国内报道的GGII型毒株同源性达到98%以上。结论山东半岛地区贝类中含有的诺如病毒以GGII型为主,冬季检出率较高。     

3种方法对发热伴血小板减少综合征检测结果比较

目的 采用实时荧光PCR法、酶联免疫吸附法及细胞培养分离病毒株的方法,对2013年临床疑似发热伴血小板减少综合征患者急性期血进行检测比较,寻求快速、准确的鉴定新布尼亚病毒感染的方法。方法 对180例临床疑似病例的急性期血液首先采用实时荧光PCR法检测,筛选出新布尼亚病毒核酸阳性的样本,同时将阳性样本采用酶联免疫吸附的方法检测抗体及采用VERO-E6细胞培养的方法分离病毒株。结果 180份样本经实时荧光PCR法检测,阳性率为42.78%(77/180 Ct值≤35曲线形态与阳性对照一致呈S型的),ELISA方法检测抗体阳性率为44.16%(34/77),将核酸检测阳性的77份样本全部感染VERO-E6细胞获得病毒株32株,阳性率为38.55%(32/77)。结论 实时荧光PCR法更适合于新布尼亚病毒感染者早期实验室快速诊断,发病在1w左右的病例不适合用ELISA的方法做确证实验。细胞培养分离病毒虽然是金标准,但耗时、费力,对早期诊断意义不大,但适于研究或疫苗研发。     

实时荧光RT-PCR与普通RT-PCR检测手足口病病原体的比较分析

目的对比分析实时荧光RT-PCR和普通RT-PCR方法在检测手足口病病原体的差别。方法选择临床诊断为手足口病患者粪便256份,提取RNA,用实时荧光RT-PCR和普通RT-PCR检测手足口病肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A组16型(CoxA 16)和总肠道病毒(PE),对实验结果进行统计学分析。结果实时荧光RT-PCR和普通RT-PCR检测手足口病患者粪便标本,CoxA 16结果差异有统计学意义(P<0.01),CoxA 16阳性率分别为62.22%和16.67%;EV71、PE结果差异无统计学意义(P>0.05),实时荧光RT-PCR方法EV71和PE阳性率为42.22%和65.00%,普通RT-PCR方法为37.78%和55.00%。普通RT-PCR检测的36份EV71、CoxA 16和PE全阴性标本,荧光RT-PCR方法检出PE阳性9份、EV71阳性4份、CoxA 16阳性14份。结论实时荧光RT-PCR方法比普通RT-PCR方法更灵敏、快捷,适用于临床手足口病病原体的检测。     

鼠类携带淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的建立检测鼠类携带淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（lymphocytic choriomeningitis virus,LCMV）的实时荧光定量RT-PCR方法。方法根据LCMV核蛋白编码基因序列设计合成特异性引物对和TaqMan荧光探针,经优化反应体系和条件,建立LCMV实时荧光定量RT-PCR检测方法,然后进行灵敏度、特异性和重复性试验,并对79份宁波口岸捕获的鼠样品进行检测。结果建立实时荧光定量RT-PCR方法对鼠肺总RNA检测的灵敏度为20pg,是常规PCR方法的100倍;试验的重复性良好,CV值为0.85%;试验的特异性为100%。用该方法检测79份鼠样品有3份LCMV阳性,与常规RT-PCR结果一致。结论成功建立了鼠LCMV实时荧光定量RT-PCR检测方法,对于监测和防控鼠传LCM有重要意义。     

大连市“蜱咬”患者新布尼亚病毒(SFTSV)的检测分析

目的 通过对大连市一起“蜱咬”患者流行病学调查及病原体检测,探讨新布尼亚病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus, SFTSV)在辽宁省南部沿海地区的流行范围。方法 采用ELISA方法对“蜱咬”患者急性期血清样本及同居住地的26份非患者血清样本进行SFTSV的IgM、IgG抗体检测;采用实时荧光定量RT-PCR方法检测“蜱咬”患者血液样本SFTSV核酸;采用VERO-E6细胞对“蜱咬”患者血液样本进行病毒分离并鉴定。结果 “蜱咬”患者急性期血清样本SFTSV的IgM抗体阳性、IgG抗体阴性;26份非患者血清样本中4份SFTSV的IgG抗体阳性;“蜱咬”患者血液样本SFTSV核酸阳性;从“蜱咬”患者血液样本和体表叮咬的蜱虫中各分离出1株病毒,经SFTSV的M片段全基因测序引物测序鉴定为SFTSV。结论 “蜱咬”患者血液分离株与蜱虫分离株均为SFTSV,同源性达99.7%,该病毒是导致患者发病的重要原因。本次分离到的2株病毒与我省东部(丹东、抚顺),北部(铁岭)山区分离株遗传距离相对较远。SFTSV在正常人群中存在隐性感染者。     

炎症性肠病与肠道息肉感染致泻性大肠埃希菌实验室检测方法分析

目的 分析炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)患者和肠道息肉患者感染致泻性大肠埃希菌(diarrheagenic Escherichia coli, DEC)实验室检测方法，为该类疾病诊断提供实验室依据。方法 收集2019年1月1日至2020年12月31日我院消化内科130例IBD患者(IBD组)和79例肠道息肉患者(息肉组)的大便，常规方法培养分离大肠埃希菌，用VITEK Compact 2全自动细菌分析仪和VITEK MS全自动快速微生物质谱检测系统鉴定到种，血清学和分子生物学鉴定DEC分型。结果 大肠埃希菌分离率IBD组高于肠道息肉组(P=0.028)。肠道分离大肠埃希菌性别分布IBD组与息肉组比较，差异无统计学意义(P=0.216),年龄分布差异有统计学意义(P=0.023)。大肠埃希菌在麦康凯平板分解乳糖能力IBD组与息肉组比较，差异无统计学意义(P=0.112)。采用血清学和实时荧光PCR方法进行DEC分型鉴定，实时荧光PCR阳性14株，血清学阳性13株，血清学和实时荧光PCR分型同时阳性4株。血清学与实时荧光PCR法分型鉴定同时阴性...     

严重急性呼吸综合征病原体的检测方法探讨

目的 在实验室建立SARS病原学检测方法。方法 采集临床诊断为SARS患者、疑似病人漱口液、用细胞培养分离,荧光定量PCR方法检测。病原体用间接免疫荧光鉴定。结果 漱口液、咽拭子液样本57份作病原体分离,阳性数5份,阳性率8.8％尸解标本7份,其中肺部组织3份、气管黏液、淋巴液、肺积液、心包液各1份。结果细胞分离到7株病原体。阳性率100％。荧光定量PCR方法检测临床确诊SARS患者标本57份,检出阳性结果38份,阳性率为66.7％。密切接触者标本14份,检出阳性结果7份,阳性率为50.0％。疑似患者标本59份中检出阳性12份,阳性率为20.3％。两种方法的比较,统计学上有显著性差异(P<0.001)。结论用荧光定量PCR方法检测SARS患者病原体敏感性高,可靠性和重复性好,优于细胞病毒分离的方法,可以作为SARS临床早期诊断和流行病学调查的重要指标之一。     

2007年浙江丽水地区汉坦病毒的分离与型别鉴定

目的对2007年从浙江省丽水地区肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)疫区鼠肺分离的汉坦病毒进行型别鉴定和分子生物学特性研究。方法将汉坦病毒抗原阳性的鼠肺标本接种Vero-E6细胞,分离汉坦病毒。提取病毒总RNA,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增病毒S基因全片段,克隆入质粒载体,进行核苷酸序列测定及分析,应用DNA STAR软件分析比较,确定病毒型别。结果从疫区7份阳性鼠肺中分离到2株汉坦病毒,经汉坦病毒单克隆直接荧光血清检查和基因序列测定,结果为汉滩型(HTN)病毒,2株病毒与国际标准株76-118(HTN型)和80-39(SEO型)S片段核苷酸的同源性分别为84.7%、84.6%和64.2%、64.0%。结论浙江省丽水地区可能存在以HTN型病毒为主的肾综合征出血热自然疫源地。     

丽江市古城区首次证实一起鼠间鼠疫疫情北大核心CSCD

目的对丽江市古城区的一起鼠间鼠疫进行判定。方法对1份干燥自毙大绒鼠标本进行鼠疫反相间接血凝抑制试验(RIHA)、聚合酶链式反应(PCR)及实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测。结果该标本经免疫学检测、PCR及RT-PCR检测均为阳性。结论确认丽江市古城区鼠间鼠疫疫情。     

江西省高安市两株汉城病毒分离鉴定及全基因组序列分析

目的 对2021年江西省高安市采集的鼠肺样本进行肾综合征出血热汉坦病毒分离鉴定及全基因组序列进行分析.方法 采用Vero-E6细胞分离肾综合征出血热汉坦病毒,采用实时荧光RT-PCR法和直接免疫荧光法对分离株进行鉴定,采用高通量测序技术对分离株进行全基因组测序,采用CLC、MEGA7.0等软件对基因组序列进行分析.结果...     

实时荧光PCR法快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

目的:评价一种直接从标本中快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的实时荧光PCR方法。方法:临床送检标本中筛选出46份金黄色葡萄球菌阳性的标本,进行实时荧光聚合酶链反应(PCR)检测,并与全自动细菌鉴定仪(VITEK-2Compact)/头孢西丁纸片扩散法进行比较,评价实时荧光PCR方法的敏感性及特异性。结果:VITEK-2Compact分离出金黄色葡萄球菌46株,其中MRSA 12株,与头孢西丁纸片扩散法结果一致。实时荧光PCR法检测出金黄色葡萄球菌46株,其中MRSA 13株,敏感性及特异性分别为100%(95%CI,75.75,100),97.06%(95%CI,85.08,99.48)。2种方法有很好的一致性[Kappa=0.945(95%CI,0.839,1.000)]。结论:实时荧光PCR法是一种能从标本中直接检测MRSA的快速,敏感的方法。     

ECHO20病毒株KM/EV20/2010的分离鉴定及其VP1基因序列特征分析

目的分离并鉴定2010年云南省昆明市甲型肝炎患儿粪便标本中混存的ECHO20(Echovirus 20,ECHO20)KM/EV20/2010病毒株,分析其VP1基因遗传特征。方法采用KMB17细胞对大便标本进行病毒分离;采用微量细胞病变法,经WHO肠道病毒组合血清及单价血清对该分离株进行鉴定;采用RT-PCR法扩增病毒VP1基因并进行序列测定,并运用Mega 4.0等软件进行分析处理。结果分离毒株经微量中和试验鉴定为ECHO20血清型,编号为KM/EV20/2010;经RT-PCR法扩增获得为867bp的VP1基因,与国内分离株核苷酸和氨基酸的同源性分别为79.5%~91.7%和98.9%~99.6%,与国外分离株的核苷酸和氨基酸同源性分别为80.2%~83.2%和96.4%~99.6%;在进化树上云南分离株与GenBank中登录的中国国内2001年山东分离株01352和1998年法国分离株94CF1666形成一个进化分支。结论 KM/EV20/2010分离株为肠道病毒ECHO20型病毒,可用KMB17人二倍体胚肺成纤维细胞分离增殖。