鼻咽癌低分化细胞系CNE-2双向凝胶电泳图谱的建立

目的：建立人鼻咽癌低分化细胞系CNE-2双向凝胶电泳图谱,初步分析其蛋白质表达情况。方法：采用双向凝胶电泳（2-DE）分离人鼻咽癌低分化细胞系CNE-2总蛋白,银染显色,Image Master图象分析系统分析,从胶中选取分离较好的蛋白质点,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）分析获取肽质量指纹图谱（PMF）,Mascot软件搜索MSDB和SWISS-PROT数据库鉴定蛋白质。结果：获得重复性和分辨率较好的CNE-2双向凝胶电泳图谱;质谱分析了78个蛋白质点,获取77张肽质量指纹图谱,通过查询数据库鉴定了48个蛋白质。结论：建立了人鼻咽癌低分化细胞系CNE-2双向凝胶电泳图谱,并应用质谱技术鉴定了部分蛋白质点,为人鼻咽癌蛋白质组数据库的建立提供了有意义的数据。     

纯化内耳组织抗原免疫致豚鼠自身免疫性梅尼埃病的实验研究

目的: 探讨4种纯化的内耳抗原免疫致梅尼埃病样内耳病变的情况,从而了解各抗原的致病性,并明确其在内耳的分布情况.方法: 70只豚鼠随机分成A、B、C、D、E 5组(A组10只,余4组各15只),以豚鼠内耳组织抗原的4种亚组分(相对分子质量依次为28 000、42 000、58 000和68 000)作为抗原,依次免疫B、C、D和E组豚鼠,观察听觉功能、前庭功能、血清特异性抗体水平和内耳形态学的改变,并应用免疫组化方法确定其在耳蜗的分布和表达.结果: 免疫前后A(对照)、B组平均听阈无显著性差异,亦未见明显的内耳病理形态学改变.免疫后B、C、D、E组血清特异性抗体水平显著升高.免疫后B组未发现听损动物,C组3只动物(4耳)、D组4只动物(6耳)、E组4只动物(6耳)出现听损,部分听损耳出现膜迷路积水和螺旋神经节细胞减少.免疫组化显示68 000蛋白抗体主要分布于血管纹,Corti器也有少量分布;28 000蛋白抗体主要分布于螺旋神经节;42 000和58 000蛋白则在螺旋神经节、血管纹和螺旋韧带部位均有分布.结论: 粗制内耳抗原中42 000、58 000和68 000亚组分均能独立诱发自身免疫性梅尼埃病样内耳病变,实验性自身免疫性梅尼埃病的致病内耳抗原组分可能并非一种.     

脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证蛋白质组学比较研究

目的 建立脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证血清双向凝胶电泳图谱,初步分析其差异蛋白质表达情况.方法 双向凝胶电泳(2-DE)分离脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证血清标本,考马斯亮兰染色,PD-QUEST图像分析系统分析,从凝胶中选取分离较好的蛋白质点,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析获取肽质量指纹图谱(PMF),Mascot软件搜索SWISS-PROT数据库鉴定蛋白质,对差异蛋白质进行组间对比.结果 获得了分辨率较好的脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证双向凝胶电泳图谱,质谱分析了29个差异蛋白质点,获取了87张肽质量指纹图谱,通过查询数据库鉴定了29个蛋白质,其中部分蛋白质与肝阳化风证及阴虚风动证发生发展有关.结论 建立了脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证血清双向凝胶电泳图谱,并应用质谱技术鉴定了部分差异蛋白质点,为脑梗死肝阳上亢证与阴虚风动证与正常组血清双向凝胶电泳图谱血清蛋白质组数据库的建立提供了有意义的数据,并认为蛋白质组学能在脑梗死不同证型具有代表意义.     

血清蛋白双向凝胶电泳-质谱分析诊断早期肺腺癌的临床研究

目的分析肺腺癌患者与正常人血清双向凝胶电泳的差异蛋白质,从而寻找肺腺癌早期特异性的诊断指标。方法用固相IPG梯度双向凝胶电泳分离肺腺癌患者及正常人血清总蛋白,用PDQuest凝胶图像软件分析,以识别差异蛋白质点。用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI—TOF—MS）分析获得肽质量指纹图,然后利用Mascot查询软件搜寻数据库鉴定蛋白质。结果①获得了重复性较好的双向电泳银染图谱。②经PDQuest7．1软件匹配分析,共筛选出22个差异的蛋白点,对7个差异蛋白点进行胶内原位酶解-质谱指纹图分析,获得了7张肽质量指纹图谱,查询数据库鉴定出1个蛋白质-血清淀粉样蛋白A（SAA）。结论①固相pH梯度双向凝胶电泳分离血清总蛋白获得了重复性较好的双向电泳凝胶图谱。②肺腺癌患者血清和正常人血清的蛋白质组表达存在明显差异,这些差异蛋白点为进一步建立人肺癌的2-DE数据库奠定了基础。③SAA蛋白很可能是肺癌的一个潜在标志物。     

喉鳞形细胞癌比较蛋白质组的初步研究

目的:研究喉癌及癌旁喉正常黏膜组织蛋白质组的差异表达.方法:用固相pH梯度双向凝胶电泳分离喉癌及癌旁喉正常黏膜组织总蛋白质,考马斯亮蓝染色显色、ImageMaster 2D软件分析所获得的双向凝胶电泳图谱,找出差异表达的蛋白质点.取差异表达的蛋白质点进行质谱鉴定.结果:获得分辨率和重复性均较好的双向凝胶电泳图谱,并找出在喉癌和癌旁喉正常黏膜组织差异表达的33种蛋白质.其中有22种蛋白质在喉癌组织中表达上凋,11种蛋白质表达明显下调.随机取10个在喉癌组织中表达上调的蛋白点进行质谱指纹图分析,查询数据库初步鉴定出了8个蛋白质.结论:本研究建立了分辨率和重复性较强的喉癌及喉正常黏膜组织蛋白质组表达图谱,且两者蛋白质的表达明显不同,差异表达的蛋白质可能成为潜在的诊断喉癌的肿瘤标志物和治疗靶分子,对探讨喉癌的发生机制有重要意义.     

结肠癌组织蛋白质组成分的双向凝胶电泳分析

目的 分析结肠癌病人癌组织、癌旁组织及正常结肠黏膜组织双向凝胶电泳的蛋白质表达图谱,寻找差异表达的蛋白质.方法 采用固相pH梯度双向凝胶电泳分离结肠癌病人配对癌组织、癌旁组织及正常结肠黏膜组织的总蛋白,银染显色,PDQuest 2DE软件分析差异表达的蛋白质点.结果 获得了重复性较好的双向凝胶电泳银染图谱.图像分析显示,3组胶的平均匹配率分别为:癌组织87.3%、癌旁组织80.3%、正常结肠黏膜组织84.0%.等电聚焦方向上的平均偏差为(1.16±0.29)mm,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方向上的平均偏差为(1.00±0.38)mm.差异分析共获得164个差异表达的蛋白质点.结论 双向凝胶电泳分离结肠癌组织的总蛋白可获得重复性较好的结果.获得的差异蛋白质点为寻找结肠癌早期诊断的分子标记物提供了理论依据.     

联用2-DE和MALDI-TOF-MS技术筛查胃癌组织和血清中的差异蛋白质

目的 分别建立肠型、弥漫型胃癌组织和血清双向凝胶电泳图谱,鉴定差异表达蛋白,从中发现有意义的胃癌肿瘤相关标志物.方法 采用双向凝胶电泳（two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis,2-DE）分离组织和血清总蛋白,经硝酸银染色,分析选取有表达差异的蛋白质点,通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS）鉴定差异蛋白.结果 获得重复性和分辨率较好的胃癌组织和血清双向凝胶电泳图谱,经MALDI-TOF-MS鉴定得到20种蛋白,在7例（58.3%）肠型胃癌组织中均有硒结合蛋白1（SBP1）表达,KIAA基因家族蛋白在弥漫型胃癌组织和血清中均有表达.结论 建立了弥漫型肠型胃癌组织和血清双向凝胶电泳图谱,获得了差异蛋白质点,为寻找胃癌的特异蛋白质作为胃癌肿瘤标志物奠定了基础.     

卵巢癌组织的差异蛋白质研究

目的分析卵巢癌患者癌组织、癌旁组织及正常卵巢黏膜组织双向凝胶电泳的蛋白质表达图谱,寻找差异表达的蛋白质。方法采用固相pH梯度双向凝胶电泳分离卵巢癌患者配对癌组织、癌旁组织及正常卵巢黏膜组织的总蛋白,银染显色,PDQuest2DE软件分析差异表达的蛋白质点;凝胶经银染显色后,Bio-Rad凝胶扫描仪扫描,Imagemaster图像软件分析,差异蛋白质点用基质辅助激光解析电离-两级飞行时间串联质谱法进行鉴定。结果获得了重复性较好的双向凝胶电泳银染图谱。3组胶的平均匹配率分别为：癌组织83.4%、癌旁组织81.2%、正常卵巢黏膜组织88.1%。斑点位置偏差等电聚焦方向上为（1.21±0.27）mm,SDS-PAGE方向上为（1.03±0.28）mm。差异分析共获得164个差异表达的蛋白质点;有差异性表达的8种蛋白质中有4种为结合珠蛋白的亚型。结论双向凝胶电泳-质谱技术能分离卵巢癌组织的总蛋白,并获得重复性较好的结果;结合珠蛋白能为诊断卵巢癌提供诊断手段。     

先天性巨结肠组织蛋白质组成分的双向凝胶电泳分析

目的 分析先天性巨结肠(HD)狭窄段及正常段肠管组织双向凝胶电泳的蛋白质表达图谱,寻找差异表达的蛋白质.方法 采用固相pH梯度双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2-DE)分离20例HD患者配对狭窄段及正常段肠管组织的总蛋白,银染显色,ImageMaster 2D Platinum 6.0软件分析差异表达的蛋白质点.结果 获得了重复性较好的2-DE银染图谱.图像分析显示,狭窄段和正常段肠管组织凝胶的平均匹配率分别为78.1%和86.7%.差异分析共获得103个差异表达的蛋白质点.结论 采用2-DE分离HD肠管组织的总蛋白可获得重复性较好的结果.获得的差异蛋白质点为寻找HD早期诊断的分子标记物提供了基础资料.     

不同分化喉鳞状细胞癌蛋白质组差异表达的研究

目的 研究不同分化程度喉鳞状细胞癌黏膜组织蛋白质组的差异表达.方法 用固相pH梯度双向凝胶电泳分离不同分化程度喉癌黏膜组织总蛋白质,行考马斯亮蓝染色,Image Master 2D软件分析所获得的双向凝胶电泳图谱,找出差异表达的蛋白质点.结果 获得分辨率和重复性均较好的双向凝胶电泳图谱,发现13种蛋白质与喉癌分化密切相关.其中有7种蛋白质在高分化喉癌组织中表达上调,6种蛋白质表达明显下调.结论 利用固相pH梯度双向凝胶电泳技术分离不同分化喉鳞状细胞癌黏膜组织总蛋白质,建立了重复性较强的不同分化喉鳞状细胞癌黏膜组织蛋白质组表达图谱,且两者蛋白质的表达明显不同,可能与喉癌不同分化程度的发病机制有关.     

紫外线照射前后日本血吸虫尾蚴抗原的初步分析

目的：探讨日本血吸虫尾蚴经紫外线（UV）照射后抗原成分的改变。方法：日本血吸虫尾蚴经UV（400uW/cm^2)照射1min后，取其可溶性抗原经照射尾蚴抗原（UVCA）与未经照射的尾蚴可溶性抗原（NCA）同步进行SDS－PAGE和免疫印迹试验。结果：经UV照射后，日本血吸虫尾缦新出现了Mr212000和82000抗原带，Mr116000,26000和16000抗原带浓度明显升高，NCA的M，67000分子仅能被UVCA免疫猪血清识别，而不能被感染猪血清识别，Mr79000和94000与免疫猪血清的反应也明显强于感染猪血清，结论：UV照射后新出现或含量增加的抗原成分以及仅免疫猪血清所别的抗原分子可能是照射尾蚴激发高度保护性免疫的主要因素。     

胎儿内耳膜迷路蛋白的提取及电泳分析

使用含０．１％十二烷基磺酸钠（ＳＤＳ），５％二巯基乙醇（β－ＭＥ）和１０％甘油的提取液制备 胎儿内耳膜迷路蛋白，并采用十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）技术分析其蛋白 组成。结果：胎儿内耳膜迷路蛋白 Ｍｒ为 １３６ ０００、６８ ０００、６２ ０００、５５ ０００、５０ ０００、４３ ０００、３２ ０００、 ３０ ０００等。结果为进一步分析，纯化内耳特异性抗原，为临床采用免疫印迹法检测抗内耳组织自身 抗体提供了可能。     

人大肠癌不同转移潜能细胞株SW620及SW480的差异蛋白质组分析

目的 分析比较人大肠癌不同转移潜能细胞株的差异表达蛋白质图谱,筛选并探讨肿瘤转移相关蛋白与大肠癌发生发展转移的关系。方法 利用双向凝胶电泳(2-DE)和基质辅助激光解析离子化-飞行时间-质谱技术,分析高低转移性细胞株SW620和SW480蛋白质图谱的差异表达,查询数据库筛选大肠癌转移相关蛋白质。结果 MalenieⅢ软件分析3次相同条件下的2-DE图谱,结果显示重复性、匹配性较好。SW620检测到(1316±62)个蛋白点,平均匹配率82%;SW480检测到(1332±74)个蛋白点,平均匹配率80%;蛋白点分布以PI4~7、相对分子质量20000~70000范围内最多。两种细胞株25个差异蛋白点(SW62014个、SW48011个)胰酶胶内酶解、质谱分析获得23张肽质量指纹谱;数据库查询结果高度匹配已知蛋白质3个,初步匹配已知蛋白质或片段14个。在这些差异表达的蛋白质中,部分与基因转录、细胞周期、信号转导、细胞凋亡有关,可能参与大肠癌的分化、增殖、侵袭、黏附和转移等多种生物学行为。结论 人大肠癌不同转移潜能细胞株SW620和SW480的2-DE蛋白质图谱具有明显的差异表达,提示大肠癌转移过程的发生是多种蛋白质功能共同作用的结果。     

Analysis of Protoscoleces-specific Antigens from Echinococcus Granulosus with Proteomics Combined with Western Blot

ObjectiveTo establish and optimize the proteomic analysis of protoscoleces-specific antigens from Echinococcus granulosus. To provide a foundation for identifying specific antigens in the soluble proteins of E. granulosus protoscoleces for further research.MethodsBrood capsules were collected aseptically from fertile E. granulosus cysts from the livers of an infected patient. The fertile E. granulosus cysts were fractured, and protoscoleces were collected by centrifugation. The soluble proteins of protoscoleces were acquired using the 2D Quant kit according to the manufacturer's instructions. We employed two-dimensional electrophoresis (2-DE) combined with immunoblot assay (Western blot) to analyze the soluble components of E. granulosus protoscoleces antigens. The 2-DE and immunoblot maps obtained were analyzed with PDQuest 8.0 image analysis software.ResultsAbout 233 soluble protein spots were identified with Coomassie-stained gels. Most of the proteins had a molecular weight of 16 000 Da to 117 000 Da, and an isoelectric point value of 3.0 to 10.0. 2-DE immunoblot was conducted and 57 specific antigen spots were observed, among which 23 spots were identified.Conclusion2-DE combined with Western blot is the key to successful proteomic analysis and presents a new possibility for searching the specific E. granulosus protoscoleces antigens.     

双向电泳和质谱技术分析HCV NS3转化肝细胞的蛋白质组

目的:持续感染丙型肝炎病毒(HCV)在肝细胞癌(HCC)发生中起重要作用,细胞转染和成瘤实验表明HCV NS3对人肝细胞具有转化作用和致瘤活性.本实验旨在探讨HCV非结构蛋白3(NS3)转化肝细胞的蛋白质组.方法:构建稳定表达HCV NS3 N端多肽的人肝细胞(pRcHCNS3/QSG)及空白质粒转染细胞(pRcCMV/QSG),双向电泳技术分离两种细胞的总蛋白,差异蛋白质点进行质谱分析,Western印迹验证蛋白表达差异.结果:得到分辨率较高、重复性较好的双向电泳图谱.pRcHCNS3/QSG和pRcCMV/QSG细胞的蛋白质斑点数分别为(1 183±77)和(1 095±82)个,两组平均匹配数为(920±60)个.初步鉴定出15个有意义的蛋白质点.其中Ras,P38,HD53等参与调节信号转导的蛋白在pRcHCNS3/QSG细胞中表达上调,Western印迹结果亦证实pRcHCNS3/QSG细胞中磷酸化的P44/42和P38表达增加.鉴定出的差异蛋白质还包括一些调节细胞周期、免疫反应、与肿瘤侵袭和转移相关的蛋白质及参与肝脏代谢的蛋白质.结论:HCV NS3可能通过影响多种蛋白表达,经相应信号转导途径,如丝裂原活化蛋白激酶途径,使细胞发生恶性转化.进一步弄清信号转导过程和相互关系不仅对了解HCV相关性HCC的发生机制有重要意义,而且为从分子水平治疗HCC提供新思路.     

自身免疫性感音神经性聋豚鼠的子代内耳生理功能研究

目的 :观察自身免疫性感音神经性聋 (ASHL)母豚鼠所产子代内耳生理功能的变化 ,探讨针对内耳的自身免疫因素对子代内耳生理功能的影响及其改变特点。方法 :同种内耳抗原 (CIEAg)持续免疫孕豚鼠 ,采用耳蜗电图 (记录cAP、CM )和眼震电图仪 (记录自发性眼震和冷热空气试验 )测试母鼠和子鼠的听觉和前庭功能 ,并检测血清特异性体液免疫反应。结果 :ASHL模型母豚鼠所产子鼠血清中发现有特异性抗体水平升高 ,部分 (3 /9)出现听觉损伤。非ASHL母鼠和对照组母鼠所产子代未见明显异常。结论 :ASHL雌鼠所产子代可出现感音神经性聋 ,其内耳损伤和功能障碍极可能与针对内耳组织的自身免疫反应 (尤其是体液免疫 )有关 ,从而提示内耳自身免疫因素可能为部分先天性非遗传性感音神经性聋的病因之一。     

IL-10基因内耳局部治疗自身免疫性感音神经性聋的实验研究

目的:探索局部应用IL-10基因与慢病毒重组载体对实验性自身免疫性感音神经性聋(ASNHL)的治疗作用。方法:采用纯化同种内耳抗原免疫豚鼠,造成ASNHL动物模型,再将重组载体分别经鼓阶、内淋巴囊和圆窗龛局部注射或渗透,观察听觉功能和内耳病理形态学变化,同时行免疫组织化学试验了解慢病毒转染和基因产物在内耳的分布。结果:治疗前后ABRⅢ波阈值的均值对比分析结果显示,各实验组局部基因治疗后均降低;治疗后各实验组组间比较差异无统计学意义。慢病毒主要转染部位是血管纹、Corti器、蜗轴小血管周围及其内淋巴囊等处。基因产物表达部位与转染部位基本相同。结论:重组载体经不同途径均可转导入内耳,并在内耳表达基因产物,对ASNHL发挥有效的治疗作用。     

糖尿病肾病差异蛋白质组分析

目的:利用弱阳离子磁珠纯化(magnetic beads based weak cation exchange chromatography,MB-WCX)系统结合基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)的方法获取糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)的尿小分子差异多肽谱?方法:按Mogensen标准,根据3 d平均微量白蛋白尿排泄率,将68例2型糖尿病患者分组,其中正常蛋白尿(DM1)组24例,微量白蛋白(DM2)组22例,大量蛋白(DM3)组22例;健康对照(C)组20例?DM1及DM2组肾小球率过滤(glomerular filtration rate,GFR)均> 90 ml/(min·1.73 m2),DM3组GFR为60~89 ml/(min·1.73 m2)?采用MB-WCX试剂盒富集尿多肽,再经MALDI-TOF-MS技术,采集尿液多肽谱,应用ClinProtTM软件进行生物学比较分析?结果:质荷比 < 12 000时,DM1组与C组相比,有15个蛋白质峰差异有统计学意义(P < 0.01)?DM2组与C组相比,有1个蛋白质峰差异有统计学意义(P = 0.029 8)?DM3组与C组相比,有10个蛋白质峰差异有统计学意义(P < 0.01)?结论:MB-WCX系统联合MALDI-TOF-MS蛋白质检测技术,能够获得健康人及DN患者尿液小分子多肽谱,为进一步从中寻找早期筛查的标志物提供基础?     

自身免疫性感音神经性聋豚鼠子代的内耳功能与形态学研究

目的:观察自身免疫性感音神经性聋(ASNHL)雌性豚鼠子代内耳听觉生理功能及组织结构病理变化,探讨内耳自身免疫因素与子代内耳听觉损伤的相关性。方法:采用同种粗制内耳抗原(CIEAgs)免疫,造成雌性豚鼠ASNHL,妊娠后持续抗原强化免疫,对其所产子鼠进行相关指标测试和观察,包括听神经复合动作电位阈值、幅值和耳蜗微音器电位伪阈,血清抗CIEAgs抗体水平以及内耳病理形态学观察。结果:ASNHL雌鼠的子代36只中有18只(22耳)出现听力损伤,血清抗CIEAgs抗体增高,螺旋神经节细胞变性,数目减少,蜗螺旋管内炎性细胞浸润。结论:ASNHL所产子鼠可出现先天性感音神经性聋和内耳病理损伤,其发生可能与特异性体液免疫有关。