LETM1基因真核表达载体的构建

[目的]构建线粒体LETM1基因真核表达载体．[方法]从肾癌细胞株293T细胞中提取mRNA及合成cDNA,设计并合成线粒体LETM1基因引物,用PCR方法扩增LETM1基因,连接到真核表达载体pCMV-3Tag-6上,构建重组质粒pCMV-3Tag—LETM1,经酶切和测定序列进行鉴定．[结果]构建了重组质粒pCMV-3Tag—LETM1．[结论]成功地构建了线粒体LETM1真核表达载体．     

ADAM9在肺癌组织中的异常表达

去整合素-金属蛋白酶9(ADAM9)在多种恶性肿瘤组织中高表达,与肿瘤侵袭转移及预后不良密切相关;但ADAM9在肺癌组织中的表达及意义尚不清楚.本研究发现,与正常对照肺组织相比,ADAM9在非小细胞肺癌组织中的表达显著增高,提示ADAM9在肺癌的发生发展中起重要作用.     

小鼠CD40Ig基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的：构建含小鼠CD40Ig基因的真核表达载体，为诱导供体特异性移植物的免疫耐受的基因治疗作准备。方法：以小鼠脾脏总RNA为模板，以RT-PCR法克隆小鼠CD40胞外段cDNA及IgG2a Fc段cDNA；另以pEGFP-N1质粒为模板获得绿色荧光蛋白（GFP）基因。将所得基因片段插入真核表达载体pDC516中得到重组质粒pDC516-CD40-IgG-GFP，测序鉴定正确后，用脂质体2000将其转染人胚肾上皮细胞（HEK293细胞），荧光显微镜下观察融合蛋白的表达。结果：成功构建了小鼠CD40Ig基因真核表达质粒pDC516-CD40-IgG-GFP，并在HEK293细胞中实现表达。结论：小鼠CD40Ig基因真核表达质粒pDC516-CD40-IgG-GFP构建成功，为诱导供体特异性移植物免疫耐受的研究奠定了基础。     

人β3肾上腺素受体真核表达质粒pcDNA3.1(+)-β3-AR的构建及表达

目的构建人β3肾上腺素受体(β3-AR)的真核表达质粒pcDNA3.1( )-β3-AR,并通过脂质体介导转染HEK293细胞使之表达该受体蛋白。方法以pENTR_ADRB3-Stop质粒为模板,采用PCR法扩增出人β3-AR cDNA,将其插入真核表达载体pcDNA3.1( )中,构建成真核表达质粒pcDNA3.1( )-β3-AR。将该质粒转染HEK293真核细胞,通过RT-PCR检测β3-AR mRNA在HEK293细胞内的表达,通过免疫荧光法检测β3-AR蛋白在HEK293细胞中的表达。结果酶切和DNA测序鉴定均证实重组质粒含有人β3-AR编码区全长。在转染重组质粒pcDNA3.1( )-β3-AR的HEK293细胞中检测到了β3-AR基因的转录和翻译产物。结论通过基因工程方法成功构建了β3-AR的真核表达质粒pcDNA3.1( )-β-AR,为进一步建立β-AR的稳定表达细胞株,用于筛选高效、高选择性β-AR激动剂奠定了基础。     

TLR9与ADAM17在食管鳞状细胞癌中的表达及临床意义

目的检测Toll样受体9(TLR9)和去整合素-金属蛋白酶(ADAM)17蛋白在人食管鳞癌组织中的表达,探讨两者在食管鳞癌发生、发展、浸润、转移中的作用以及两者间的相关关系,并进一步对其与食管癌的临床及病理特征间的关系进行分析。方法通过免疫组织化学Envision~(TM) plus法检测2000年3月至2008年7月复旦大学附属上海市第五人民医院胸外科经手术治疗的81例食管鳞状细胞癌患者的存档蜡块肿瘤组织和30例癌旁正常组织中TLR9、ADAM17蛋白的表达情况。结果在食管鳞癌组织中TLR9、ADAM17的表达率分别为69.1%(56/81)和72.8%(59/81),而在癌旁组织中TLR9、ADAM17的表达率分别为30.0%(9/30)和26.7%(8/30),差异有统计学意义(P<0.01);TLR9、ADAM17在食管癌组织Ⅲ+Ⅳ期中的表达率显著高于Ⅰ+Ⅱ期[80.4%(37/46)比54.3%(19/35),84.8%(39/46)比57.1%(20/35)],在T_3+T_4中的表达率显著高于T_1+T_2[85.7%(36/42)比51.3%(20/39),83.3%(35/42)比61.5%(24/35)],在有淋巴结转移中的表达率显著高于无淋巴结转移组织[79.2%(38/48)比54.5%(18/33),83.3%(40/48)比57.6%(19/33)],差异均有统计学意义(P<0.05)。且两者的表达之间呈正相关(r=0.372,P<0.05)。结论TLR9和ADAM17在食管鳞癌组织中高表达;TLR9和ADAM17在食管鳞癌组织中的表达呈正相关,联合检测TLR9和ADAM17在食管鳞癌组织中的表达可作为临床判断食管癌的分期、分级参考依据。     

组织蛋白酶L基因真核表达质粒的构建与鉴定

目的:构建组织蛋白酶L(CTSL)基因的真核表达质粒并进行表达鉴定.方法:采用RT-PCR技术从人卵巢癌组织总RNA中逆转录CTSL基因的cDNA全长,克隆到pMDl8-T载体上;亚克隆至pcI)NA3.1载体,重组阳性克隆进行酶切及测序鉴定,重组质粒瞬时转染HO8910细胞,RT-PCR和westeIn-blot检测CTSL基因和蛋白表达.结果:PCR克隆出CTSL cDNA全长,成功克隆人pMD18-T载体,亚克隆至pcDNA3.1载体,重组阳性克隆酶切及测序鉴定证实CTSL基因已正确插入pcD-NA3.1载体.RT-PCR和Western-blot结果证实CTSL基因能够在HO8910细胞中正确表达.结论:成功构建了CTSL基因的真核表达质粒,为下一步探讨CTSL基因在卵巢癌中的作用提供了实验基础.     

人IGF-I基因真核表达质粒pIRES2-EGFP-IGF-I的构建

目的利用基因工程原理构建人胰岛素样生长因子I(IGF-I)全长基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-IGF-I.方法应用PCR方法从人肝细胞cDNA文库中提取人IGF-I全长cDNA序列,克隆入T载体pMD18中,经测序证实序列正确后,进行双酶切并定向插入真核表达载体pIRES2-EGFP中,利用双酶切、电泳和PCR证实插入片段的正确性.结果经测序证实,目的基因人IGF-I的全长基因序列被正确扩增;构建的真核表达载体经双酶切和PCR鉴定证实,hIGF-I被定向插入到真核表达载体pIRES2-EGFP的多克隆位点中.结论利用基因工程原理可以正确地构建人IGF-I全长基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-IGF-I.     

人SMRT基因真核和原核表达载体的构建及鉴定

目的：构建人SMRT基因真核和原核表达载体。方法：体外人工合成SMRT-C645bp对应的基因片段,克隆至pUC57载体,酶切,测序正确后,PCR扩增目的基因片段,酶切后亚克隆至pCMV-myc载体和pGEX-6p-1载体,并酶切和测序鉴定。结果：成功构建了人pCMV-myc-SMRT真核表达载体和pGEX-6p-1-SMRT原核表达载体。结论：成功构建了人SMRT真核和原核表达载体,为下一步蛋白间相互作用的证实提供了基础。     

醛缩酶B基因真核表达质粒的构建与鉴定

目的 构建含ALDOB基因的重组PCMV5质粒并进行鉴定.方法 以人HEPG2细胞RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出ALDOB基因.将PCR产物克隆进真核载体PCMV5内,构建含ALDOB基因的重组真核表达质粒.重组质粒转染293T细胞,用免疫荧光和Western blot等方法检测ALDOB在293T细胞中的表达.结果 核酸序列分析的结果表明,克隆的ALDOB基因与GenBank中已登记ALDOB基因序列 100%同源.免疫荧光结果显示,ALDOB蛋白在细胞质表达;Western blot结果显示,在约40KD位置有目的 条带,与预期的重组ALDOB 蛋白大小一致.结论 成功构建了含ALDOB基因的真核表达质粒.     

pB2 R-Venus 重组真核载体的构建及在 HEK293T细胞中的表达

目的：构建带有黄色荧光蛋白突变体 Venus标签的人缓激肽2型受体（bradykinin receptor 2, B2R）真核表达载体,用于B2R与相关受体及蛋白的相互作用、B2R受体介导的信号转导机制的研究等。方法根据人B2R基因序列设计引物,以质粒pcDNA3．1-B2R为模板,PCR扩增目的基因人B2R。EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切扩增产物及质粒pVenus-N1,经回收、连接、转化,获取重组质粒。对重组质粒进行酶切、测序鉴定。转染重组质粒至 HEK293T细胞,荧光显微镜观察受体B2R的细胞定位,蛋白印迹法检测目的蛋白人B2R蛋白的表达。结果 PCR扩增出了1条长度为1176 bp的基因片段,测序结果与GenBank （AY275465）相同。荧光显示B2R表达于质膜。Western blot结果显示,实验组蛋白印迹条带与目的蛋白大小相同,为44kDa。结论成功构建了pB2R-Venus重组真核表达载体,瞬时转染成功,获得了转染有重组质粒的HEK293T细胞。成功构建的重组质粒pB2R-Venus可用于后续BRET、FRET等实验研究,有助于B2R介导的信号转导机制的探讨和药物靶点的寻找。     

人DC-SIGN真核表达载体的构建及表达

目的构建含有FLAG标签的人DC—SIGN真核表达载体,并在人胚肾293T细胞中进行表达。方法通过PCR方法获得含有FLAG标签的人DC—SIGN分子基因,将其插入到真核表达载体pIRES—neo中。构建的重组质粒pIRES—neO—FLAG—DC—SIGN转染293T细胞,利用流式细胞仪、免疫荧光及WesternBlot检测其表达情况。结果含FLAG标签的人DC—SIGN基因测序正确,PCR和酶切鉴定证明FLAG—DC—SIGN基因已成功连入真核表达载体pIRES—neo中;检测结果显示重组质粒pIRES—neo—FLAG—DC—SIGN在293T细胞中得到表达。结论成功构建了重组质粒pIRES—neo—FLAG—DC—SIGN,且在293T细胞中能有效表达,为后续DC靶向性疫苗研究奠定了基础。     

psiCHECK-2-eGFP-mLumin双荧光蛋白报告基因质粒的构建及在真核细胞中的表达

［摘要］目的: 以psiCHECK-2质粒为骨架,构建带有远红外荧光蛋白mLumin和增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,eGFP）的双荧光蛋白报告基因质粒psiCHECK-2-eGFP-mLumin。方法： PCR扩增mLumin和eGFP基因片段,分别取代海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶插入psiCHECK-2质粒中,构建psiCHECK-2-eGFP-mLumin双荧光蛋白报告基因重组质粒mLumin。通过测序验证插入序列,并将此质粒转入HEK293T细胞,分别用PCR和荧光显微镜鉴定eGFP和mLumin在细胞中的表达。结果： DNA测序结果证实连接在psiCHECK-2质粒上的eGFP和mLumin基因序列与基因库中的序列一致。将psiCHECK-2-eGFP-mLumin质粒转染HEK293T细胞,能成功表达eGFP和mLumin蛋白。结论： 成功构建psiCHECK-2-eGFP-mLumin双荧光蛋白报告基因质粒,且可在真核细胞中表达。     

真核表达载体pIRES2-AcGFP1-Asc12的构建及表达

目的 构建真核表达载体pIRES2-AcGFP1-Ascl2,并在真核细胞HEK293T细胞中表达,为今后研究Ascl2基因在Tfh细胞的相关分子机制奠定实验基础.方法 PCR方法扩增健康人外周血单个核细胞中Ascl2基因,连接至pIRES2-AcGFP1质粒的多克隆位点中,构建pIRES2-AcGFP1-Ascl2重组质粒.通过脂质体转染法对HEK293T细胞进行转染.Realtime-PCR及Westernblot方法分析转染pIRES2-AcGFP1-Ascl2重组质粒的HEK293T细胞中Ascl2表达情况.结果 经Realtime-PCR及Westernblot方法,证实Ascl2基因能够在HEK293T细胞中正确表达.结论 成功建立表达Ascl2基因的pIRES2-AcGFP1-Ascl2重组质粒,并能在HEK293T细胞中表达,为进一步研究Ascl2在自身免疫性疾病中Tfh细胞的相关机制奠定了实验基础.     

人PSCA真核表达载体的构建及表达

目的构建含有信号肽及FLAG标签的人前列腺干细胞抗原（PSCA）真核表达载体,并在人胚肾293T细胞中进行表达。方法通过PCR方法获得SIG-FLAG基因片段及人PSCA基因片段,插入到真核表达载体pIRES-neo中。构建的重组质粒pIRES-neo-sig-FLAG-PSCA转染293T细胞,利用流式细胞仪、免疫荧光及RT-PCR方法检测其表达情况。结果PCR扩增出的SIG-FLAG及PSCA基因测序正确,酶切鉴定证明重组质粒pIRES-neo-sig-FLAG-PSCA构建成功;检测结果显示重组质粒pIRES-neo-sig-FLAG-PSCA在293T细胞中得到表达。结论成功构建了重组质粒pIRES-neo-sig-FLAG-PSCA,且在293T细胞中能有效表达,为后续转人PSCA基因细胞系的构建工作奠定了基础。     

人Neuritin真核表达载体的构建及其在细胞中的定位

目的获得人突触生长素Neuritin基因并构建pEGFP-C1-neuritin真核表达载体,观察Neuritin在人AD293细胞中的定位。方法利用PCR获得Neuritin基因,然后克隆到pEGFP-C1载体中,利用脂质体将构建的表达载体转染AD293细胞,荧光观察融合蛋白的表达。结果从人类cDNA文库中得到Neuritin的完整开放阅读框序列,将其重组到pEGFP-C1载体中并转染AD293细胞,荧光显示Neuritin蛋白定位在细胞浆中。结论成功构建Neuritin真核表达载体并在人AD293细胞表达,证明Neuritin蛋白定位于细胞浆,为进一步研究Neuritin与其他蛋白的相互作,探讨Neuritin功能及作用机制奠定理论基础。     

小鼠骨生成诱导因子基因逆转录病毒载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的构建小鼠骨生成诱导因子（OIF）基因重组逆转录病毒载体,鉴定其在293T细胞中的表达。方法 PCR法扩增OIF-3FLAG基因,测序后克隆入逆转录病毒载体pMSCV PIG（Puro-IRES-GFP）的相应位点,构建重组逆转录病毒表达载体pMSCV PIG-OIF-3FLAG,并对重组体进行测序鉴定。应用脂质体分别将PMSCV PIG-OIF-3FLAG和VSVG、GAG-POL辅助病毒包装载体共转染至293T包装细胞,48h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）表达;收集包装细胞上清液,进一步用含有包装病毒的上清液再感染293T细胞,48 h后加入3μg/mL嘌呤霉素（puromycin）,连续7d,筛选病毒感染的稳定表达pMSCVPIG-OIF-3FLAG的293T细胞株,分别采用Real-time PCR技术和Western blotting方法检测293T细胞OIF mRNA及其蛋白表达。结果构建OIF基因逆转录病毒表达载体PMSCV PIG-OIF-3FLAG,经酶切及测序鉴定证实目的基因插入位点和读码框架正确;病毒感染293T细胞,经嘌呤霉素筛选稳定表达小鼠OIF的293T细胞株;Real-time PCR和Western blotting鉴定证实OIF mRNA和蛋白在该细胞株中呈高表达。结论成功构建小鼠OIF基因的逆转录病毒载体,并获得稳定高表达OIF基因的293T细胞株。     

小鼠骨生成诱导因子基因逆转录病毒载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的 构建小鼠骨生成诱导因子(OIF)基因重组逆转录病毒载体,鉴定其在293T细胞中的表达。方法 PCR法扩增OIF-3FLAG基因,测序后克隆入逆转录病毒载体pMSCV PIG（Puro-IRES-GFP）的相应位点,构建重组逆转录病毒表达载体pMSCV PIG-OIF-3FLAG,并对重组体进行测序鉴定。应用脂质体分别将PMSCV PIG-OIF-3FLAG和VSVG、GAG-POL辅助病毒包装载体共转染至293T包装细胞,48 h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）表达;收集包装细胞上清液,进一步用含有包装病毒的上清液再感染293T细胞,48 h后加入3 μg/mL嘌呤霉素（puromycin）,连续7 d,筛选病毒感染的稳定表达pMSCV PIG-OIF-3FLAG 的293T细胞株,分别采用Real-time PCR技术和Western blotting方法检测293T细胞OIF mRNA及其蛋白表达。结果 构建OIF基因逆转录病毒表达载体PMSCV PIG-OIF-3FLAG,经酶切及测序鉴定证实目的基因插入位点和读码框架正确;病毒感染293T细胞,经嘌呤霉素筛选稳定表达小鼠OIF的293T细胞株;Real-time PCR和Western blotting鉴定证实OIF mRNA和蛋白在该细胞株中呈高表达。结论 成功构建小鼠OIF基因的逆转录病毒载体,并获得稳定高表达OIF基因的293T细胞株。     

大鼠GPR17基因真核表达载体的构建及其功能鉴定

目的:构建大鼠GPR17(rGPR17)基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,并对其功能进行初步研究.方法:从大鼠脑组织提取总RNA,通过RT-PCR扩增rGPR17 cDNA,与载体pcDNA3.1(+)连接,并转化到大肠杆菌DH5α以获得重组载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,以PCR、双酶切和测序鉴定;将重组载体pcDNA3.1(+)-rGPR17通过脂质体转染方法,转染HEK293细胞,RT-PCR、免疫荧光法检测rGPR17的表达,Fluo-4测定激动剂LTD_4处理后细胞内钙变化.结果:RT-PCR、双酶切和测序证明,重组的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17构建成功,并在HEK293细胞获得表达,加入外源性激动剂LTD_4可诱导细胞内钙的增加.结论:成功构建了rGPR17的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,并在HEK293细胞功能性表达,为GPR17受体及其拮抗剂的研究提供了基础.