金属纳米团簇荧光探针联合新型纳米材料在核酸检测领域中的应用现状

核酸检测技术在临床诊断、基因治疗和生物医学发展中发挥着重要的作用。金属纳米团簇(MNCs)荧光探针是一种具有极大应用潜力的荧光探针，最常用的有银纳米团簇(Ag NCs)荧光探针和铜纳米团簇(Cu NCs)荧光探针，可用于检测DNA和miRNA。新型纳米材料，如氧化石墨烯、纳米碳氧化物、金纳米颗粒、二硫化钨纳米片能够猝灭多种荧光团的荧光信号。利用新型纳米材料对单链DNA和双链DNA的吸附能力具有巨大差异的特性，可设计出“turn on”型检测平台。此外，将新型纳米材料如二氧化硅纳米颗粒、磁性微球等，与MNCs荧光探针联用时，可获得荧光放大效应。本文总结了近年来在核酸检测方面MNCs荧光探针与纳米材料联用的各种检测平台，分析这些MNCs荧光探针检测平台的设计原理、荧光行为及检测能力等，为疾病诊断和病理研究的分子工具提供参考。     

功能性硫化锌纳米荧光探针与DNA的相互作用

目的:研究L-半胱氨酸包裹的ZnS纳米荧光探针与核酸的相互作用及其机理,建立DNA的定量分析方法.方法:通过考察溶液pH值、缓冲液用量及粒子浓度等影响因素,在最佳试验条件下,利用在pH值近中性时DNA对纳米荧光探针具有猝灭作用的特性,采用荧光光谱法进行研究.结果:当DNA浓度为20～600 μg/L时,荧光强度与DNA的浓度呈良好的线性关系,检测限为0.032 μg/L.结论:该方法简单,快速,灵敏度高.DNA与L-半胱氨酸-ZnS纳米粒子存在静电作用.     

HBV共价闭合环状DNA功能化纳米颗粒制备及鉴定

目的 制备HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)功能化磁性纳米颗粒,为进一步建立富集分离和检测cccDNA方法奠定基础. 方法 通过亲和素修饰纳米颗粒表面,利用亲和素与生物素的亲和作用,将亲和素修饰的纳米颗粒与生物素标记的cccDNA特异性探针偶联,制备cccDNA功能化纳米颗粒,最后用cccDNA探针完全互补的荧光标记序列与功能化纳米颗粒反应,鉴定其特性. 结果 亲和素修饰的纳米颗粒能结合生物素最大量为1 205 ng/mg;通过与亲和素作用,生物素标记cccDNA特异性探针固定在磁性纳米微粒表面,其最大结合生物素标记探针量为3.2×10-9 mol/mg;cccDNA功能化纳米颗粒可捕获与其互补的荧光标记寡核苷酸序列,其最大捕获量为2.0×10-9mol/mg,并能通过变性释放出保持生物学活性游离的荧光标记寡核苷酸序列. 结论 成功构建的cccDNA功能化纳米微粒能有效捕获与其互补的序列,其捕获量能达到cccDNA的分离提取要求.     

一种用于前列腺癌细胞体外检测生物导航纳米探针的制备

目的 制备一种用于对人前列腺癌PC3细胞进行体外检测的粒细胞靶向介导的磁性-荧光纳米探针.方法 制备以Fe3O4为核、表面包被siO2和异硫氰酸罗丹明的具有磁性且携带红色荧光的纳米材料,将其与正常人外周血粒细胞按不同比例混合,分别孵育不同时间以检测纳米材料对粒细胞的毒性.选择最佳比例将纳米材料和粒细胞体外结合,得到粒细胞靶向介导的磁性-荧光纳米探针;将PC3细胞与正常人全血细胞分别以不同比例混合,加入上述探针,于荧光显微镜下观察探针的靶向情况.结果 在实验所用的浓度和作用时间范围内,制备的纳米探针对粒细胞存活率无明显影响.镜下可见纳米探针在PC3细胞周围富集,形成“花瓣样”结构,而全血细胞周围无探针富集.结论 本研究制备的磁性-荧光纳米探针不会对粒细胞本身产生明显毒性,利用粒细胞对肿瘤细胞的生物靶向作用可使纳米探针有效地靶向检测肿瘤细胞.     

量子点的单分子生物成像

半导体量子点(量子点)是纳米尺度的晶体,其具有独特的光物理性质,如荧光寿命较长、对光漂白有独特的稳定性、较大的带隙位移及狭窄对称的荧光谱峰,这些特性使量子点成为有前途的生物光学标记,如作为免疫荧光标记细胞和组织、DNA探针及单分子探针等。量子点可用于标记DNA序列或电化学检测蛋白质。该文就量子点的属性与毒性及其光学与电化学生物的分析应用,尤其是量子点在生物医学中的应用予以综述。     

萘酰亚胺类纳米杂化荧光探针的制备及性能

利用两亲性嵌段共聚物聚苯乙烯-b-聚丙烯酸(PS-b-PAA)的自组装行为及有机硅烷偶联剂3-巯基丙基三甲氧基硅烷(MPTMS)水解自缩聚的特性,制备了一系列包裹疏水性萘酰亚胺类荧光分子(DPN)的纳米杂化荧光探针(DPN@HNP)。系统地研究了DPN的包裹量、嵌段共聚物及硅烷偶联剂对DPN@HNP的光物理性能及形貌的影响。结果表明,DPN包裹量增加或堆叠紧密会使紫外-可见光吸收与荧光发射强度提高并发生红移;嵌段共聚物链段长度与用量增加,使更多的DPN分子被包裹,从而获得更高的荧光强度与更大的粒径;偶联剂包覆有机硅层会加剧DPN分子的堆叠紧密程度,从而提高纳米探针的荧光强度,而其添加量与反应时间对荧光探针的光物理特性影响不大。     

荧光硅纳米的制备及其生物学特性的研究

目的 探讨荧光硅纳米颗粒做为基因载体的可行性及其自带荧光做为一种生物标志物的易于检测性.方法 用微乳液法制备荧光硅纳米颗粒,并用氯化钠对其进行表面修饰.用粒径仪观察其粒径,电位分析仪检测纳米颗粒表面Zeta电位值.用上下法检测其对SD大鼠的急性毒性,并在荧光显微镜检测其在SD大鼠主要脏器的分布情况.结果 制备的硅纳米粒径在32 nm左右、Zeta电位为+53.9 mv、LD50大于2 000 mg/kg、呈红色荧光,在各大脏器均有分布,特别在脑和前列腺中有大量分布.结论 该荧光硅纳米颗粒可用作基因载体.     

纳米金标记法在HIV检测中的应用

目的 制备金纳米颗粒人类获得性免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)基因探针,研究其在检测HIV中的应用.方法 采用枸橼酸还原金氯酸法制备Au纳米颗粒.Au纳米颗粒通过Au-S共价键与烷烃硫醇修饰的寡核苷酸结合制备检测探针.检测探针通过与靶序列在液相中杂交,形成Au纳米颗粒聚集体,采用电镜观察结果.结果 制备的Au纳米颗粒粒径为(12±5)nm,分散良好,在520nm有最大吸收峰,经寡核苷酸修饰后,最大吸收峰改变为524 nm.液相杂交后采用电镜观察可检测低至1 fmol/L的合成靶序列.结论 Au纳米颗粒HIV cDNA基因探针,通过液相杂交技术检测HIV cDNA,可以缩短检测窗口期,做到早期诊断和预防.     

近红外发光葡聚糖纳米胶活体成像小鼠淋巴结

 目的  制备和研究荧光染料标记的葡聚糖纳米胶,用于活体荧光成像小鼠腋窝淋巴结。方法  使用脱氧胆酸和荧光染料Cy7化学标记葡聚糖,通过透析法制备纳米胶Dextran-Cy7;使用透射电子显微镜、动态光散射仪分别表征纳米胶的形貌及大小;分光光度法标定Cy7的含量;用C57小鼠和DC2.4细胞分别评价Dextran-Cy7的体内、体外毒性;对10只正常昆明小白鼠经前掌注射Dextran-Cy7生理盐溶液,使用活体荧光扫描成像系统观察小鼠腋窝淋巴结的成像效果;淋巴结免疫荧光组化法观察Dextran-Cy7在淋巴结内的分布。结果  Dextran-Cy7纳米胶是直径30~50 nm的球形纳米颗粒,其在体内和体外都具有较低的细胞毒性,可作为近红外发光探针活体荧光成像小鼠腋窝淋巴结;纳米胶主要分布在淋巴结的巨噬细胞细胞内。结论  Dextran-Cy7纳米胶细胞毒性低、生物相容性好,可作为纳米荧光探针成像活体小鼠淋巴结。     

金纳米颗粒基因探针同步检测HBV和HCV的初步研究

目的 建立一种简单、快速同时检测HBV DNA和HCV RNA的诊断方法.方法 利用PCR方法扩增HBsAg阳性合并抗HCV阳性的患者血清中HBV DNA和HCV cDNA并提取.制备Au纳米颗粒HBV DNA、HCV cDNA基因探针.在含有Au纳米颗粒HBV DNA、HCV cDNA基因探针的液相检测体系中加入HBV DNA和(或)HCV cDNA,透射电镜下观察.结果 PCR(可扩增HBV DNA和HCV cDNA.出现预期的431bp和323bp特异性条带.使用Au纳米颗粒基因探针通过透射电镜可同步检出乙、丙型肝炎合并感染患者血清中提取的HBV DNA和HCV RNA.结论 通过透射电镜,使用Au纳米颗粒基因探针可同步检出乙、丙型肝炎合并感染患者血清中的HBV DNA和HCV cDNA,甚至可达到无需PCR水平,此方法具有敏感性高、特异性好的特点.     

荧光定量PCR技术及其在生物检测中的应用

荧光定量PCR技术是近年来发展起来的一种核酸定量技术。该技术在PCR反应体系中引入了荧光标记的探针,具有高度的灵敏性、特异性和精确性等特点。荧光定量PCR技术根据其探针的作用方式分为:Taqman技术、Amplisensor技术、Molecular beacon技术、复合探针法、ScorpionsTM探针技术、Amplifluor TM通用检测系统、SYBR荧光染料等类型。目前该技术已广泛应用于HBV病毒、HCV病毒、SARS病毒、禽流感病毒、炭疽芽孢杆菌、霍乱弧菌、寄生虫、病毒感染的定量监测、食品卫生检疫等生物检测领域。     

固化DNA纳米胶体金探针杂交目视化比色检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因的实验研究

目的 建立以纳米金颗粒为载体的DNA探针杂交方法,快速、特异地检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)特异性mecA基因.方法 采用直径为60nm的胶体金纳米颗粒与巯基修饰的2条mecA基因寡核苷酸探针共价结合,制备成固化的DNA 金纳米探针.将金纳米探针与其互补的mecA基因靶序列在液相中杂交,通过调节2条探针的比例和不同的检测方法对杂交反应条件和产物检测进行优化.结果 金纳米探针呈稳定的酒红色,与互补的靶序列DNA进行液相杂交后颜色呈现明显的蓝色变化.当2条探针不对称加入时颜色变化更明显.采用反向色谱反应盘检测反应产物也可获得满意的效果.产物离心后检测灵敏度可达2.36 fmol/L.结论 固化纳米胶体金探针杂交技术具有快速简便的特点,有望为MRSA的快速检测提供一种新的方法.     

靶向细胞凋亡的纳米探针在MRI中的应用

磁共振成像(MRI)作为一种非侵入性、无电离辐射、有较好穿透能力和空间识别能力的技术被广泛应用于包括细胞凋亡在内的各类研究。细胞接收到凋亡信号后,常伴有细胞内侧磷脂酰丝氨酸外翻、胱天蛋白酶级联反应等事件的发生,这些均可作为纳米探针的生物靶点。通过调整纳米探针尺寸达到合适的信噪比,利用多模态探针获取更多信息,构造新型对比剂等途径提高MRI的信号强度和靶向性,并解决信号量化问题,从而研制大量基于MRI的新型凋亡纳米探针,这对多种疾病的早期诊断及治疗效果评估有重要意义。     

纳米金及其标记细胞色素P450的近红外荧光性质的研究

目的研究纳米金及其标记细胞色素P450在811nm近红外荧光光谱的特性,并对其荧光增强机理进行深入的探讨。方法用不同量的柠檬酸三钠在煮沸搅拌条件下还原氯金酸制得不同粒径的纳米金,利用纳米金易与蛋白结合的性质标记细胞色素P450。用紫外-可见吸收光谱仪、投射电子显微镜以及荧光光谱仪,研究纳米金及其标记细胞色素P450的光谱性质。结果透射电子显微镜显示随着还原剂柠檬酸钠加入量的增加,形成的纳米金的颗粒逐渐减小。紫外-可见吸收光谱显示大颗粒纳米金只在250nm处有吸收,当纳米金粒径的减小至21nm时,在525nm处出现新的吸收峰。荧光光谱仪显示以538nm为激发波长,纳米金在811nm处有荧光发射峰,且标记蛋白后荧光强度增加。结论通过对纳米金近红外荧光性质的研究,可利用纳米金的近红外荧光性质作为探针检测细胞色素P450。     

丙肝病毒核心抗原荧光定量型生物条形码检测体系的建立与评价

目的建立丙肝病毒核心抗原（HCVcAg）的荧光定量型生物条形码检测体系,并对检测体系进行方法学评价。方法制备标记有HCVcAg多抗及特异DNA链的金纳米颗粒探针（NP探针）和标记有HCVcAg单抗的磁性微球探针（MMP探针）,形成MMP探针-HCVcAg-NP探针复合物,再利用去杂交将NP探针上标记的DNA链释放出来,通过荧光定量PCR方法鉴定这些释放的DNA链可确定丙肝病毒的存在。结果建立了HCVcAg的荧光定量型生物条形码检测体系,检测灵敏度可达100fg/ml,是相应的HCVcAg ELISA检测方法的104倍。结论本研究为发展高灵敏度丙肝病毒的荧光定量型生物条形码检测试剂盒奠定了基础。     

三甲基壳聚糖纳米颗粒体外转染pEGFP蛋白质粒的实验研究

目的 制备加载pEGFP蛋白质粒的三甲基壳聚糖纳米颗粒,观察质粒转染大肠杆菌HepG2 细胞的效率.方法 采用复凝聚法制备包裹pEGFP的三甲基壳聚糖纳米颗粒,MTT比色法测定纳米颗粒对HepG2细胞增殖的影响,倒置荧光显微镜观察质粒转染的效率,并用荧光酶标仪比较细胞中荧光蛋白的表达量.结果 三甲基壳聚糖纳米颗粒的平均粒度为190 nm,且无细胞毒性,能够观察到靶细胞中绿色荧光蛋白的表达.结论 三甲基壳聚糖是一种有效的纳米转染试剂,能够将质粒转染入靶细胞胞浆内并且表达.     

荧光量子点在纳米药物研究中的应用进展

量子点是一类新型无机纳米荧光探针,在长时间、多色的荧光成像和检测中具有突出优势.近年来发展起来的量子点标记技术推动了纳米药物在细胞、活体动物水平上的研究;基于量子点和荧光成像技术开发的集靶向、成像和治疗作用于一体的多功能纳米药物,有望应用于肿瘤诊断和治疗.本文从量子点作为纳米药物载体、量子点标记纳米药物载体、量子点荧光共振能量转移技术用于纳米药物释放研究以及多功能纳米药物开发这四个方面综述了荧光量子点技术用于纳米药物研究的最新进展,并讨论了该领域未来可能的发展方向.     

基于吲哚的溶酶体荧光探针的合成及应用

目的 设计合成一种用于溶酶体成像的荧光探针。方法 使用芦竹碱和4-吡啶甲醛作为反应底物,正三丁基膦作为催化剂合成得到化合物(E)-3-(2-吡啶-4-乙烯基)-1H-吲哚(PVI)。通过核磁对化合物的结构进行表征;荧光光谱法和紫外-可见光吸收光谱法探究该探针与溶液pH之间的关系;理论计算其pH响应的机理;倒置荧光显微镜观察其细胞成像情况;激光共聚焦显微镜记录其溶酶体共定位成像。结果 所制备的溶酶体荧光探针PVI在pH 4.00～7.00时,荧光强度随着pH的减小而逐渐增强。PVI具有较低的细胞毒性,可以用于PC-3前列腺癌细胞和其溶酶体成像。结论 合成得到一种pH响应的荧光探针PVI,具有细胞毒性低、生物相容性好、荧光强度高的优点,能用于溶酶体定位和成像,是一种具有商业应用价值的溶酶体荧光探针。     

两探针荧光定量检测HCV RNA的应用和探析

目的 评价两探针荧光定量聚合酶链反应检测丙型肝炎病毒在临床中的应用价值.方法 对89例抗HCV抗体阳性和220例阴性样本,用荧光定量两探针法和两种商品试剂荧光定量方法进行检测,并对检测结果进行比较分析.结果 荧光定量两探针法阳性率分别为91.01%(81例)和2.27%(5例).两种商品试剂荧光定量方法阳性率分别为82.02%(73例)和0.45%(1例);79.78%(71例)和1.82%(4例).结论 荧光定量两探针法提高了HCV RNA检测的灵敏度和特异性.     

荧光标记寡核苷酸探针检测变形链球菌

[目的]建立应用荧光标记寡核苷酸探针BC73快速检测变形链球菌的方法.[方法]应用流式细胞仪检测荧光标记寡核苷酸探针EUB338和BC73与模式菌株和牙菌斑样品荧光原位杂交后的荧光强度和荧光计数.[结果]荧光标记寡核苷酸探针BC73与变形链球菌S.mutans10449杂交的荧光强度7倍于S.mitis15914和E.coliK12.变形链球菌占牙菌斑中细菌总数的1.7%.[结论]荧光标记寡核苷酸探针BC73能特异性检测牙菌斑中的变形链球菌数.