苦碟子注射液对氧糖剥夺损伤的C6胶质细胞凋亡与自噬调节作用

目的:研究苦碟子注射液对氧糖剥夺损伤C6胶质细胞凋亡与自噬的调节作用,明确其对氧糖剥夺损伤胶质细胞的保护作用。方法:采用氧糖剥夺/复氧(OGD/R)的方法建立C6胶质细胞损伤模型,按随机数字表法分为空白对照组、氧糖剥夺/复氧模型组、苦碟子注射液组、自噬抑制剂(3-MA)组4组,Annexin V FITC/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率,免疫荧光染色法观察活化caspase-3表达,western blotting法检测LC3Ⅱ蛋白表达。结果:氧糖剥夺/复氧损伤后LC3Ⅱ蛋白表达增加,细胞凋亡率升高,苦碟子注射液能够显著降低C6胶质细胞凋亡率,增加LC3Ⅱ蛋白高表达。结论:苦碟子注射液能够降低C6胶质细胞凋亡率,进一步激活细胞自噬而发挥保护作用。     

阿魏酸钠对氧糖剥夺所致星形胶质细胞损伤的保护作用及机制研究

目的:观察阿魏酸钠对氧糖剥夺所致的体外培养星形胶质细胞损伤的保护作用,并探讨其机制。方法:原代培养星形胶质细胞分为对照组、氧糖剥夺组、氧糖剥夺+阿魏酸钠组(50,100,200 mol/L)、P38MAPK通路抑制剂SB203580组、氧糖剥夺+SB203580组。阿魏酸钠组细胞在氧糖剥夺前加入不同浓度的阿魏酸钠作用24 h,p38MAPK特异性阻断剂SB 203580(20μmol/L)在氧糖剥夺前1 h加入。将各氧糖剥夺组星形胶质细胞在无糖DMEM培养基、1%O2的培养条件下进行6 h时长的氧糖剥夺,进行如下实验:(1)倒置相差显微镜下观察星形胶质细胞形态学改变。(2)用乳酸脱氢酶(LDH)漏出率、MTT法检测星形胶质细胞的损伤情况及细胞活力。(3)Hoechst 33258核染色观察细胞凋亡的形态学改变。(4)Western blot方法观察磷酸化P38和活化的caspase-3蛋白表达的改变。结果:离体培养的星形胶质细胞经过氧糖剥夺处理6 h,细胞发生肿胀,突触回缩,呈空泡样改变,细胞活力明显下降,LDH漏出率增加,凋亡细胞百分比较正常对照组明显增加,SB203580可逆转以上改变。Western blot结果显示,磷酸化P38MAPK和活化的caspase-3蛋白表达也明显增加。氧糖剥夺前24 h加入阿魏酸钠(50,100,200μmol/L)可不同程度逆转以上改变。结论:阿魏酸钠能明显抑制氧糖剥夺所致的体外培养星形胶质细胞的损伤,这种作用与其抑制p38 MAPK信号转导通路有关。     

慢性肾衰竭营养不良大鼠骨骼肌细胞凋亡及中药的干预实验

目的:观察慢性肾衰竭(chronic renal failure,CRF)营养不良大鼠骨骼肌细胞凋亡情况,及中药肾衰养真胶囊对其的影响。方法:SD雄性大鼠,采用5/6肾切除同时予4%酪蛋白饮食制作CRF营养不良大鼠模型,随机分为正常组,模型组,中药组和西药组。治疗4周后,检测肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、白蛋白(Alb)、血红蛋白(Hb),TUNEL法检测骨骼肌细胞凋亡率,Western Blot检测骨骼肌细胞凋亡蛋白酶3(Caspase-3)活性片段(Cleaved Caspase-3)、B淋巴细胞瘤-2基因相关蛋白(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白水平。结果:模型组大鼠骨骼肌细胞凋亡率明显增加(P0.01),Cleaved Caspase-3和Bax表达均显著增加(P0.01),Bcl-2表达显著下降(P0.01)。中药干预后,CRF营养不良大鼠骨骼肌细胞凋亡率显著减少(P0.01),Cleaved Caspase-3和Bax表达均显著下降(P0.01),Bcl-2表达显著增加(P0.01),同时大鼠Alb、Hb显著升高(P0.01)。结论:Caspase-3依赖的细胞凋亡可能参与了CRF营养不良骨骼肌蛋白的降解,并诱导了骨骼肌萎缩。中药肾衰养真胶囊可能通过下调Cleaved Caspase-3和Bax蛋白表达,上调Bcl-2蛋白表达,抑制骨骼肌细胞凋亡,从而改善CRF营养不良。     

毛冬青皂苷E对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响

目的考察毛冬青皂苷E对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用,并探讨其作用机制。方法将H9C2心肌细胞随机分为正常对照组,模型组,毛冬青皂苷E低、中、高剂量对照组(10,50,250μg·m L-1)、毛冬青皂苷E低、中、高剂量治疗组(10,50,250μg·m L-1)。造模前24 h给予相应浓度的药物预处理,缺氧4 h,复氧4 h后,采用CCK-8法检测细胞存活率,DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧(ROS)含量,并采用蛋白印迹法(Western Blot)检测Caspase-3和Cleaved caspase-3凋亡蛋白的表达。结果缺氧/复氧后,与正常对照组比较,模型组细胞存活率显著降低(P0.05),细胞内ROS含量显著升高(P0.01),毛冬青皂苷E各剂量治疗组预处理后,细胞存活率增加,ROS含量降低。缺氧/复氧损伤可使Caspase-3和Cleaved caspase-3蛋白表达增加。毛冬青皂苷E各剂量治疗组预处理后,Caspase-3和Cleaved caspase-3蛋白表达均下降。结论毛冬青皂苷E对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤具有保护作用,其机制可能与减少ROS生成,抑制凋亡相关蛋白Caspase-3和Cleaved caspase-3的表达有关。     

苦碟子注射液对氧糖剥夺/复氧损伤大鼠C6胶质细胞IκBα/NF-κB蛋白的调节作用

目的研究苦碟子注射液对氧糖剥夺/复氧(OGD/R)损伤大鼠C6胶质细胞的保护作用及对IκBα/NF-κB蛋白活化的影响。方法将C6胶质细胞分为空白对照组、OGD/R模型组、苦碟子注射液组,采用OGD/R方法建立C6胶质细胞损伤模型。MTT法确定氧糖剥夺/复氧时间和苦碟子注射液的最佳有效浓度;LDH漏出率检测细胞死亡率;Western Blot法检测p-IκBα/IκBα、p-NF-κB/NF-κB蛋白表达。结果 C6胶质细胞OGD/R时间为OGD24h/R6h,苦碟子注射液最佳浓度为1.25%。OGD/R损伤后,细胞IκBα和NF-κB的表达上调及磷酸化蛋白增加;苦碟子注射液能够显著降低细胞死亡率,降低细胞p-IκBα和p-NF-κB蛋白高表达。结论 OGD/R损伤C6胶质细胞,促进了IκBα/NF-κB磷酸化,苦碟子注射液可抑制C6胶质细胞中IκBα/NF-κB磷酸化活化,降低细胞死亡率,对胶质细胞起到保护作用。     

黄芪甲苷通过调控ET-1对糖氧剥夺致损伤星形胶质细胞中 NLRP3通路的影响北大核心

目的:研究黄芪甲苷通过调控内皮素(ET-1)影响星形胶质细胞中NLRP3通路的作用机制。方法:糖氧剥夺构建星形胶质细胞损伤模型,用qRT-PCR检测细胞中ET-1 mRNA表达,鉴定造模成功与否。CCK-8法筛选黄芪甲苷对模型细胞干预的最佳作用浓度(30μmol/L)和时间(24 h)。细胞分为5组:正常对照组、模型组、心钠肽(ET-1抑制剂)组、黄芪甲苷组、联合组。CCK-8检测各组细胞的增殖能力;流式细胞术检测细胞凋亡情况;qRT-PCR检测Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表达;ELISA检测炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18水平;Western Blot检测NLRP3通路蛋白NLRP3、Caspase-1表达。结果:与正常对照组比较,模型组细胞增殖能力及Bcl-2蛋白表达显著降低,细胞凋亡率、炎症因子水平及Bax、Caspase-3 mRNA表达和NLRP3、Caspase-1蛋白表达显著升高(P<0.05)。与模型组比较,各给药组细胞增殖能力及Bcl-2蛋白表达显著升高,细胞凋亡率、炎症因子水平及Bax、Caspase-3 mRNA表达和NLRP3、Caspase-1蛋白表达显著降低(P<0.05),其中联合组的效果最显著。结论:黄芪甲苷可通过抑制ET-1表达进而抑制NLRP3信号通路来保护缺血性星形胶质细胞损伤。     

氧化槐定碱对新生大鼠海马神经元氧糖剥夺再灌注损伤后细胞凋亡的影响

目的:研究氧化槐定碱对原代培养新生大鼠海马神经元氧糖剥夺再灌注损伤后细胞调亡的影响。方法:以原代培养的新生大鼠海马神经元为研究对象建立氧糖剥夺再灌注损伤模型。Hoechst 33342和TUNEL染色法检测海马神经细胞凋亡,透射电子显微镜术观察凋亡细胞形态学变化,化学比色法测定海马神经细胞Caspase-3、Caspase-9和Caspase-8的活性,免疫蛋白印迹技术和实时荧光定量PCR技术检测凋亡相关因子Cytochrome C、Caspase-3、Bcl-2、Bax和PARP-1的蛋白和mRNA的表达。结果:与正常组比较,损伤组Hoechst 33342和TUNEL染色法显示神经细胞凋亡率明显升高;Caspase-3、Caspase-9和Caspase-8活性显著提高;Cytochrome C、Caspase-3、Bax和PARP-1蛋白和mRNA水平明显上调,Bcl-2蛋白和mRNA水平明显下调,Bcl-2/Bax比率也明显下调。与损伤组比较,氧化槐定碱治疗组(20、5、1.25mg/L)可显著改善氧糖剥夺再灌注损伤所致的神经细胞凋亡的形态学变化,并降低神经细胞凋亡率;明显抑制Caspase-3、Caspase-9和Caspase-8的活性。氧化槐定碱治疗组(20mg/L)可明显抑制Cytochrome C、Caspase-3、Bax和PARP-1蛋白和mRNA表达,增强Bcl-2蛋白和mRNA的表达,使Bcl-2/Bax比率上升。结论:氧化槐定碱通过抗凋亡作用对氧糖剥夺再灌注损伤的大鼠海马神经细胞发挥保护作用。     

三七皂苷R_1通过雌激素受体调节ATF6/Akt信号通路减轻OGD/R所导致的神经元损伤

三七皂苷R_1(notoginsenoside R_1,NGR_1)是传统中药三七的重要活性成分,也是雌激素受体激动剂。因其蕴含抗炎、抗氧化、抗凋亡等多种功能,故在疾病治疗中被普遍运用。为阐明NGR_1在缺血缺氧性脑病(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)中的潜在神经保护作用机制,该研究采用原代皮层神经元建立氧糖剥夺再灌注(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)损伤模型,并且给予NGR_1及雌激素受体阻断剂ICI-182780处理,然后分别采用MTT,LDH和Hochest 33342染色检测神经元存活率、细胞膜完整性和凋亡,Western blot检测抗凋亡通路ATF6α,p-Akt,Akt蛋白及凋亡相关蛋白Bax,Cleaved Caspase-3的表达。结果显示:神经元在OGD/R损伤后,其细胞存活率明显下降(P0.05)、细胞膜相对完整性显著降低(P0.05)、细胞凋亡加重(P0.05),ATF6α,p-Akt表达下调且促凋亡蛋白Bax,Cleaved Caspase-3表达增加(P0.05)。NGR_1处理后能够减轻OGD/R造成的神经元细胞损伤,上调ATF6α表达、促进Akt磷酸化并且减少Bax,Cleaved Caspase-3蛋白的表达(P0.05),但是,NGR_1的这些神经保护性作用能够被雌激素受体阻断剂ICI-182780阻断。研究结果证实:NGR_1在缺血缺氧情况下对神经元具有保护性作用,该保护作用可能是NGR_1通过雌激素受体调控ATF6/Akt信号通路实现的。     

芎麻滴丸对血管性认知障碍过程中细胞凋亡及Caspase-3、Fas蛋白的影响

目的探讨芎麻滴丸对脑缺血致血管性认知障碍(VCI)发病过程中神经元细胞凋亡和Caspase-3、Fas凋亡蛋白动态变化的干预机制。方法采用永久性结扎双侧颈总动脉(2-VO)的方法建立VCI大鼠模型,于模型建立前3 d给予不同剂量的芎麻滴丸及阳性对照药,分别于术后7、14、28、42 d采用TUNEL法检测海马CA1区神经元凋亡,用免疫组织化学法检测脑组织Caspase-3、Fas蛋白表达。结果与假手术组相比,7、14、28、42 d模型组大鼠海马中均出现凋亡细胞(P0.01),7、28、42 d模型组Caspase-3阳性表达显著升高(P0.01),14 d和28 d模型组Fas阳性表达显著升高(P0.05,P0.01);与模型组相比,7、28、42 d时芎麻滴丸0.375~1.5 g/kg剂量组和银杏叶片组,14 d芎麻滴丸0.375 g/kg剂量组和银杏叶片组凋亡细胞均显著减少(P0.01),与模型组相比,除7 d银杏叶片组和14 d芎麻滴丸1.5 g/kg组外,7、14、28、42 d芎麻滴丸0.375~1.5 g/kg组及银杏叶片组Caspase-3阳性表达均显著降低(P0.05,P0.01),14、28 d芎麻滴丸0.375~0.75 g/kg量组和银杏叶片组,28 d芎麻滴丸1.5 g/kg剂量组Fas阳性表达显著降低(P0.05,P0.01)。结论脑缺血致VCI过程中会通过Fas信号途径伴随有诱导细胞凋亡,且Fas的过度表达时间早于Caspase-3。芎麻滴丸可以抑制VCI发病过程中细胞凋亡的发生,其机制与抑制凋亡蛋白Caspase-3、Fas有关,以芎麻滴丸0.375 g/kg剂量效果最为显著,在脑缺血初期使用药物进行干预更有助于延缓或阻止VCI的发生。     

二参颗粒对氯化钴诱导的H9C2细胞氧化应激介导的细胞凋亡的保护作用

目的:通过观察二参颗粒对氯化钴(CoCl_2)诱导的缺氧损伤和大鼠心肌细胞H9C2凋亡的影响,阐明二参颗粒对心脏的保护作用。方法:以500μmol/L的CoCl_2与H9C2细胞共同作用24 h,建立心肌细胞缺氧缺血模型。将H9C2细胞分为空白对照组、模型对照组、二参颗粒50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL组。酶联免疫法检测胞外培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的含量,流式细胞术检测胞内活性氧(ROS)含量、线粒体膜电位(MMP)和凋亡水平,蛋白质印迹分析法检测细胞内Bcl-2/Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9和Cleaved PARP的表达水平。结果:与空白对照组比较,模型对照组细胞活力下降、活性氧(ROS)荧光表达值升高、线粒体膜电位JC-1单体阳性细胞显著升高以及细胞培养液中LDH含量升高,凋亡率显著升高,凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9和Cleaved PARP的蛋白表达上调,Bcl-2/Bax比值降低(P<0.05或P<0.01);与模型对照组比较,二参颗粒能有效改善细胞活力,降低LDH的含量,显著降低胞内ROS荧光表达值,改善线粒体膜电位和凋亡水平,下调凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9和Cleaved PARP的蛋白表达,升高Bcl-2/Bax的比值(P<0.05或P<0.01)。结论:二参颗粒可以抑制CoCl_2诱导的心肌细胞ROS水平,减少氧化应激发生,进而改善氧化应激介导的心肌细胞的细胞凋亡。     

马齿苋酰胺E干预肾癌的作用机制研究

目的探讨马齿苋酰胺E对人肾癌786-O细胞增殖、迁移和侵袭的作用及机制。方法体外培养786-O细胞,给予马齿苋酰胺E(10、20、40μmol/L)进行干预,采用CCK-8法检测细胞增殖情况;采用划痕实验检测细胞迁移能力;采用Transwell小室法检测细胞侵袭能力;采用AO/EB试剂盒检测细胞凋亡率。建立裸鼠移植瘤肾癌模型,给予马齿苋酰胺E(3、15mg/kg)进行干预,测定各组裸鼠肿瘤质量及体积,采用苏木素-伊红(HE)染色法观察肿瘤组织病理变化;采用Westernblotting法检测786-O细胞和荷瘤裸鼠瘤组织中细胞增殖标志物如Ki67、增殖细胞核抗原(proliferatingcellnuclear antigen,PCNA)及凋亡标志物如活化半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved Caspase-3)、Cleaved Caspase-9及侵袭相关蛋白如基质金属蛋白酶-2(matrixmetalloproteinase-2,MMP-2)、MMP-9及希佩尔-林道抑癌基因(VonHippel-Lindau,VHL)/缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)通路相关蛋白VHL、HIF-1α的表达情况。结果马齿苋酰胺E显著抑制786-O细胞活力(P<0.05、0.01),下调Ki67、PCNA蛋白表达水平(P<0.05、0.01);明显促进786-O细胞凋亡(P<0.05、0.01),上调Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表达水平(P<0.05、0.01);有效改善786-O细胞迁移与侵袭能力(P<0.05、0.01),显著降低MMP-2、MMP-9蛋白表达水平(P<0.05、0.01);显著上调VHL蛋白表达水平(P<0.05、0.01)并显著下调HIF-1α蛋白表达水平(P<0.01)。马齿苋酰胺E可有效降低荷瘤裸鼠肿瘤质量与体积(P<0.05、0.01),抑制肿瘤细胞增殖并促进其凋亡,显著下调Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9、HIF-1α蛋白表达水平(P<0.05、0.01),显著上调Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、VHL蛋白表达水平(P<0.05、0.01)。结论马齿苋酰胺E体外可有效抑制786-O细胞增殖、迁移与侵袭,促进786-O细胞凋亡,体内可有效降低荷瘤裸鼠肿瘤质量与体积,其作用机制可能与调控VHL/HIF通路及其下游蛋白表达有关。     

养阴消癥方对糖尿病性脑内微小病变实验大鼠的保护作用

目的观察养阴消癥方对糖尿病性脑内微小病变大鼠的治疗效果。方法 Wistar大鼠24只,除正常对照组6只外,其余大鼠建立糖尿病性脑内微小病变模型,造模成功后分为高糖损伤组、阿司匹林组、中药组。各组动物灌肠相应药物共3个月。通过生化、流式细胞仪(PI)测定等观察大鼠脑内微小病变的变化情况;通过Realtime PCR、Western blot测定HIF-1α的变化情况。结果①糖化血红蛋白吸光度、流式细胞仪检测凋亡率结果表明,与高糖损伤组比较,阿司匹林组、中药组糖化血红蛋白吸光度、脑神经细胞凋亡率都有所减少,且各组之间相比差异有统计学意义(P0.05)。与阿司匹林组比较,中药组糖化血红蛋白吸光度值明显减少(P0.05);早期、晚期脑神经细胞凋亡率皆减少(P0.05)。②Realtime PCR、Western blot测定结果显示,与高糖损伤组比较,阿司匹林组、中药组HIF-1αmRNA及蛋白表达量都有所减少(P0.05),且各组之间相比差异有统计学意义(P0.05);与阿司匹林组比较,中药组HIF-1αmRNA及蛋白表达量有所减少(P0.05)。③免疫组化结果显示,与高糖损伤组比较,阿司匹林组、中药组HIF-1α阳性表达细胞数有所减少(P0.05);与阿司匹林组比较,中药组HIF-1α阳性表达细胞数差异有统计学意义(P0.01)。结论养阴消癥方对糖尿病性脑内微小病变具有一定的作用,可降低糖化血红蛋白吸光度,降低脑神经细胞凋亡率,降低HIF-1α的表达。     

芹菜素对氧糖剥夺损伤小胶质细胞的抗炎作用

目的探讨芹菜素对氧糖剥夺(OGD)损伤后复氧复糖(OGD/R)小胶质细胞中白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)产生的影响。方法将原代培养的小胶质细胞随机分为正常组、二甲基亚砜(DMSO)组及芹菜素(10、25、50μmol/L)组,其中DMSO组和芹菜素组小胶质细胞进行OGD8h,之后加入相应药物培养基,观察24h后,收集细胞上清,用双抗夹心酶联免疫吸附法检测上清中IL-1β、TNF-α含量。结果24h后DMSO组细胞上清中IL-1β、TNF-α含量增多(P0.01)。芹菜素组TNF-α、IL-1β分泌量明显低于DMSO组。芹菜素可以抑制OGD后小胶质细胞的炎症反应,且呈剂量依赖性。结论芹菜素可以通过减少OGD/R小胶质细胞中IL-1β、TNF-α的产生而发挥神经保护作用。     

地黄多糖对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤后氧化应激和细胞凋亡的影响

目的:研究地黄多糖(polysaccharides from Rehmanniae Radix,PRR)对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤后氧化应激和细胞凋亡的影响,并探讨其可能的作用机制。方法:分离并培养乳鼠心肌细胞72 h后随机分为空白组,缺氧/复氧(H/R)模型组,PRR 10,20,40 mg·L~(-1)干预组和舒血宁注射液(SXN,100 mg·L~(-1))干预组,每组设10个复孔。各组细胞经药物干预6 h后,采用噻唑蓝(MTT)检测细胞存活率;检测培养基中天门冬氨酸氨基转移酶(AST),肌酸激酶(CK),乳酸脱氢酶(LDH)活性;测定细胞中超氧化物歧化酶(SOD),过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量;采用流式细胞仪检测细胞凋亡状况并计算凋亡率,通过实时荧光定量-聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测凋亡相关基因B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax)mRNA表达并计算Bcl-2/Bax表达,通过蛋白质免疫印迹(Western blot)方法检测细胞中凋亡相关蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)表达并进行半定量分析。结果:与正常组比较,H/R模型组细胞存活率显著降低(P0.01),培养基中AST,CK,LDH活性显著升高(P0.01),细胞中SOD,CAT活性显著降低,MDA含量显著升高(P0.01),细胞凋亡率显著升高(P0.01),细胞中Bcl-2和Bax mRNA表达明显升高(P0.05,P0.01),Bcl-2/Bax表达显著降低(P0.01),Caspase-3蛋白表达显著升高(P0.01);与H/R模型组比较,PRR 20,40 mg·L~(-1)干预组乳鼠心肌细胞存活率明显升高(P0.05,P0.01),培养基中AST,CK,LDH活性明显降低(P0.05,P0.01),细胞中SOD,CAT活性明显升高,且MDA含量明显降低(P0.05,P0.01),细胞凋亡率显著降低(P0.01),细胞中凋亡相关基因Bcl-2 mRNA明显上调而Bax mRNA明显下调,Bcl-2/Bax显著升高(P0.05,P0.01),Caspase-3蛋白表达量明显降低(P0.05,P0.01)。结论:PRR能够通过抑制氧化应激损伤和细胞凋亡而对H/R损伤乳鼠心肌细胞起到一定的保护作用;作用机制可能与其改善抗氧化酶活性,上调抑凋亡基因Bcl-2表达、下调促凋亡基因Bax表达,提高Bcl-2/Bax表达,以及抑制促凋亡蛋白Caspase-3表达有关。     

失笑散降低氧糖剥夺再灌注BV2细胞损伤及NLRP3的表达

目的：研究失笑散对BV2细胞氧糖剥夺再灌注（OGD/R）模型的保护作用及潜在机制。方法：将BV2细胞分为对照组,模型（OGD/R）组及失笑散组。失笑散组用不同浓度（1、10、20、50、100 μg/mL）预处理BV2细胞2 h。对照组正常培养,不给药,不进行糖氧剥夺（OGD）;模型组不给药,与失笑散组同时进行OGD,缺氧结束后再灌注24 h,收集细胞及其上清液。CCK-8法检测BV2细胞的活力;流式细胞术检测BV2细胞的凋亡;实时定量PCR和ELISA分别检测BV2细胞TNF-α、IL-6和NLRP3及相关蛋白Caspase-1、IL-1β、IL-18的mRNA和蛋白表达。结果：不同浓度失笑散并不影响BV2细胞活力。与对照组比较,模型组BV2细胞凋亡显著增多（P<0.01）,而高浓度失笑散明显减少BV2细胞凋亡（P<0.05）。实时定量PCR和ELISA结果表明,与模型组比较,失笑散观察组BV2细胞TNF-α、IL-6和NLRP3炎性小体及相关蛋白Caspase-1、IL-1β、IL-18的mRNA和蛋白表达量明显减少（P<0.05)。结论：失笑散减轻OGD/R对BV2细胞的损伤及降低炎症介质的表达,机制可能与调控NLRP3炎性小体介导的炎症信号通路有关。     

桃红四物汤对人脑微血管内皮细胞OGD损伤的保护作用及机制

目的:通过建立糖氧剥夺(OGD)诱导的人脑微血管内皮细胞(h-BMECs)损伤模型,观察桃红四物汤对细胞的保护作用及机制。方法:体外建立人脑微血管内皮细胞糖氧剥夺损伤模型,随机分为正常组、模型组、桃红四物汤高、中、低质量浓度组(0.8,0.4,0.2 g·L-1)和阳性药尼莫地平组。噻唑蓝(MTT)比色法检测h-BMECs细胞活性,酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)水平、细胞中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性,采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测内皮细胞血管内皮生长因子(VEGF)和缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达水平。结果:桃红四物汤可显著提高拟缺血损伤的人脑微血管内皮细胞活性,降低LDH漏出率(P0.05,P0.01),改善细胞形态,降低MDA水平(P0.05),增强SOD活性(P0.05,P0.01)。增加内皮细胞VEGF和HIF-α蛋白的表达(P0.05,P0.01)。结论:桃红四物汤对拟缺血损伤人脑微血管内皮细胞具有保护作用,其机制与增强细胞抗氧化能力,通过HIF-α途径增强VEGF表达有关,显示中药组方可发挥整体调节的治疗优势。     

清脑滴丸对急性脑缺血再灌注大鼠JNK蛋白与细胞凋亡的影响

目的从JNK蛋白表达探讨清脑滴丸治疗急性脑缺血再灌注损伤引发细胞凋亡的作用机制。方法线栓法制备大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型,随机分为假手术组、脑缺血1.5 h再灌注24 h模型组(I1.5hR24组)和清脑滴丸治疗组。TTC染色检测脑梗死面积,Western blot法检测大脑缺血侧皮层的JNK及磷酸化蛋白表达,TUNEL法检测细胞凋亡。结果与假手术组比较,I1.5hR24组大鼠脑梗死面积增大,p-JNK蛋白表达明显增加,细胞凋亡明显;清脑滴丸治疗组pJNK蛋白相对含量减少,细胞凋亡抑制,脑梗死面积减小,差异有统计学意义(P0.01)。结论清脑滴丸可能通过抑制JNK磷酸化蛋白过表达,降低细胞凋亡,从而减轻脑缺血再灌注的损伤。     

黄芪多糖抑制缺氧/复氧损伤乳鼠心肌细胞凋亡与自噬机制研究

目的:探讨黄芪多糖(APS)对缺氧/复氧(H/R)所致乳鼠心肌细胞凋亡与自噬抑制作用的相关机制。方法:分离并体外培养乳鼠心肌细胞3 d后制备H/R损伤细胞模型,设正常对照组、H/R组、APS低、中、高剂量(20、40、80 μmol/ml)组,各组于造模前30 min给药处理。复氧2 h后,CCK-8法检测细胞增殖抑制率,Annexin V-FITC/PI染色法检测细胞凋亡水平,Western blot法检测p-Akt、Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax、p-mTOR、Beclin1、LC3、P62蛋白表达。结果:与H/R组比较,APS中、高剂量细胞增殖抑制率和凋亡率显著降低(P<0.01),p-Akt、p-mTOR、Bcl-2表达量显著升高而Cleaved Caspase-3、Bax、Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、P62表达量显著降低(P<0.05),Bcl-2/Bax比值显著升高、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著降低(P<0.01)。结论:APS可能通过激活Akt/mTOR通路调控凋亡和自噬相关蛋白表达,对H/R所致乳鼠心肌细胞凋亡与自噬起到抑制作用。     

基于HIF-1信号通路研究芪参益气滴丸治疗心肌缺血的分子机制

芪参益气滴丸临床上用于治疗心绞痛、心肌梗死、心力衰竭等多种心肌缺血类疾病,但其治疗的分子机制尚不明确,复方配伍科学内涵也未系统阐释。该研究拟以网络药理学为基础筛选芪参益气滴丸治疗心肌缺血的特征通路,并结合糖氧剥夺细胞模型进行药效验证,揭示芪参益气滴丸基于特征通路的分子机制。首先开展复方活性成分筛选和靶点预测,确定芪参益气滴丸治疗心肌缺血的关键靶点;利用DAVID数据库对关键靶点进行通路富集分析和功能注释,揭示芪参益气滴丸发挥药效的生物作用及其特征通路;最后利用糖氧剥夺模型对高含量活性成分进行cell counting kit-8(CCK-8)、乳酸脱氢酶(LDH)、蛋白免疫印迹(Western blot)药效实验,基于特征通路揭示芪参益气滴丸治疗心肌缺血的分子机制。网络药理学研究表明芪参益气滴丸含有18个活性成分及82个关键靶点,通过TNF信号通路、HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路等,调节机体的一氧化氮生物合成、细胞凋亡、炎症反应、血管生成等多种生物功能,进而达到保护心肌细胞的作用,其中HIF-1信号通路为特征通路。CCK-8与LDH实验结果表明,复方中的黄芪甲苷、丹参素、人参皂苷Rg_1能浓度依赖性增强细胞生存活力、降低细胞上清液中LDH含量(P0.05)。Western blot实验表明黄芪甲苷能显著下调HIF-1信号通路中丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt1)、低氧诱导因子1α(HIF-1α)蛋白表达,上调血管内皮因子A(VEGFA)蛋白表达,丹参素能显著下调Akt1上游靶点磷脂酰肌醇3-激酶110-α亚基(PIK3CA)、下游靶点HIF-1α蛋白表达,人参皂苷能显著下调HIF-1α蛋白表达、上调VEGFA蛋白表达。故芪参益气滴丸可多靶点多途径治疗心肌缺血,HIF-1信号通路为特征通路。芪参益气滴丸活性成分能协同调控HIF-1信号通路中的靶点以抑制该信号通路的表达,保护心肌细胞。     

白英生物碱通过激活FAS途径诱导人肺癌A549细胞凋亡的研究

目的 探讨白英生物碱(STA)诱导人肺癌A549细胞凋亡及其对Fas途径相关基因表达的影响.方法 采用STA处理体外培养的A549细胞,用MTT法检测细胞增殖抑制率,Annexin V-FITC/PI双染后用流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot检测Fas、FasL、Cleaved caspase-8和Cleaved caspase-3蛋白表达.结果 STA能抑制A549细胞增殖,STA各组细胞抑制率显著升高且呈剂量依赖性,与正常对照组比较差异有统计学意义(P ＜0.01);STA各组细胞凋亡率明显升高,与正常对照组比较差异有统计学意义(P＜ 0.01);Caspase-8/Caspase-3抑制剂能抑制STA诱导细胞凋亡,与同剂量STA组比较差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01);STA各组细胞Fas、FasL、Cleaved caspase-8和Cleaved caspase -3表达显著上升,与正常对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).结论 Fas介导的死亡受体途径参与STA诱导肺癌A549细胞凋亡.