IL-6上调SCD1表达对HepG2细胞脂质合成功能的影响*

目的 探讨IL-6对HepG2细胞硬脂酰辅酶A去饱和酶1 （SCD1）基因的影响及其SCD1基因表达的改变对细胞脂质合成的影响。方法 应用rIL-6刺激HepG2细胞,检测细胞内脂质合成以及细胞SCD1基因水平变化。分别构建人SCD1真核表达质粒和小干扰（small interfering） RNA,转染HepG2细胞,观察改变SCD1水平后HepG2细胞脂代谢相关基因表达的变化以及细胞内脂质合成的变化。结果 rIL-6刺激HepG2细胞甘油三酯水平显著高于对照组（P<0.05）;与空质粒组比,转染真核表达质粒细胞SCD1 蛋白表达增加,细胞脂质合成相关基因SREBP1c和FASN相对水平增加1.35倍和1.27倍,脂质氧化代谢相关基因PPARα和ASCL3水平降低12.3%和13.5%;细胞甘油三酯水平显著升高（P<0.01）,而转染small interfering RNA,再用rIL-6刺激HepG2细胞SCD1蛋白表达显著降低,细胞甘油三酯水平也显著降低（P<0.05）,脂质合成相关基因SREBP1c和FASN水平显著下降了32.3%和51.9%,脂质分解相关基因PPARα相对水平也下降了80%（P<0.05）,而ASCL3水平无显著变化（P=0.832）。结论 rIL-6通过上调HepG2细胞SCD1基因表达,引起细胞内脂质合成增加,导致甘油三酯含量增多。     

Visfatin基因表达下调对小鼠脂肪细胞及肝细胞脂代谢的影响

目的探讨Visfatin基因表达抑制对小鼠脂肪细胞及肝细胞脂代谢相关基因的影响。方法构建并筛选具有最佳抑制率的pGene-sil-Visfatin表达载体,转染小鼠3T3-L1脂肪细胞及Hepa1-6肝细胞,Western印迹法测定两种细胞的Visfatin蛋白水平,实时荧光定量PCR法测定Vis-fatin、脂代谢相关基因的mRNA表达水平,油红O染色法测定脂肪细胞内甘油三酯(TG)含量变化。结果 pGenesil-visfatin可有效抑制两种细胞Vis-fatin蛋白表达。脂肪细胞转染pGenesil-Visfatin后,脂代谢相关基因PPARα/γ,HSL,ATGL,AP2,SREBP1,FAS,ACC mRNA表达均下降(其中PPARγ与ACC P<0.05,余P<0.001),TG含量降低,但无统计学差异;肝细胞转染后,PPARα,SREBP1,FAS以及SREBP2,HMGCR,LDLr mRNA表达显著降低(P<0.001),而HSL,ATGL与ACC变化无统计学意义(P>0.05)。结论 Visfatin基因表达下调可能对细胞脂质代谢具有调节作用。     

小干扰RNA沉默脂肪酸合酶基因对人肝细胞株HepG2脂代谢的影响

目的:研究基因干扰技术沉默脂肪酸合酶(FAS)基因后对人肝细胞株HepG2细胞内外脂质含量及脂代谢相关基因表达的影响。方法:合成3对针对FAS mRNA不同位点序列的小干扰RNA(siRNA),分别转染至人肝细胞株HepG 2,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测空白对照组(HepG2细胞不经过任何处理)、阴性对照组(转染没有任何基因干扰作用的阴性siRNA)、FAS-siR NA-1转染组、FAS-siRNA-2转染组和FAS-siRNA-3转染组的FAS mRNA的表达。蛋白免疫印迹(Western blot)法检测蛋白质的表达水平,筛选出沉默效果最佳的一对siR NA。将最有效siRNA转染至HepG2细胞,48 h后测定细胞内外甘油三酯及总胆固醇含量以及脂代谢相关基因的mRNA表达水平。结果:25 nmol/L si RNA和3μl/孔(24孔板)转染试剂的转染效率最高。FAS-siRNA-3对HepG2的FAS基因的沉默效果最好,FAS-si RNA-3转染组的FAS在mRNA水平和蛋白水平分别降低为空白对照组的(52.33±3.07)%和(51.57±3.14)%。FAS-siRNA-3沉默FAS基因后HepG2的细胞内和细胞外培养液中甘油三酯含量显著低于空白对照组,细胞外总胆固醇含量显著低于空白对照组。与空白对照组比较,FAS-siRNA-3转染组HepG2的肝脂酶基因mRNA表达水平显著升高(P0.0001),微粒体甘油三酯转运蛋白基因mRNA表达水平显著降低(P0.05),差异均有统计学意义。结论:FAS基因沉默可显著降低HepG2细胞内甘油三酯、细胞外培养液甘油三酯和总胆固醇的含量,需进一步的体内外实验加以验证。     

ATF-4过表达对HepG2细胞脂质从头合成的影响

目的观察内质网应激相关因子激活转录因子(ATF)4过表达对肝细胞脂质从头合成通路的影响。方法转染针对HepG细胞ATF-4 siRNA的过表达质粒,分为未转染组、阴性对照组、ATF-4上调组(ATF-4~+组),测定各组HepG2细胞内三酰甘油水平,油红O染色观察细胞脂质沉积,检测各组肝脏脂质从头合成上游转录因子固醇调节元素结合蛋白(SREBP)-1c及下游脂质合成的关键酶乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)、硬酯酰辅酶A去饱和酶(SCD)-1的基因水平,并检测ACC、FAS、SCD-1的蛋白表达水平。结果 ATF-4~+组ATF-4的表达水平比未转染组、阴性对照组显著升高(P0.01);ATF-4+组较阴性对照组TG升高40%(P0.01),油红O染色示脂滴明显增多。ATF-4~+组SREBP-1c基因表达显著增加(P0.05),ACC、FAS、SCD-1的基因表达显著增加(均P0.01),ACC、FAS、SCD-1的蛋白表达增加(均P0.05)。结论 ATF-4过表达可引起HepG2细胞三酰甘油沉积,并引起脂质从头合成通路激活,提示ATF4通过刺激脂质从头合成通路而在肝脏脂质沉积中发挥作用。     

miR-199a-3p对脂肪变性的肝细胞TG含量及Sp1表达的影响

目的 研究miR-199a-3p对脂肪变性的肝细胞TG含量及Sp1表达的影响,明确其具体机制。方法 建立肝细胞脂肪变性体外模型。分别用miR-199a-3p模拟物、抑制剂、阴性对照(NC)及pcDNA3.1-Sp1质粒转染细胞48h,收集细胞样本,以PCR检测mRNA表达水平,Western blotting分析检测蛋白表达,试剂盒检测TG含量。结果 与NC组相比,转染miR-199a-3p模拟物后,细胞内miR-199a-3p表达显著升高(P0.05);细胞内FASN、SREBP1表达显著降低(P0.01),细胞内Sp1mRNA表达显著降低(P0.05);细胞内TG含量显著降低(P0.05);细胞内Sp1蛋白表达显著降低(P0.01)。转染miR-199a-3p抑制剂后,细胞内miR-199a-3p表达显著降低(P0.01);细胞内FASN和SREBP1表达显著升高(P0.05);细胞内TG含量显著升高(P0.05)。转染miR-199a-3p模拟物和pcDNA3.1-Sp1后,细胞内FASN及SREBP1的表达升高,细胞内TG含量显著升高,Hepa 1-6细胞内Sp1蛋白表达显著升高(P0.01)。结论 miR-199a-3p可以抑制Sp1的表达,降低脂肪变性肝细胞内TG含量,改善肝细胞脂肪变性,但其确切机制有待进一步深入研究。     

小檗碱靶向HDAC/H3K9ac/KLF4抑制棕榈酸诱导的HepG2脂肪变性体外实验研究*

目的 探讨小檗碱(BBR)调控HDAC/H3K9ac/KLF4对棕榈酸(PA)诱导的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)细胞模型的保护作用及其可能的机制。方法 应用PA诱导HepG2细胞构建NAFLD细胞模型,采用油红O染色法测定细胞脂肪变,采用Western blot法检测细胞HDAC1、H3K9ac、KLF4、SREBP-1c和PPARγ表达,使用染色质免疫沉淀技术(ChIP)测定KLF4启动子区H3K9ac水平,采用ELISA检测细胞培养上清细胞因子,采用SiRNA技术沉默KLF4基因验证BBR 靶向HDAC/H3K9ac/KLF4对PA诱导的HepG2细胞脂肪变的保护作用。结果 与模型组比,BBR处理使PA诱导的HepG2细胞脂质沉积显著改善,培养上清TNF-α、IL-1β和IL-6水平分别为(514.7±46.4)pg/ml、(241.5±37.7)pg/ml和(362.7±19.9)pg/ml, 均显著低于模型组【分别为(1162.0±110.8)pg/ml、(635.8±73.4)pg/ml和(1110.0±85.1)pg/ml,P＜0.001】;与模型组比,BBR干预组HDAC1蛋白表达降低了19.0%,而H3K9ac和KLF4蛋白表达增加了1.53倍和1.52倍,KLF4启动子区H3K9ac水平增加了3.97倍,脂质合成相关基因SREBP-1c蛋白表达降低了49.1%,脂质分解相关基因PPARγ蛋白表达增加了1.84倍;与空质粒转染组比,转染真核表达质粒细胞HDAC1蛋白表达水平增加了2.02倍,而H3K9ac蛋白表达水平降低了57.1%;与SiRNA-NC转染组比,转染SiRNA-KLF4的HepG2细胞KLF4蛋白表达水平显著下降(P＜0.01),而细胞脂质沉积显著增加,培养上清TNF-α、IL-1β和IL-6水平分别为(887.9±89.9)pg/ml、(471.9±38.4)pg/ml和(793.1±59.3)pg/ml, 均显著高于SiRNA-NC转染组【分别为(534.2±46.1)pg/ml、(260.3±26.9)pg/ml和(372.0±30.6)pg/ml,P＜0.01】,脂质合成相关基因SREBP-1c蛋白表达增加了1.77倍,而脂质分解相关基因PPARγ蛋白表达降低了41.6%。结论 本研究结果提示BBR可能通过调节PA诱导的HepG2细胞HDAC/ H3K9AC表达,激活了KLF4,抑制了细胞内炎症反应和脂质沉积,为临床干预NAFLD提供了新的思路。     

沉默胆固醇调节原件结合蛋白2基因对炎症因子所致HepG2细胞内胆固醇异常积聚的影响

目的 探讨沉默胆固醇调节原件结合蛋白(SREBP)2对炎症因子所致HepG2细胞内脂质异常积聚的影响.方法 通过脂质体转染SREBP2-shRNA质粒、G418抗性筛选HepG2细胞,建立沉默SREBP2的HepG2稳定细胞株(SREBP2 shRNA-HepG2)及阴性对照质粒HepG2稳定细胞株(NC shRNA-HepG2).对两种细胞分别给予无血清培养处理(对照组)、炎症因子[肿瘤坏死因子(TNF)α20ng/ml]、高脂[低密度脂蛋白(LDL) 100 μ g/ml]和联合干预(20ng/ml TNFα +100μg/ml LDL)处理.油红O染色及酶法检测细胞中脂质积聚情况,实时定量PCR和Western blot 分别检测SREBP2及其下游靶基因低密度脂蛋白受体(LDLr)和3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A(HMGCoA)还原酶的基因和蛋白表达情况.对数据用单因素方差分析及2×2×2析因设计方差分析比较. 结果 成功建立阴性对照稳定细胞株NC shRNA-HepG2及抑制SREBP2表达的稳定细胞株SREBP2shRNA-HepG2.在NC shRNA-HepG2细胞中,TNF α处理使细胞内胆固醇积聚增加,并能上调SREBP2下游靶基因LDLr、HMGCoA还原酶基因和蛋白的表达,其mRNA相对表达量分别为1.68±0.03、1.31±0.05,F值分别为107.42,59.08,P值均＜0.01 ;其蛋白相对表达量分别为1.49±0.10、1.54±0.06,F值分别为46.24,247.10,P值均＜0.01.而在SREBP2 shRNA-HepG2细胞中,TNFα对胞内胆固醇沉积的作用可以被明显减弱,进一步基因和蛋白检测结果显示,炎症因子TNF α对LDLr、HMGCoA还原酶的上调作用亦被明显抑制. 结论 炎症因子通过促进SREBP2及其下游靶基因表达致HepG2细胞内胆固醇异常积聚,而通过RNA干扰抑制SREBP2的表达,可以明显减轻炎症因子所致的细胞内胆固醇的异常积聚.     

载脂蛋白C-Ⅲ基因沉默对HepG2细胞脂代谢的影响

目的:研究RNAi技术沉默载脂蛋白C-Ⅲ基因(ApoC3)表达后对HepG2细胞内外脂质含量及其他脂代谢相关基因表达的影响。方法:合成3对针对ApoC3mRNA不同位点序列的小干扰RNA(siRNA),并分组转染至人肝细胞株HepG2,实时荧光定量PCR和酶联免疫吸附法检测ApoC3mRNA及蛋白质的表达水平,筛选出沉默效果最佳的一对siRNA。将最有效的siRNA转染HepG2细胞,48h后测定细胞内外脂质含量以及脂代谢相关基因的mRNA表达水平。结果:25nmol/L siRNA和3μl/孔(24孔板)转染试剂的转染效率最高。ApoC3-siRNA-3对ApoC3基因的沉默效果最好,对mRNA的抑制率为94.6%,上清液中检测不到ApoC-Ⅲ。ApoC3-siRNA-3沉默ApoC3基因后细胞内三酰甘油(TG)和胆固醇含量显著高于对照组,细胞外TG含量显著低于对照组。与对照组比较,ApoC3-siRNA-3沉默组载脂蛋白B100基因mRNA表达水平显著增强,肝脂酶基因mRNA表达水平显著降低。结论:ApoC3基因沉默可显著升高HepG2细胞内TG含量及显著降低细胞外TG含量,其可能机制是通过减少极低密度脂蛋白(VLDL)颗粒的分泌以及增加VLDL残粒的摄取。     

乙型肝炎病毒HBx蛋白诱导肝细胞泛素连接酶RNF5抑制STING/IFN-β信号通路的研究北大核心CSCD

目的研究乙型肝炎病毒编码X蛋白(HBx)对HepG2细胞STING/IFN-β信号通路的影响及其可能存在的机制。方法将含HBV全基因组1.5倍复制子质粒pHBV-48和缺失HBV X基因的HBV复制子质粒pHBV-48-X_(0)分别转染至HepG2细胞,采用细胞免疫荧光染色法观察细胞内HBx蛋白表达情况,同时采用实时荧光定量PCR和Western blot检测细胞内干扰素基因刺激因子(STING)基因表达水平及蛋白含量。分别转染空载体pEGFP-N1和HBV编码X基因表达质粒pEGFP-HBx至HepG2细胞,采用实时荧光定量PCR和Western blot检测细胞内STING及环指蛋白5(RNF5)基因和蛋白含量。采用基因干扰技术减少转染质粒的HepG2细胞RNF5表达,Western blot检测细胞STING、干扰素β(IFN-β)蛋白表达情况;以不同浓度蛋白酶抑制剂MG132处理转染pEGFP-HBx的HepG2细胞,Western blot检测细胞内STING、IFN-β蛋白表达情况。结果转染空载体、pHBV-48及pHBV-48-X_(0)的HepG2细胞STING基因相对含量差异无统计学意义(P>0.05);转染空载体的HepG2细胞STING蛋白(1.14±0.11)相对表达水平较转染pHBV-48的HepG2细胞(0.47±0.09)显著升高(P<0.01),但低于转染pHBV-48-X_(0)的HepG2细胞(2.15±0.18)(P<0.01)。转染空载体及pEGFP-HBx的HepG2细胞STING基因相对含量差异均无统计学意义(均P>0.05),但转染pEGFP-HBx的HepG2细胞STING蛋白(0.48±0.16)相对含量较转染空载体的细胞(0.87±0.22)显著降低(P<0.01);与转染空载体的HepG2细胞相比,转染pEGFP-HBx的HepG2细胞RNF5基因相对表达水平及蛋白相对含量均显著升高(均P<0.01)。减少HepG2细胞RNF5表达后,细胞内STING和IFN-β相对蛋白表达水平均显著升高(P<0.05或P<0.01)。随着蛋白酶抑制剂MG132浓度逐渐升高,表达HBx的HepG2细胞内STING和IFN-β蛋白相对含量逐渐上升。结论乙型肝炎病毒可能通过病毒编码蛋白HBx上调肝细胞泛素连接酶RNF5进而抑制STING/IFN-β信号通路。     

乙型肝炎病毒X蛋白对HepG2细胞脂代谢相关基因表达的影响

目的 探讨乙型肝炎病毒X蛋白(HBX)对脂质代谢相关基因的影响及其在肝细胞脂肪变性发生中的作用. 方法 将质粒pIRES2-eGFP-HBX转染入HepG2细胞中,建立表达HBX的HepG2/HBx细胞模型;以转染空载体pIRES2-eGFP (HepG2/pIRES2细胞)及未转染的HepG2细胞作为对照.转染后24、48、72 h,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达;检测细胞内甘油三酯含量;RT-PCR方法检测固醇调节元件结合蛋白1(SREBP-1)和肝X受体(LXR)αmRNA表达水平;Western blot检测HBX,LXRα及脂肪酸合成酶(FAS)蛋白表达的变化.多组间比较采用成组设计的方差分析,多组间的两两比较采用q检验;各基因表达量之间的关系采用Pearson相关分析.结果 在转染后24、48、72 h,HepG2/HBx细胞和HepG2/pIRES2细胞中有GFP的表达并随时间延长而增多、增强,仅在HepG2/HBx细胞内有HBx表达,并且随时间的延长而逐渐增加,差异有统计学意义(F= 32.21,P＜0.05),提示成功建立HepG2/HBx细胞模型;在转染后24、48、72h,HepG2/HBx细胞内LXRαmRNA相对表达量分别为0.386±0.055、0.505±0.071、0.649±0.058,SREBP-1 mRNA相对表达量分别为0.395±0.055、0.548±0.047、0.795±0.058; LXRα蛋白的相对表达量分别为0.178±0.036、0.263±0.047、0.347±0.058,FAS蛋白相对表达量分别为0.436±0.055、0.608±0.053、0.827±0.046,各相同时间点均较对照组明显增加(P＜0.05或P＜ 0.01),并均随时间的延长而逐渐增多(P＜ 0.05或P＜0.01),且与HBX表达量均呈正相关(rLXPα= 0.994,rSREBP-1= 0.984,r' LXRα=0.989,rFAS=0.991,P＜0.05).HepG2/HBX细胞内TG含量与对照组相比,差异无统计学意义(P＞ 0.05).结论 HBx-LXR α -SREBP- 1/FAS通路可能参与了调节脂质代谢相关基因的转录和表达,可能是引起肝细胞脂肪变发生的重要分子机制之一.     

小凹蛋白1在棕榈酸酯诱导肝细胞脂质沉积中的作用

目的探讨小凹蛋白1（CAV1）在棕榈酸酯（PA）诱导HepG2细胞脂质沉积中的作用及其机制。 方法通过慢病毒载体构建过表达CAV1的HepG2细胞株,以空载体病毒转染组作为阴性对照组,每组细胞分别加入10%脱脂BSA和0.3mMPA处理24 h后,用油红染色观察各组细胞内脂质沉积,GPO-PAP酶法检测甘油三酯(TG)含量,qPCR检测PGC1α,sirt3的mRNA表达水平。 结果PA处理可以显著增加HepG2细胞内脂质沉积（P<0.01）;与对照组相比,过表达CAV1可以显著减少细胞内脂质沉积（P<0.05）,显著上调PGC1α,sirt3的mRNA表达水平（P<0.05）。 结论CAV1可能通过上调PGC1α-sirt3通路抑制PA诱导的HepG2细胞脂质沉积。     

腺病毒介导的肝脏X受体过表达在非酒精性脂肪性肝病中的机制研究

目的探究肝脏X受体(liver X receptor,LXR)在肝脏脂肪代谢中的调控作用和非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)发病的作用机制。方法检测LXR腺病毒感染雄性野生型C57BL/6小鼠体质量、肝脏重量及肝脏甘油三酯(TG)的变化,同时利用qRT-PCR和Western blotting检测小鼠肝脏中脂质合成相关基因以及分解相关基因的表达水平。结果 LXR腺病毒转染的HepG2细胞中LXR水平显著升高,表明LXR腺病毒构建成功。感染LXR腺病毒后,小鼠体质量显著增加,差异有统计学意义(P=0.006)。小鼠肝脏组织重量LXR过表达组较对照组增加1.47倍,差异有统计学意义(P=0.008)。小鼠肝脏中TG含量LXR过表达组较对照组增加1.26倍,差异有统计学意义(P=0.019)。RT-PCR和Western blotting显示,小鼠肝脏中脂质合成相关基因Srebp1 mRNA(P0.001)和Scd1 mRNA(P=0.0015)水平在LXR过表达组显著升高。在脂质分解方面,肝脏脂质分解基因Atgl mRNA(P=0.019)和Hsl mRNA(P=0.012)在LXR过表达组水平显著下调。结论 LXR不仅通过上调脂肪合成相关基因的表达促进肝脏脂质的沉积,还通过抑制脂质分解相关基因的表达促进脂肪肝的发生。     

雷公藤红素通过调节脂质合成及氧化降低HepG2细胞甘油三酯水平的研究

目的探讨雷公藤红素在非酒精性脂肪肝细胞模型中对TG水平的影响,并进一步研究其背后的机制。方法用CCK-8试剂盒确定细胞模型中雷公藤红素给药浓度,TG试剂盒测定HepG2细胞内TG水平。Western blot以及定量即时聚合酶链锁反应检测靶分子蛋白水平以及m RNA水平变化。结果雷公藤红素400 nmol/L组,600 nmol/L组、800 nmol/L组、1000 nmol/L组的TG水平分别为(64.55±1.92)μg/mg、(64.16±2.19)μg/mg、(60.94±2.70)μg/mg、(61.45±1.61)μg/mg,较软脂酸组水平[(69.32±1.79)μg/mg]明显下降(P均0.05)。雷公藤红素600 nmol/L组及1000 nmol/L组中,脂质合成相关的固醇调节因子结合蛋白(sterol-regulatory element-binding protein1c,SREBP-1c)及脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)的表达显著降低,脂质氧化相关基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators-activated receptor gamma,PPARγ)表达水平在600 nmol/L组以及1000 nmol/L组分别为1.11±0.09(相比正常对照组,下同)以及1.16±0.05,较软脂酸组0.86±0.07显著上调(P均0.05)。结论雷公藤红素能显著降低HepG2细胞内TG含量,该作用可能与下调SREBP1c以及FAS表达,上调PPARγ水平有关。     

日本血吸虫感染对小鼠肝脏脂代谢影响机制的初步研究北大核心CSCD

目的探讨日本血吸虫感染对小鼠肝脏肝细胞脂质沉积的影响及作用机制。方法10只Balb/c小鼠随机分为正常组、感染组,每组5只,感染组小鼠经皮肤感染日本血吸虫尾蚴(15±1)条/只,饲养6周。HE染色观察肝脏病理改变,油红O染色观察肝脏脂质沉积,外周血检测肝功能和血脂水平,实时定量PCR检测肝脏脂代谢相关基因表达水平。可溶性虫卵抗原SEA刺激LO2肝细胞系,Nile red染色观察细胞脂质变化情况,实时定量PCR检测LO2细胞脂质合成相关基因表达水平。结果与正常组比,小鼠感染日本血吸虫后,肝脏出现明显的虫卵肉芽肿和纤维化,外周血中的ALT、AST含量显著升高(t_(ALT)=6.432,P<0.01;t_(AST)=3.259,P<0.05)。感染后肝脏中脂滴明显减少;外周血TG、CHOL的水平显著降低(t_(TG)=7.154,P<0.01;t_(CHOL)=8.749,P<0.001);肝脏中脂质合成相关基因Acly、Accs、Fasn表达水平明显降低(t_(Acly)=3.765,P<0.05;t_(Accs)=2.859,P<0.05;t_(Fasn)=3.888,P<0.05),脂质转运相关基因CD36以及脂质氧化分解相关基因Cpt 1表达水平明显升高(t_(CD36)=8.250,P<0.01;t_(Cpt1)=1.297,P<0.05);细胞水平结果显示,SEA组与DMEM组比,SEA刺激后LO2细胞脂质含量明显减少,脂质合成相关基因SREBP-1C、ACLY、ACC、FASN以及甘油三酯合成相关基因DGAT和GPAT的表达水平显著降低(均P<0.05)。结论日本血吸虫感染通过抑制肝细胞脂质合成和促进脂质分解下调肝脏脂质沉积水平。     

siRNA抑制survivin基因及其对人肝癌细胞株HepG2细胞凋亡的影响

目的观察特异小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）抑制survivin基因表达对人肝癌细胞株HepG2细胞凋亡的影响。方法构建survivin-siRNA真核表达载体,利用脂质体转染人肝癌HepG2细胞,采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测survivin基因mRNA表达水平。针对转染后不同的时间点采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测各组细胞的增殖以及HepG2细胞的凋亡情况。结果构建的survivin-siRNA转染组survivin蛋白表达较对照组明显下调,差异有显著性（P〈0.01）,其增殖能力较对照组显著下降（P〈0.001）;而阳性对照组及未转染组对survivin表达及mRNA抑制作用不明显（P=0.219）。结论所构建的针对人survivin-siRNA可显著抑制survivin的表达及HepG2细胞凋亡。     

未知功能基因JAZF1过表达对3T3-L1脂肪细胞糖脂代谢的影响

目的 观察JAZF1基因(Juxtaposed with another zincfinger gene 1)过表达对3T3-L1脂肪细胞糖脂代谢相关基因的影响.方法 采用实时荧光定量PCR(RT-QPCR)法检测JAZF1 mRNA在健康C57BL/6J小鼠多种组织表达分布情况;构建JAZF1真核表达载体并瞬时转染3T3-L1细胞,RT-QPCR法检测JAZF1、糖脂代谢相关基因mRNA的表达;用Western印迹法测定各组细胞JAZF1蛋白水平;油红O染色比色法检测细胞内脂质积聚的变化.结果 转染48 h后,JAZF1转染组脂肪细胞中,JAZF1 mRNA及蛋白表达明显高于阴性对照和空载组,激素敏感脂肪酶(HSL)mRNA表达水平明显增加(P<0.05),脂肪酸合成酶(FAS)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、类固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)mRNA相对表达量明显降低(均P<0.01),脂肪细胞甘油三酯酶(ATGL)、葡萄糖转运子1(GLUT1)、GLUT4 mRNA表达并无明显改变;油红O染色显示JAZF1转染组细胞内脂质积聚明显降低(P<0.05).结论 JAZFl在C57BL/6J小鼠多种组织均有表达,提示其可能在维持正常生理功能中起着一定作用.3T3-L1细胞过表达JAZF1可减少脂质合成、增加脂解,并可明显改善脂质积聚,可能是肥胖和糖尿病治疗的一个潜在靶点.     

应用基因表达谱芯片技术筛选XTP6基因转染细胞差异表达基因

目的应用基因芯片技术,检测乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)反式激活基因XTP6的表达对肝母细胞瘤系HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明XTP6蛋白可能的分子生物学功能.方法设计并合成XTP6基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增XTP6基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的XTP6编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-XTP6.以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析.结果构建的表达载体经过限制性内切酶分析的DNA序列测定,证实准确无误.提取高质量的mRNA,逆转录为cDNA,进行cDNA芯片分析.在1 152个基因表达谱的筛选中,发现21个基因表达水平显著上调,18个基因表达水平显著下调.结论应用基因表达谱芯片成功筛选了XTP6转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明XTP6蛋白可能的生物学功能提供依据.     

亚油酸对纤溶酶原激活物抑制剂-1表达的影响及其机制

目的探讨过氧化体增殖物激活型受体α（PPARα）的特异性激活物亚油酸对HepG2细胞1型纤溶酶原激活物抑制剂（PAI-1）mRNA表达及其活性的影响和在该基因转录调控中的作用机制.方法用不同浓度亚油酸为诱导因素刺激HepG2细胞,采用半定量RT-PCR法检测PAI-1mRNA水平,发色底物法检测PAI-1的活性变化.构建四个含PAI-1启动子序列从-804～＋17间不同长度片段驱动的荧光素酶报告基因质粒,体外瞬时转染HepG2细胞,检测荧光素酶的活性.结果与对照组相比,亚油酸组能使HepG2细胞PAI-1mRNA表达及蛋白活性显著升高（P＜0.05,P＜0.01）,且呈一定剂量依赖性;亚油酸诱导可使PAI-1转录活性显著升高（P＜0.01）;与转染质粒PAI-pGL3-A（-804/＋17）相比较,当转染质粒含有PAI-pGL3-B（-636/＋17）、PAI-pGL3-C（-449/＋17）时,荧光素酶活性显著降低（P＜0.01）;共转染PPARα表达质粒（PPARα-pSG5）的细胞在亚油酸诱导下PAI-1转录活性显著升高（P＜0.01）.结论亚油酸可以增加HepG2细胞PAI-1mRNA表达及其蛋白活性,调节PAI-1的基因转录,PPARα参与亚油酸对PAI-1基因的表达调控;在PAI-1启动子-804～-636、-449～-276区域内存在亚油酸作用的调控PAI-1基因表达的序列.     

hHGF转染HepG2细胞后基因表达谱差异筛选

目的:构建hHGF真核表达载体,并在HepG2细胞中表达,筛选其对HepG2细胞的差异表达基因.方法:构建pcDNA3.1(-)-hHGF载体,测序鉴定:转染HepG2细胞后蛋白免疫印迹检测:运用基因表达谱芯片技术,筛选pcDNA3.1(-)-hHGF和pcDNA3.1(-)载体分别转染HepG2细胞后,提取mRNA并逆转录为cDNA,经表达谱芯片分析差异表达基因.结果:构建的表达载体经酶切和测序确定;转染HepG2细胞后hHGF表达经蛋白免疫印迹证实;经20000个基因的表达谱芯片分析发现,其中有430个基因表达水平显著上调,88个基因表达水平显著下调.结论:筛选出HGF转染HepG2细胞后的差异表达基因,对其在肝细胞中多种作用机制研究提供了重要依据.     

JAZF1基因抑制对3T3-L1脂肪细胞糖、脂代谢的影响

目的 探讨JAZF1基因抑制对3T3-L1脂肪细胞糖、脂代谢相关基因的影响.方法 构建JAZF1小发夹RNA (shRNA)表达载体并转染3T3-L1细胞,实时荧光定量PCR(RT-QPCR)和蛋白印迹法检测JAZF1 mRNA和蛋白水平的表达;氢三放射示踪法检测3T3-L1细胞糖摄取率;蛋白印记法检测糖、脂代谢相关基因蛋白水平;油红O染色检测脂肪细胞甘油三酯(TG)含量变化.结果 成功构建JAZF1-shRNA;转染脂肪细胞48 h后,JAZF1 mRNA和蛋白水平明显低于对照组(P＜0.05);氢3放射性示踪法显示转染组葡萄糖摄取率明显降低(P＜0.05);PPAR-γ蛋白表达升高(P＜0.05),激素敏感脂肪酶(HSL)、内脏脂肪素(Visfatin)、胰岛素诱导基囚-2 (Insig-2)蛋白表达降低(均P＜0.05);油红O染色显示JAZF1转染组细胞内脂质积聚明显,比对照组升高约25％(P＜0.05).结论 JAZF1基因抑制可减少基础糖转运,增加脂质与胆固醇合成,减少脂质分解并减少相关脂肪细胞因子的表达.