RNA干扰技术研究新进展

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由双链RNA介导的序列特异的基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达,具有高效性和高特异性的特点.小干扰RNA(small interfering RNA 或 short interfering RNA,siRNA)是RNAi作用中的效应分子,作为引导序列,按照碱基互补原则识别靶基因转录出的信使RNA(mRNA),并引导沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)复合体结合mRNA.     

RNA干扰对小鼠脾淋巴细胞分泌TNF-α的影响

目的：探讨小干扰RNA（siRNA）对小鼠脾淋巴细胞分泌的肿瘤坏死因子α（TNF-α）的抑制效果。方法：体外PCR扩增合成针对TNF-α靶位点的DNA表达盒，转染经脂多糖（LPS）激活的小鼠脾淋巴细胞，在细胞内源性RNA聚合酶III作用下转录形成siRNA，诱发目标mRNA的降解。于转染后48h收集细胞培养上清。TNF-α浓度用ELISA方法测定。结果：与空白对照组和无关干扰组相比，干扰组TNF-α分泌量明显降低（P〈0．05），抑制率约为16％。结论：RNA干扰技术可以在原代培养的小鼠脾淋巴细胞中发挥特异性干扰作用，产生抑制TNF-α分泌的效果，为TNF-α的基因治疗开拓新途径。     

RNA干扰的途径和机制

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由双链RNA介导的序列特异的基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达,具有高效性和高特异性的特点.现就RNAi的两种途径:小干扰RNA和微小RNA的特点和机制作一综述.     

RNA干扰的途径和机制

［摘要］RNA干扰（RNA interference,RNAi）是由双链RNA介导的序列特异的基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达,具有高效性和高特异性的特点．现就RNAi的两种途径:小干扰RNA和微小RNA的特点和机制作一综述     

TNF-α基因siRNA真核表达载体的构建及其对A549细胞TNF-α和TGF-β1表达的影响

目的:构建靶向肿瘤坏死因子α（TNF-α）基因的小干扰RNA（siRNA）真核表达载体,观察其对人肺腺癌A549细胞中TNF-α和转化生长因子-β1（TGF-β1）表达的影响。方法:依据GenBank中人TNF-α（NM₀00594）序列和siRNA靶序列设计原则,设计并合成一对针对TNF-α的特异性序列（siTNF-α）和一对无关序列（siCon）。退火合成DNA双链,再分别重组入pRNAT-U6.1载体,经过PCR和DNA测序鉴定。将构建好的重组载体pRNAT-U6.1-siTNF-α、pRNAT-U6.1-siCon及空载体pRNAT-U6.1用脂质体介导转染A549细胞株,分别采用RealtimePCR和Westernblot方法检测细胞中TNF-α和TGF-β1mRNA和蛋白的表达水平。结果:PCR和DNA测序鉴定证实载体构建成功;转染pRNAT-U6.1-siTNF-α的A549细胞中TNF-α和TGF-β1mRNA和蛋白表达水平均低于其他3组（FmRNA=478.663,4.081;F蛋白=123.420,6.312,P均<0.05）。结论:成功构建了靶向TNF-α基因的siRNA真核表达载体,该载体能够有效沉默A549细胞中TNF-α的表达,TGF-β1基因表达亦受到抑制。     

RNAi的研究进展

RNAi(RNA interference,即RNA干扰)是指通过反义RNA与正链RNA形成双链RNA特异性地抑制靶基因的现象,它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(有义RNA和反义RNA),从而诱导内源靶基因的mRNA降解,达到阻止基因表达的目的[1-2].RNAi是最近几年发现和发展起来的新兴基因阻断技术.     

Survivin基因靶向RNA干扰重组表达载体的构建和测序

目的:利用RNA干扰(RNAi)技术,以survivin为靶基因,设计构建重组表达载体,并进行测序鉴定. 方法:设计具有短发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pSilencer3.1-H1-hygro中构建重组表达载体,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定后,并进行序列测定. 结果:将合成的DNA序列退火后克隆到载体上,经酶切和测序鉴定确实为所需序列. 结论:Survivin靶向RNA干扰重组表达载体的构建成功,可利用所得的小RNA序列干扰survivin基因的mRNA转录,供抗肿瘤研究参考.     

永生化小鼠小胶质细胞P2X4siRNA靶点的筛选

目的 筛选永生化小鼠小胶质细胞特异性P2X4siRNA.方法 转染FAM-siRNA16 h后,激光扫描共聚焦显微镜检测永生化小鼠小胶质细胞转染效率;将3条特异性siRNA经lipofectamine 2000介导转染永生化小鼠小胶质细胞;72 h后半定量RT-PCR观察干扰前后P2X4 基因mRNA水平表达,比较对应不同位点的三对siRNA片段对P2X4基因的干扰效果,分析RNA干扰的特异性,从中筛选出特异性最高的一条siRNA;转染该序列72 h后Western blot检测P2X4基因蛋白表达.结果 激光扫描共聚焦显微镜显示转染效率达80%;三对siRNA片段中siRNA-F1的沉默效率最高,最大干扰效率达72.2%;Western blot显示转染siRNA-F1后P2X4基因蛋白表达下调.结论 siRNA-F1可有效下调永生化小鼠小胶质细胞中P2X4 基因mRNA表达水平,并且能明显下调P2X4蛋白表达.     

ssp411基因siRNA表达载体的构建与有效干扰质粒的筛选

目的 为探索精子细胞特异表达的新基因ssp411在受精及早胚发育中的功能,设计并构建了以ssp411基因为靶点的RNA干扰表达载体siRNA-ssp411s,筛选其中对ssp411基因有显著干扰作用的表达质粒.方法 根据已知的ssp411 mRNA序列,选择设计三条带发卡结构的核苷酸序列,克隆到含有U6启动子的载体pRNAT-U6.1中并测序分析.用脂质体转染的方法将干扰质粒与表达质粒ssp411-pDsRed共转染293T细胞,24h后,荧光倒置显微镜观察转染效率,并收集细胞,通过实时定量PCR方法检测不同干扰质粒对ssp411 mRNA的干扰效果.结果 3个ssp411的siRNA片断被成功克隆到pRNAT-U6.1质粒载体中,插入片段测序结果与设计的序列完全一致.实时定量PCR结果表明,针对ssp411基因蛋白编码区3-22序列构建的干扰质粒效果最好,干扰效率可达71%.结论 成功构建了能表达ssp411 shRNA(small hairpin RNA)的重组质粒,同时通过共转染技术,筛选到一个干扰效果达70%以上的干扰片断,为建立转基因RNA干扰小鼠模型,在体内研究ssp411基因及蛋白的生殖生物学功能打好基础.     

CTGF特异性siRNA慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的:构建CTGF特异性siRNA慢病毒表达载体并观察其介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)对人肝癌细胞CTGF(connective tissue growth factor,CTGF)表达的影响?方法:针对已经筛选确定的人CTGF基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与Plk0.1-GFP-SP6载体连接产生shRNA 慢病毒载体,经PCR筛选阳性克隆进行DNA测序鉴定?用脂质体转染法将质粒共转染293T 细胞,将包装产生的慢病毒颗粒感染HepG2细胞,Real-time PCR?Western-blot检测CTGF mRNA和蛋白的表达?结果:PCR与DNA测序证实合成的含CTGF shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确?经RNA干扰后的靶细胞CTGF mRNA以及蛋白表达水平明显降低?结论:成功构建人CTGF基因RNA干扰慢病毒载体,体外感染HepG2细胞可有效降低CTGF mRNA和蛋白的表达,为以CTGF基因为靶点的肝癌基因治疗研究奠定了基础?     

RNA干扰及其在喉鳞癌研究中的应用

RNA干扰（RNA interference,RNAi）是指一种双链RNA（double-stranded RNA,dsRNA）分子在mRNA（messenger RNA）水平关闭相应序列基因的表达后,使其沉默或表达下调,从而达到抑制某种特定基因表达的目的,是一种序列特异性的转录后基因沉默。RNA干扰主要通过双链RNA被核酸酶切成21～23个小干扰RNA（small interference RNA,siRNA）,这种siRNA与细胞源性的某些酶和蛋白质形成RNA诊导的沉默复合体,由此复合体介导使与双链RNA同源序列的信使RNA被降解,抑制基因表达;     

人组织因子RNA干扰真核表达载体的构建

目的:利用RNA干扰(RNAi技术,以人组织因子(TF)基因为靶基因,构建特异性的RNA干扰真核细胞表达载体.方法:根据GenBank提供的人TF基因的核苷酸序列,设计具有小发夹结构的2条DNA序列,经退火后成为互补双链,然后将其克隆至干扰载体pSUPER质粒中,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定,最后进行DNA测序.结果:构建成功的针对人TF基因的RNA干扰真核表达载体,经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计序列完全一致.结论:成功构建了针对人TF基因的真核载体,使其可能成为肿瘤基因治疗的一种新方法.     

RNA干扰技术基础与病毒学应用

RNA干扰(RNAi)是指由双链RNA始动的序列特异性转录后基因沉默机制，Fire等首先用这一术语描述双链RNA阻滞线虫基因表达这一现象。现已证实，RNAi不仅存在于线虫，也存在于昆虫、植物、真菌和脊椎动物。1999年Tuschl等将果蝇胚胎提取物中小RNA介导的靶mRNA降解，提出了RNAi的作用模式：大于30个碱基对的长双链RNA(dsRNA)被加工成21～23nt的小干涉RNA(siRNA)，后者可介导特异性mRNA的降解。如今RNAi在发育生物学、基因调控、基因功能的研究以及肿瘤和病毒的基因治疗等方面发挥了重要的作用。     

RNA干涉（RNAi）机制及其在医学研究中的应用

RNAi（RNAinterference，即RNA干涉）是指通过反义RNA与正链RNA形成双链RNA特异性地抑制靶基因的转录后表达的现象，它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA（正义RNA和反义RNA），从而诱导内源靶基因的mRNA降解，达到阻止基因表达的目的。自1998年，Fire小组发现线虫体内存在RNAi（RNA interference，RNAi）现象以来，随后又发现RNAi广泛地存在于植物、果蝇、拟南芥、斑马鱼、小鼠甚至锥虫等大多数真核生物中，具有广阔而重要的生物学意义，并且在医学研究与应用中得到了广泛的关注。     

RNA干扰的研究进展

RNA干扰(RNAi)现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制,是指内源性或外源性与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA),在细胞内特异地降解该mRNA,从而致使特异性的基因有效封闭的过程,是一种序列特异性的转录后基因沉默     

小鼠NOMO1基因RNA干扰载体的构建及其功能的初步研究

目的:构建小鼠NOMO1基因RNA干扰载体,比较其对P19细胞NOMO1基因的抑制效率,以研究NOMO1基因与P19细胞向心肌细胞方向分化的关系?方法:利用Designer3.0软件设计小鼠NOMO1基因干扰片段,合成shRNA序列,再行寡核苷酸双链的合成,退火后形成的寡核苷酸双链克隆到pGPU6/Hygro载体的黏性末端,连接产物转化到感受态细胞,增菌,质粒扩增,质粒DNA抽提,使用PstⅠ?BamHⅠ进行双酶切和DNA测序鉴定重组克隆?将小鼠NOMO1基因RNA干扰载体转染P19细胞,以RT-PCR技术验证NOMO1基因在P19细胞中的mRNA表达?以DMSO诱导分化方案诱导P19细胞向心肌细胞分化,采用定量 RT-PCR技术检测P19细胞中α-MHC等基因mRNA的表达,评估NOMO1与P19干细胞向心肌细胞方向分化的关系?结果:双酶切证实shRNA正确插入质粒,测序结果表明插入的序列正确?载体转染的P19细胞筛选稳定表达株,经RT-PCR和Western blot验证4个位点设计的干扰质粒对NOMO1在P19细胞中的mRNA表达均具有较高的抑制效率?转染后P19细胞的α-MHC基因mRNA表达则显著下调(P < 0.05)?结论:成功构建小鼠NOMO1基因RNA干扰载体,为研究NOMO1基因与P19细胞向心肌细胞方向分化的关系提供了稳定的转染细胞工具,NOMO1可能通过诱导α-MHC等基因表达,促进P19干细胞向中胚层的分化?     

RNA干扰对活化的小鼠巨噬细胞肿瘤坏死因子α表达的影响

目的：观察靶向小鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）基因的小干扰RNA（siRNA）在体外对小鼠巨噬细胞系RAW264．7表达TNF-α的抑制作用。方法：采用化学法合成针对TNF-α mRNA不同位点设计的3条siRNA序列（siRNA1～3）和1条带有荧光标记的BLOCK—IT^TM荧光Oligo（修饰的荧光标记的dsRNA,siRNA4）通过脂质体包裹后将其分别转染至小鼠巨噬细胞系RAW264．7,同时设立1个无任何靶基因的siRNA作为阴性对照（siRNA4）。荧光显微镜下观察siRNA的转染效率;用实时荧光定量PCR和酶联免疫吸附实验（ELISA）法分别检测siRNA对TNF-α的mRNA和蛋白表达的抑制作用。结果：内毒素刺激后6h,巨噬细胞表达TNF-α mRNA和合成分泌的TNF-α量均增加,于9～12h达高峰。利用荧光标记的Oligo观察到siRNA转染效率达72％～80％。siRNA1～4转染巨噬细胞后,siRNA2、3可见内毒素刺激的TNF-α mRNA（0．158±0．030、0．114±0．028）和TNF-α蛋白表达[（1355±348）pg／ml、（817±138）pg／m1]均明显少于未转染组[TNF-α mRNA0．294±0．147,蛋白（2104±32）pg／ml,均P〈0．05],其中siRNA3的抑制率非常显著,达61．2％（P〈0．01）。阴性对照siRNA4对细胞基因及蛋白表达无影响。结论：内毒素可刺激小鼠巨噬细胞TNF-α的合成。化学合成siRNA转染小鼠巨噬细胞能有效抑制TNF-α mRNA及蛋白的表达。     

RNA干扰沉默COX-2对鼻咽癌细胞增殖凋亡及细胞周期的影响

[摘要] 目的 筛选COX-2基因的有效RNA干扰序列,研究沉默COX-2表达对鼻咽癌细胞增殖、凋亡以及细胞周期的影响。方法 人工合成双链的小干扰RNA(siRNA),脂质体法转染鼻咽癌C666-1细胞后,RT-PCR法检测COX-2的mRNA含量表达变化,筛选出沉默COX-2表达的有效RNA干扰序列。MTT法检测细胞增殖的变化,DAPI染色检测细胞凋亡,流式细胞法进行细胞周期分析。结果 设计合成的anti-COX-2b siRNA能够使COX-2 mRNA表达下降90%以上,COX-2基因沉默后,鼻咽癌细胞周期出现G0/G1期阻滞,增殖能力下降,但对凋亡无明显影响。结论 RNA干扰沉默COX-2的表达能够抑制细胞增殖,阻滞细胞周期,可以成为鼻咽癌研究和抗肿瘤基因治疗提供新的思路,进行深入研究。 [关键词] 鼻咽肿瘤 环氧合酶-2 RNA干扰