应用组织工程方法构建瘢痕疙瘩模型

目的 应用组织工程方法构建人瘢痕疙瘩动物模型,并探讨采用这一模型进行瘢痕疙瘩临床和实验室研究的可行性。方法 对人体瘢痕疙瘩组织中成纤维细胞进行原代培养,将体外培养第6~8代的成纤维细胞,接种到培养液预湿的聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)支架,形成体外复合体,将复合体转移至旋转式细胞培养系统容器内培养;1周后种植在20只雌性裸鼠皮下,同体两侧对照,第4、8、16、24周取材,对获得的瘢痕疙瘩组织进行组织学评价。结果 术后裸鼠全部成活。复合体移植24w后,在裸鼠皮下形成的瘢痕疙瘩保持了其原有的胶原形态,在电镜下可观察到植入物内同时存在纤维细胞和成纤维细胞,成纤维细胞内可见丰富的粗面内质网,细胞特性保持不变。结论 PLGA与瘢痕疙瘩成纤维细胞具有较好的亲和性,PLGA-瘢痕疙瘩成纤维细胞复合体在裸鼠体内可形成瘢痕疙瘩,值得进一步开发研制。     

软骨细胞与骨髓间充质干细胞隔离共培养构建组织工程化软骨

目的探讨隔离共培养条件下,软骨细胞诱导骨髓间充质干细胞（BMSCs）向软骨细胞分化并形成软骨组织的能力。方法分别提取并培养兔BMSCs和耳软骨细胞,以5．0×10^7／ml的终浓度接种于聚羟基乙酸／聚乳酸（PGA／PLA）支架上并置于Transwell室内。实验组Transwell下方为贴壁软骨细胞,对照组Transwell下方为DMEM培养液（含10％胎牛血清）。两组BMSCs-支架复合物体外培养8周后植入裸鼠皮下,继续培养6周后取材。通过大体观察、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测、组织学及免疫组织化学等相关检测对新生组织进行评价。结果体外培养期间,实验组和对照组BMSCs在支架上黏附良好并能分泌细胞外基质,RT-PCR检测示实验组Ⅱ型胶原和蛋白聚糖有较强的表达,而对照组两者的表达较低或检测不到。裸鼠皮下培养6周,实验组BMSCs-支架复合物能基本保持原形,组织学染色及免疫组织染色显示新生组织有明显的软骨陷窝形成并表达软骨特异性细胞外基质。对照组BMSCs-支架复合物逐渐皱缩变形,未见形成软骨样组织。结论采用Transwell隔离共培养的方法,软骨细胞能够诱导BMSCs向软骨细胞分化。     

腺病毒介导CDglyTK双自杀基因系统对裸鼠皮下移植瘢痕疙瘩的治疗作用

目的 探讨由大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因/5-氟胞嘧啶(5-Fc)和单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因/丙氧鸟苷(GCV)基因治疗系统整合形成的腺病毒介导CDgly/TK双自杀基因系统对瘢痕疙瘩的治疗作用及其机制.方法 采用皮下移植保留表皮的入瘢痕疙瘩组织块的方法建立瘢痕疙瘩裸鼠模型,术后第7天将20只模型裸鼠分4组,每组5只.A组瘢痕内注射生理盐水;B组瘢痕内注射生理盐水+腹腔注射5-Fc和GCV;C组瘢痕内注射自行构建的莆组CDglyTK双自杀基因腺病毒(CDgly/TK);D组瘢痕内注射CDgly/TK+腹腔注射5-Fc和GCV;用药持续18 d.术后2、7(用药前)、14、21、28、35、42 d测量各组瘢痕疙瘩组织块体积;术后42 d取出瘢痕疙瘩组织块,HE染色进行组织学检查,末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法检测成纤维细胞凋亡情况,免疫组织化学染色检测Bcl-2、Bax蛋白质的表达.结果 用药前和用药后7、14、21、28、35 d,D组瘢痕疙瘩组织块体积(mm3)分别为173±5、172±5、147±5、125±6、112±7和84±9,从用药后14 d开始明显缩小(均P＜0.05);而其他3组瘢痕疙瘩组织块体积均明显增大,从用约后7 d开始各时点测得的体积均明显大于D组(均P＜0.05).D组瘢痕疙瘩组织中有大量小鼠组织细胞浸润,胶原结构破坏和成纤维细胞凋亡明显重于其他3组,Bcl-2蛋门质表达明显弱于而Bax蛋白质表达明显强于其他3组.结论 腺病毒介导的CDglyTK双自杀基因系统在瘢痕疙瘩裸鼠模型中对瘢痕疙瘩产生治疗作用,诱导成纤维细胞凋亡足其主要作用机制.     

瘢痕疙瘩不同部位成纤维细胞增殖凋亡的比较

目的 比较瘢痕疙瘩不同部位成纤维细胞生物学活性,以进一步探讨瘢痕疙瘩形成发展机制。方法 采用体外培养成纤维细胞技术对所有标本进行细胞培养,取6~8代细胞作为实验对象。噻唑蓝(MTT)比色法比较细胞接种后不同时间瘢痕疙瘩不同部位成纤维细胞的增殖活性和碘化丙啶（PI）染色、流式细胞仪比较它们在无血清培养条件下和在不同浓度Fas单克隆抗体(Fas mAb)作用下的细胞凋亡率。结果 瘢痕疙瘩边缘成纤维细胞增殖活性高于中央,两者均高于正常皮肤(P<0.01);无血清培养24 h后,瘢痕疙瘩边缘及中央细胞凋亡率均有所增加,但两者之间无显著性差异(P>0.05);Fas mAb作用下,瘢痕疙瘩边缘及中央细胞均不能正常凋亡,两者之间无显著性差异(P>0.05)。结论 瘢痕疙瘩不同部位成纤维细胞生物学活性不尽相同,瘢痕疙瘩边缘成纤维细胞增殖活性过高可导致其向周围不断增生并浸润生长。     

聚合酶链反应-单链构象多态性技术检测瘢痕疙瘩成纤维细胞p53基因突变

目的：分析瘢痕疙瘩成纤维细胞p53基因突变高发区第4～8外显子的突变及其意义。方法：取手术切除的瘢痕疙瘩和非增生瘢痕各12例，分别采用相应正常皮肤对照，体外培养成纤维细胞，采用聚合酶链反应一单链构象多态性(PCR-SSCP)技术检测p53基因的突变情况。结果：12例瘢痕疙瘩成纤维细胞标本中有9例p53基因外显子4、5、6、7出现突变，非增生瘢痕标本和正常皮肤标本均未检出突变。结论：p53基因突变是瘢痕疙瘩形成和发展的重要因素之一。     

病理性瘢痕中c-myc原癌基因的表达

目的探讨原癌基因ｃ－ｍｙｃ的表达与病理性瘢痕形成的相关性。方法应用免疫组化ＳＰ法检测ｃ－ｍｙｃ蛋白在增生 性瘢痕、瘢痕疙瘩和正常皮肤组织中的表达和分布,并用图像定量分析比较其差异。结果在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的 成纤维细胞中ｃ－ｍｙｃ蛋白呈强阳性表达,与正常皮肤对照组均有显著性差异（Ｐ＜０．０１）。结论增生性瘢痕与瘢痕疙瘩中 ｃ－ｍｙｃ蛋白表达升高提示存在ｃ－ｍｙｃ原癌基因的激活,ｃ－ｍｙｃ原癌基因可能参与了成纤维细胞的分化增殖、胶原合成与 降解以及对细胞因子的调控,并导致瘢痕增生。     

病理性瘢痕成纤维细胞的增殖调控及Fas基因突变的筛选

目的 从细胞生物学及基因水平探讨正常皮肤、增生性瘢痕、瘢痕疙瘩周边部和中央部不同生长特性及瘢痕疙瘩发生的可能机制。方法 （１）取手术切除的正常皮肤、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织各６例为标本,通过细胞培养６～１０代后,应用流式细胞仪、粘附式细胞仪检测不同来源的成纤维细胞ｐ５３蛋白的表达和细胞周期的分布。（２）取瘢痕疙瘩、增生性瘢痕患者的组织及外周血标本,聚合酶链式反应（ＰＣＲ）特异性扩增Ｆａｓ分子外显子     

皮肤成纤维细胞构建组织工程化猪角膜基质样组织

目的探讨以皮肤成纤维细胞为种子细胞,在猪角膜微环境中构建组织工程化角膜基质组织的可行性。方法分离获取胎猪皮肤成纤维细胞经体外培养、扩增。通过转染绿色荧光蛋白(GFP)基因标记细胞,示踪细胞的转归。选取第3代的细胞接种于可吸收生物材料聚羟基乙酸(PGA),形成细胞-生物材料复合物,体外培养1周后,移植于猪的角膜基质层内,于第8周取材进行大体、组织学检查及超微结构观察。以角膜基质细胞为种子细胞构建的组织工程化角膜基质组织作为对照。结果术后8周,实验组角膜逐渐恢复透明,与对照组角膜无明显差别。组织学检查显示形成新生的角膜基质样组织,呈板层状,排列较规则,与对照组角膜组织相似。超微结构观察及胶原纤维直径检测显示,实验组与对照组角膜组织差异无统计学意义。荧光显微镜观察到GFP阳性细胞存在。结论皮肤成纤维细胞可能替代角膜基质细胞,在猪角膜内构建角膜基质样组织。     

三羟基异黄酮对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖及侵袭作用的影响

目的 观察5,7,4'-三羟基异黄酮(Genistein)对体外培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞生长及侵袭作用的影响,探讨其抗纤维化作用的机制.方法 以25、50、100μmol/L浓度Genistein处理体外培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞,MTT法检测细胞增殖活性,3H-脯氨酸掺入法检测细胞胶原合成,Transwell小室趋化运动模型检测细胞侵袭能力.结果 Genistein作用后,瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖及胶原合成作用降低,细胞的侵袭能力显著下降.随着药物浓度增加,对细胞的这种抑制作用也增强.结论 Genistein具有体外抗瘢痕疙瘩成纤维细胞纤维化与侵袭的作用,可成为治疗病理性瘢痕及纤维化疾病的有效药物.     

皮肤成纤维细胞构建组织工程化肌腱的初步研究

目的　探讨以皮肤成纤维细胞为种子细胞的组织工程化肌腱体内形成。方法　取猪自体皮肤成纤维细胞经体外培养、扩增 ,与可吸收生物材料聚羟基乙酸形成细胞—生物材料复合物 ,将该复合物植入手术缺损的右侧趾浅屈肌腱处 ,6周取材 ,对标本进行大体、组织学、电镜检查及生物力学评价。结果　新生组织在大体形态、细胞与胶原排列方式上与正常肌腱相似。新生组织的最大张力和最大应力分别为 1 73 0± 1 8 2与 1 8 9± 1 9N/mm2 ,分别达到左侧同一部位正常肌腱的 57 4%与51 9%。结论　应用组织工程技术以成纤维细胞作为种子细胞可在动物体内形成肌腱样新生组织并能修复肌腱缺损     

偏光显微镜在组织工程血管构建中的应用

目的利用偏光显微镜对组织工程构建血管壁中的胶原成分进行定性分析。方法体外培养、扩增的人脐带动脉平滑肌细胞,将其与可降解生物材料聚乙醇酸(PGA)制成的管状结构结合(实验组),体外培养1周后植入裸鼠背部皮下。于植入后2、4、5、11周时分别取材,普通光镜(HE和Masson染色)及偏光显微镜下观察组织学形态,并比较结果。以无细胞单纯管状PGA-DMEM植入裸鼠背部皮下作为对照。结果偏光显微镜下,随着植入时间的延长,实验组的PGA-平滑肌细胞复合结构从以PGA为主向以胶原和平滑肌细胞为主要成分过渡;对照组则随着PGA的降解无胶原成分形成。偏光显微镜检测结果与光镜下的组织形态学检查结果相同。结论偏光显微镜可用于组织工程血管壁中胶原成分的检测,方法简便且结果可靠。     

组织工程构建人工食管的初步实验研究

目的：初步探讨组织工程制备可降解人工食管的可行性。方法：体外分离、培养、扩增新生牛食管上皮细胞，接种于海绵状胶原蛋白-壳聚糖膜上，然后移植入裸鼠背阔肌表面，通过组织学及扫描、透射电镜观察食管上皮细胞在体内外的增殖与分化情况。结果：培养的新生牛食管上皮细胞在胶原蛋白-壳聚糖膜表面生长良好，食管上皮细胞-胶原蛋白-壳聚糖膜复合物植入裸鼠背阔肌表面2周，食管上皮细胞可进一步分化至10层，术后4周胶原蛋白-壳聚糖膜已被降解吸收。结论：海绵状胶原蛋白-壳聚糖膜是组织工程构建可降解人工食管的优良基质材料。     

INFLUENCE OF QUERCETIN AND X-RAY ON COLLAGEN SYNTHESIS OF CULTURED HUMAN KELOID-DERIVED FIBROBLASTS

KELOID is the dermal disease of excess collagendeposition.Most therapeutic methods to treatthe disease,such as radiation and steroid,etc.,focus on interfering in keloid fibroblast collagen metabo-lism.1Quercetin is a kind of traditional Chinese medicine.I…     

无花果叶水提物对体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的抑制

目的探讨无花果叶水提物对人瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长抑制作用。方法用无花果叶水提物处理体外培养的人成纤维细胞后,进行细胞形态学检测,细胞增殖试验（MTT法）、氯胺T法检测无花果叶提取物对成纤维细胞胶原蛋白合成的抑制。结果无花果叶提取物处理后,成纤维细胞增殖活性降低;同时,胶原蛋白的合成受到抑制。结论无花果叶提取物对瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖有显著地抑制作用,并抑制其合成胶原蛋白。     

自体脂肪源性间充质干细胞修复兔软骨缺损的实验研究

目的 评价腺病毒介导的人转化生长因子β2(Ad-hTGF-β2)基因转染自体兔脂肪间充质干细胞(ADSCs)复合聚乳酸(PLGA)/藻酸钙对关节软骨缺损的修复效果.方法 将20只新西兰大白兔制备双侧膝关节软骨缺损模型.体外培养扩增自体ADSCs,转染Ad-hTGF-β2后,种植于PLGA上,然后将细胞_支架复合物植入兔关节软骨缺损模型;缺损处植入单纯支架、缺损处不做任何处理者,作为对照组.分别于术后4、12及24周处死动物进行大体及组织学观察,并行Ⅱ型胶原免疫组织化学染色.结果 实验组修复区可见新生的陷窝状细胞形成,与周围结合紧密.对照组见大量成纤维细胞,未见软骨样陷窝细胞形成.Ⅱ型胶原染色实验组呈阳性,对照组无明显阳性可见.结论 Ad-hTGF-β2基因转染的白体ADSCs能够修复关节软骨缺损.     

放射性~(90)锶联合手术治疗瘢痕疙瘩的疗效分析

目的:探讨放射性90锶敷贴联合手术治疗皮肤瘢痕疙瘩的临床疗效。方法:对321例1086处瘢痕病变分别采用单纯放射性90锶照射治疗(对照组,75例,210处)和放射性90锶联合手术治疗(治疗组,246例,876处),并随访2～4年观察疗效。结果:治疗组246例患者876处病灶,其中治愈708处,治愈率80.82%(708/876),有效率91.67%(803/876)。对照组75例患者210处病灶,其中治愈141处,治愈率67.14%(141/210),有效率82.38%(173/210)。两组治愈率、有效率比较有统计学差异。肩背部复发率20.51%(32/156),其他部位复发率7.60%(8/105),肩背部和其他部位复发率有统计学差异,肩背部复发率最高。结论:放射性90锶联合手术治疗瘢痕疙瘩是一种效果较好的方法,具有应用和推广的价值。     

自体骨复合多孔支架上颌窦提升同期种植体植入的实验研究

目的:观察聚乳酸材料PLA/PGA在同期植入种植体时的成骨效应及种植效果。方法:将预制成形的PLA/PGA材料,通过上颌窦提升术植入新西兰兔的上颌窦中,同期植入钛种植体,术后4、8、12周进行X线检查观察成骨情况,12周全部处死通过大体、组织学及电镜观察成骨及种植效果。结果:在所有植入PLA/PGA材料的兔上颌窦都有新鲜成熟骨形成,在同期植入的种植体稳定与新形成骨紧密结合,同时材料本身完全吸收。结论:自体骨复合多孔支架上颌窦提升同期种植体植入具有简便高效易行的优点。     

不同支架材料构建组织工程化口腔黏膜的比较

目的比较3种不同支架材料———聚羟基乙酸(PGA)、胶原膜和脱细胞真皮基质材料(A lloderm)在构建组织工程化口腔黏膜方面的特点。方法体外培养、扩增人口腔黏膜上皮细胞和成纤维细胞(OFC)。呈对数生长期的OFC接种至PGA支架上培养7 d后,将口腔黏膜上皮细胞分别与PGA-OFC、胶原膜和A lloderm复合,液面下培养47~d后,进行气-液界面培养7 d。光镜、电镜下进行组织形态学及超微结构观察。结果以PGA为支架构建的组织工程化口腔黏膜,含类似上皮层和固有层,但细胞层次不清;胶原膜上可见口腔黏膜上皮细胞黏附生长,并形成复层上皮样组织,但无成熟的桥粒及基底膜样结构;以A llo-derm作为支架材料的构建物,出现正常上皮形态,含半桥粒及细胞指状突起等超微结构。结论PGA、胶原膜和A lloderm支架材料都能构建出含上皮层和固有层的口腔黏膜样组织;胶原膜由于降解速度和不易操作等特点,而不适宜作为组织工程化口腔黏膜支架材料;A lloderm作为支架的构建物更接近于人类正常口腔黏膜。     

手术联合术后放疗治疗瘢痕疙瘩的临床研究

目的：研究手术联合术后放疗治疗瘢痕疙瘩的临床效果。方法：瘢痕疙瘩85例,随机分为2组,实验组50例,采用瘢痕疙瘩切除缝合或植皮,术后即时放疗;对照组35例,仅行瘢痕疙瘩切除植皮。结果：术后随访6个月－3年,实验组40例（80％）治愈,无复发;5例（10％）轻度瘢痕增生,局部注射康宁克通－A后未复发;5例（10％）复发;对照组6例（17．14％）治愈,29例（82．86％）复发,实验组治愈率明显高于对照组。结论：手术联合术后放疗是治愈瘢痕疙瘩的有效方法。     

力学刺激影响猪骨髓基质干细胞体外软骨形成的初步研究

目的研究力学刺激对猪骨髓基质干细胞(BMSC)体外构建组织工程化软骨的影响.方法取第二代猪BMSC以5×107/cm3的密度接种于聚羟基乙酸/聚羟基乳酸(PGA/PLA)圆盘形支架上,一周后均改用软骨诱导液[高糖DMEM培养基含10%胎牛血清(FBS) 、转化生长因子(TGF)β110 ng/ml、胰岛素样生长因子(IGF)-I 50 ng/ml、地塞米松 40 ng/ml]体外培养.根据不同的施加力分为3组离心组设定离心力100 g,2次/d,30 min/次,间隔12 h;摇床组设定为80 r/min,每天施力8 h;静止培养作为对照组.分别于第4周、第8周进行大体观察、组织学、组织化学、免疫组织化学,蛋白聚糖(GAG)定量等检测,比较不同力学刺激对诱导BMSC体外软骨形成的影响.结果第4周时两实验组,即摇床组及离心组形成的细胞材料复合物基本保持原来的体积与外形,软骨陷窝形成,呈结节状或巢状分布并伴有GAG沉积及胶原合成,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性.静止组体积缩小,有少量软骨陷窝结构形成;8周时两实验组形成的细胞材料复合物形状保持良好,浅灰白色,光泽好;HE染色结果显示大量成熟软骨陷窝形成,核仁清楚并有多处分裂相,细胞外基质沉积均匀;Safranin-O染色显示有大量的GAG形成,Masson染色显示有较多新生胶原组织形成,免疫组化检测Ⅱ型胶原表达强阳性.静止组可见部分陷窝结构分布在复合物外周,其间分布大量纤维样组织,组织化学及免疫组化检测阳性表达区域明显少于实验组.GAG含量两实验组分别为5.98 mg/g和5.62 mg/g,约为正常耳软骨含量的80%左右,明显高于对照组.结论利用BMSC为种子细胞体外构建组织工程化软骨中,施加力学刺激可以促进软骨组织成熟.