PDTC对压力负荷过度诱导小鼠心肌肥大的防护作用及其机制研究

目的 观察吡咯烷二硫基甲酸盐（PDTC）对心肌肥大发生发展的影响并探讨其机制。方法 以缩窄小鼠主动脉弓（TAC）诱导的心肌肥大为模型，观察PDTC对心肌肥大发生发展的影响，并采用EMSA检测心肌组织中NF-κB结合活性，应用Western blot方法分析心肌组织中phospho-GSK3β的表达水平。结果 （1）缩窄小鼠主动脉弓2周后，心脏重量／体重比值与假手术组相比增高48．7％（P〈0．01），而且肥大心肌组织中NF-κB结合活性和phospho-GSK3β（Ser9）蛋白表达明显高于假手术组（P〈0．01）。（2）PDTC可明显减轻TAC诱导的心肌肥大，与TAC模型组相比可以使小鼠心脏重量／体重比值下降16．4％（P〈0．05）。PDTC可抑制心肌组织中NF-κB活性，与TAC模型组相比降低了34．3％（P〈0．01），同时亦可抑制心肌组织中GSK3β（Seig）磷酸化水平，P-GSK3β（Ser9）／GSK3β比TAC模型组降低了22．1％（P〈0．05）。结论 PDTC可以通过抑制NF-κB结合活性和GSK3β（Ser9）磷酸化水平延缓心肌肥大的发生发展。     

NF-κB抑制剂PDTC对CCL19调控人头颈鳞癌细胞增殖活性的作用

目的探讨核因子κB(NF-κB)抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)在CCL19调控人头颈鳞癌细胞活性中的作用。方法依次使用不同浓度PDTC、CCL19、顺铂处理人头颈鳞癌转移细胞PCI-37B,应用TransAMTM NF-κB p65试剂盒、噻唑蓝比色(MTT)、流式细胞仪等方法观察NF-κB活性变化,及其与细胞生长抑制、细胞周期、凋亡的关系。结果不同浓度PDTC可以使CCL19诱导的NF-κB活性显著降低(P<0.05),同时恢复CCL19作用后的细胞对顺铂化疗的敏感性,使细胞生长抑制率、细胞G1期比例、凋亡率等显著上升(P<0.05)。结论PDTC能阻断CCL19对人头颈鳞癌细胞活性的调控、促使细胞死亡。     

NF-κB特异性抑制剂PDTC对鼠黑素瘤B16细胞增殖及VEGF表达的影响

目的:探讨核因子-κB(NF-κB)特异性抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)对鼠黑素瘤B16细胞增殖及血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法:不同浓度的PDTC作用于B16细胞不同时间后,MTT法测定其对B16细胞增殖的抑制率,ELISA检测PDTC作用下B16细胞VEGF的表达情况。结果:经PDTC处理的实验组,肿瘤细胞增殖活性明显受到抑制(P0.01);与对照组相比,PDTC作用后B16细胞VEGF表达降低(P0.01)。结论:PDTC具有显著抑制鼠黑素瘤B16细胞生长及VEGF表达的作用,是一种有潜力的抑制黑素瘤增殖的药物。     

PDTC干预对左向右分流大鼠模型肺动脉压力的影响

目的 探讨核蛋白因子κB(NF-κB)在左向右分流大鼠模型肺动脉内皮细胞的活性及应用阻断剂(PDTC)干预后肺动脉压力的变化.方法 50只4周龄Wistar雄性大鼠随机分为4组:手术分流组(Tn组)15只,手术+PDTC阻断组(Ti组)15只,假手术对照组(Co组)10只,阴性对照组(Cn组)10只.将Tn组和Ti组30只大鼠通过颈总动脉-颈外静脉吻合术建立左向右分流型肺动脉高压模型,其中Ti组15只大鼠于术前1 h开始腹腔注射PDTC,剂量为120 mg·kg-1·d-1,持续2周,Co组大鼠除了不进行颈总动脉-颈外静脉吻合外,其余手术程序与实验组完全相同.连续饲养12周后,采用心导管术测量右心室收缩压(RVSP);分离大鼠肺动脉内皮细胞,通过凝胶迁移率实验(EMSA)测定各组内皮细胞NF-κB与特定基因识别序列相结合的活性.结果 Tn组NF-κB活性明显高于Cn组(P＜0.01),Ti组NF-κB活性低于Cn组(P＜0.01),而Co组与Cn组相比无统计学差异.Tn组大鼠肺血管MT%与Cn组相比明显升高(P＜0.01);而Ti组与Cn组相比无统计学差异(P＞0.05);Co组与Cn组相比较无统计学差异(P＞0.05).结论 高肺血流所致的大鼠肺血管收缩和结构重建与NF-κB的活性增强有关,阻断剂PDTC可以通过阻断高血流所致的NF-κB信号通路从而干预肺血管重建.     

TRAIL联合PDTC对SGC-7901细胞生长抑制和凋亡诱导的实验研究

目的观察肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）及TRAIL联合核转录因子核因子-κB（NF-κB）活性特异性抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（PDTC）对胃癌细胞SGC-7901的生长抑制和凋亡诱导作用,并寻找逆转TRAIL耐药的方法。方法采用不同浓度的TRAIL及TRAIL联合PDTC作用于胃癌细胞后,MTT法检测细胞生长抑制率,流式细胞仪检测细胞的凋亡率,免疫细胞化学染色方法观察药物作用前后NF-κB表达情况。结果单独使用TRAIL时,随着浓度从50μg/L增加到500μg/L,细胞的生长抑制率和凋亡率逐渐增加（P〈0.05）,但这种作用是非线性的。TRAIL联合0.05μmol/L、0.1μmol/L PDTC后肿瘤细胞的生长抑制率和凋亡率较单用TRAIL显著下降（P〈0.05）;而联合1μmol/L、10μmol/L PDTC后其作用较上有所上升（P〈0.05）。联合作用组p65蛋白在胞核中染色的强度低于单纯使用TRAIL组（P〈0.05）。结论TRAIL对胃癌细胞株SGC-7901具有一定程度的生长抑制和凋亡诱导作用;NF-κB信号转导途径可能具有双向调节作用,大剂量PDTC可能逆转胃癌细胞对TRA...     

PDTC逆转K562/AO2细胞多药耐药性机制研究

目的研究核因子κB（NF-κB）抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（PDTC）逆转K562/AO2细胞耐药效应及其机制。方法采用MTT比色法分别检测K562/AO2细胞的耐药性、PDTC对K562/AO2细胞增殖的影响以及非细胞毒剂量PDTC、维拉帕米（Ver）预作用后K562/AO2细胞药物敏感性的变化,采用免疫细胞组织化学法、RT-PCR检测K562、K562/AO2细胞NF-κB、mdr-1 mRNA表达水平以及PDTC作用一定时间对其影响。结果①K562/AO2细胞对阿霉素（ADM）的耐药性是K562细胞的59倍;非细胞毒剂量PDTC预作用后,ADM对K562/AO2细胞的半数抑制浓度（IC50）显著降低,相对逆转耐药效率为93.03%,强于经典耐药逆转剂Ver的作用81.07%（P〈0.01）;②K562/AO2细胞NF-κB表达水平高于K562细胞（P〈0.01）;PDTC可有效抑制K562/AO2细胞NF-κB表达,伴随mdr-1 mRNA表达减少,呈时间依赖性。结论抑制NF-κB异常活化可部分逆转K562/AO细胞耐药性,其机制与mdr-1 mRNA转录表达减少有关。     

吡咯烷二硫代氨基甲酸盐对癫痫大鼠海马NF-κB及相关炎症因子表达的影响

目的 探讨癫痫大鼠海马组织核转录因子κB(NF-κB)随给药时间的变化规律及NF-κB信号传导通路抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)对NF-κB、肿瘤坏死因子-α(TNF-a)和白细胞介素1β(IL-1β)的影响.方法 应用Western blotting检测戊四氮(PTZ)致痫大鼠海马核蛋白中NF-κB p65在不同时点( 14d、21d、28d、35d)及PDTC干预癫痫大鼠后的表达;应用实时定量PCR及ELISA检测TNF-α、IL-1βmRNA和蛋白水平在PDTC干预前后的变化.结果 NF-κB p65在癫痫大鼠海马核蛋白中含量于14d开始增高,持续至28d,35d后恢复至14d水平;PDTC干预后,NF-κB 165在干预组不同时间点的含量分别为[(0.54±0.07)、(0.65±0.08)、(0.78±0.10)、(0.78±0.10)],低于模型组[(1.20±0.11)、(1.42±0.14)、(1.88 ±-0.16)、(1.25 ±0.10)],差异具有统计学意义(P＜0.01).癫痫发作后海马组织内TNF-α、IL-1β mRNA分别为[(1.34±0.13,0.81±0.17)、(1.64 ±0.17,1.56 ±0.20)、(2.03±0.16,1.65±0.18)、(1.40±0.10,1.30±0.13)],明显高于对照组(P＜0.01),PDTC干预后显著降低TNF-α、IL-1β mRNA的表达[分别为(0.96±0.1,0.57±0.07)、(1.36±0.15,1.09±0.18)、(1.47±0.14,1.25±0.16)、(1.12±0.12,0.85 ±0.12)],与模型组相比差异具有统计学意义(P＜0.01).ELISA检测海马组织内TNF-α、IL-1β蛋白含量与上述结果相似.结论 癫痫发作可诱发海马组织NF-κB的核转位及TNF-α、IL-1β的表达,PDTC能明显抑制癫痫诱发的NF-κB核转位及TNF-α、IL-1β的表达.     

NF-κB抑制剂PDTC增敏TNF-α对乳腺癌细胞的毒性作用

目的 :探讨核因子κB(nuclearfactorkappaB)活化抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷 (pyrro1idinedithiocarbamate,PDTC)对肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactorα,TNF -α)细胞毒性作用的影响。方法 :用MTT法观察TNF -α、PDTC及二者联合作用对乳腺癌细胞系MCF - 7、MDA -MB - 4 35s体外生长的影响。将MDA -MB - 4 35s细胞接种于雌性BALB/c纯系小鼠肾包膜下复制出移植乳腺癌动物模型 ,观察TNF -α、PDTC及联合作用对体内移植肿瘤生长的影响。结果 :单用TNF -α(小于或等于 2 0 0 0U/ml)或PDTC均不影响两种乳腺癌细胞的体外生长 ,但是先PDTC(5 0 μmol)作用 1h ,再应用TNF -α(2 0 0 0U/ml)即可明显地抑制乳腺癌细胞的生长。动物实验中治疗组应用TNF -α(7.5× 10 6U/kg/次 ,2次 /日 ,ip) +PDTC(5 0mg/kg/次 ,2次 /日 ,ip) ,肿瘤平均体积为 1.0 8± 0 .32mm3 ,明显小于对照组平均瘤体 11.6 7± 0 .5 3mm3 (P <0 .0 1) ,单用TNF -α组(10 .96± 1.0 4mm3 )及PDTC组 (11.72± 0 .73mm3 )与对照组比较无显著差异 (P >0 .0 5 )。结论 :NP -κB抑制剂PDTC能够显著增敏TNF -α对乳腺癌细胞的毒性作用 ,抑制乳腺癌细胞的生长。     

核因子-κB在糖尿病大鼠肾组织中的表达及意义

目的:观察链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠肾组织核因子-κB(NF-κB)的变化,以及抑制NF-κB活性对糖尿病大鼠肾组织的影响。方法:60只雄性SPF级Wistar大鼠随机分为3组:C组即正常对照组、M组为糖尿病未干预组、P组为吡咯烷二硫基甲酸酯（PDTC,NF-κB活性抑制剂）干预组。每组20只,以链尿佐菌素造糖尿病模型...     

高糖对INS-1细胞线粒体呼吸链功能的影响

目的 探讨高糖对INS-1细胞线粒体呼吸链功能的影响.方法 将INS-1细胞随机分为正常对照组(葡萄糖5.5mmol/L培养)、高糖组(葡萄糖16.7 mmol/L培养)、N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)+高糖组(NAC 1.0mmol/L+葡萄糖16.7 mmol/L培养),均干预72 h.分光光度计测定呼吸链酶复合物Ⅰ、Ⅲ活性,荧光素酶方法检测细胞内ATP含量,放免法测定胰岛素分泌水平.结果 高糖组的呼吸链酶复合物Ⅰ活性[(1.53±0.24)μmol/(mg·min)]、Ⅲ活性[(1.08±0.22)μmol/(mg·min)]分别较正常对照组的呼吸链酶复合物I活性((2.31±0.33)μmol/(mg·min)]、Ⅲ活性[(1.92±0.39)μmol/(mg·min)]下降,差异有统计学意义(P<0.01).细胞ATP含量及胰岛素分泌水平在高糖组也较正常对照组明显减少(P<0.01).使用抗氧化剂NAC干预高糖组,其线粒体酶复合物Ⅰ、Ⅲ活性、细胞ATP含最及胰岛素分泌水平均显著增加(P<0.05).结论 高糖损伤INS-1细胞的胰岛素分泌可能与损伤线粒体呼吸链功能有关,高糖可能通过氧化应激损伤INS-1细胞线粒体呼吸链功能.     

不同浓度葡萄糖对大鼠胰岛β细胞胰岛素基因表达的影响

目的：研究不同浓度葡萄糖对大鼠胰岛β细胞胰岛素基因表达的影响，探讨非生理浓度葡萄糖在糖尿病发病过程中的作用。方法：用不同浓度葡萄糖分别刺激培养的胰岛β细胞1、7、14天，提取细胞总RNA，运用逆转录(RT)-PCR技术检测胰岛素基因表达的变化。结果：与对照组相比(葡萄糖浓度为5．5mmol/L)，刺激胰岛β细胞1天后，葡萄糖浓度为2．2 mmol/L时，胰岛素基因表达显著降低，当葡萄糖浓度高于对照组时，胰岛素基因的表达量呈浓度依赖性升高；当刺激时间为7天时，除葡萄糖浓度11．1mmol／L外，其余胰岛素基因表达均降低；如果刺激时间延长到14天，非生理浓度葡萄糖均表现为胰岛素基因的抑制作用。结论：短期的血糖升高可以一定程度地刺激胰岛素基因的表达，但长期的高血糖则表现为葡萄糖毒性作用，低血糖也可以抑制胰岛素基因的表达。     

CRIF1参与高糖诱导的rRNA基因转录

目的 探索CRIF1在高糖诱导下对rRNA基因转录中的作用。方法 在HEK293T细胞中,转染CRIF1表达载体或空载对照,培养48h后收取细胞提取总RNA,通过RT-qPCR检测pre-rRNA的mRNA水平;用含0、1、4.5g/L糖浓度的培养基培养HEK293T细胞12h后,收集全细胞提取物,进行Western blot法检测CRIF1蛋白的表达水平;在HEK293T细胞中转染shCRIF1干扰质粒或空载对照,36h后换用含0、1、4.5g/L糖浓度的培养基继续培养细胞12h后,收取细胞提取总RNA,通过RT-qPCR检测pre-rRNA的水平。结果 CRIF1可促进pre-rRNA的表达;随着糖浓度的升高,CRIF1的表达量逐渐增加;敲低CRIF1可抑制糖浓度依赖的pre-rRNA的表达。结论 CRIF1可提高高糖诱导下pre-rRNA的表达水平,从而参与高糖诱导的rRNA基因的转录调控。     

稳定表达DLC-1的淋巴瘤细胞株模型的建立

目的 建立稳定表达肝癌缺失基因-1(DLC-1)的淋巴瘤细胞株.方法 将DLC-1真核表达质粒转染人淋巴瘤细胞株Raji,G418筛选,对获得的Raji细胞株进行Western blot鉴定.结果 酶切和测序鉴定DLC-1的cDNA片段正确插入pcDNA3.1质粒,Western blot鉴定转染后Raji细胞株DLC-1高表达.结论 成功建立了稳定高表达DLC-1的淋巴瘤细胞株.     

MPP+诱导SK-N-SH细胞热休克蛋白的表达研究

目的研究SK-N-SH细胞在受到1-甲基-4-苯基-吡啶离子(MPP )损伤时,细胞内热休克蛋白(HSPs)的表达。方法SK-N-SH细胞中加入不同浓度的MPP 制备帕金森病(PD)细胞模型,分别于培养24 h和48 h时,检测细胞存活率,选择合适的MPP 实验浓度。免疫印迹法(W estern b lot)和免疫细胞化学法观察细胞内Hsp70、Hsp40(HD J-1和HD J-2)和Hsp90的变化。结果细胞存活率检测表明MPP 合适的实验浓度为10~500μmol/L。W estern b lot和免疫细胞化学法检测均显示250μmol/L MPP 处理24 h,细胞内Hsp70含量明显升高(P<0.05);MPP 处理48 h,Hsp70含量随MPP 浓度的升高而下降;Hsp40/HD J-1和Hsp90的变化趋势基本与Hsp70相同;而HD J-2在细胞内的含量无明显改变(P>0.05)。结论HSPs的含量在MPP 制备的PD细胞模型中,随MPP 作用时间的延长而呈现先增加后降低的趋势。     

Insulin/FoxO1/Pdx1/MafA基因在宫内发育迟缓大鼠胰腺发育中的表达

目的:探讨宫内发育迟缓(intrauterine growth retardation,IUGR)大鼠在胚胎期和新生后Insulin/FoxO1/Pdx1/MafA基因的表达?方法:清洁级SD大鼠,雌雄鼠1∶3合笼交配,孕鼠按受孕顺序随机分为2组(IUGR组和对照组)?IUGR组自妊娠第1天至分娩给予正常对照组饲料进食量的半量;对照组妊娠全程任意摄取饲料;应用显微分离及提取技术取大鼠胚胎发育第14.5天?第19.5天及新生大鼠胰腺组织;采用HE染色,光镜观察胰腺不同发育时期形态学变化;使用RT-PCR技术检测胚胎发育第14.5天,第19.5天及新生大鼠胰腺Insulin/FoxO1/Pdx1/MafA基因的表达情况?结果:①与对照组大鼠相比,IUGR组胰腺在发育各期均有形态学上的改变,表现为组织松散,结构不清晰,胰岛数量及面积减少;②Insulin/FoxO1/Pdx1/MafA基因全程均有表达;③Insulin?MafA基因随胎龄的增长表达量增多,与对照组相比,IUGR组Insulin基因表达无明显差异(P > 0.05),而MafA基因表达较之减少(P < 0.05);④FoxO1?Pdx1基因均在胚胎早期表达较多,随胎龄的增长表达量下降,且与对照组相比,IUGR组Pdx1基因表达无明显差异(P > 0.05),FoxO1表达较对照组减少(P < 0.05)?结论:宫内发育迟缓对胰腺发育相关基因Insulin/FoxO1/Pdx1/MafA的表达有影响?     

建立doxycycline诱导表达Xaf1的肿瘤细胞株

[目的]为探索XIAP相关因子1(Xaf1)调节肿瘤细胞凋亡的机制,利用基因开关调节系统(Teton),拟建立由doxycycline调控表达的Xaf1诱导细胞株.[方法]将pTREHA-Xaf1和pWZL-Hyg质粒用基因转染技术转入稳定表达rtTA的Saos-2细胞中.经过hygromycin的抗性筛选,挑出并扩增表达Xaf1的细胞株.在8例实验组中加入doxycycline,和不加doxycycline的8例对照组比较,重复3次实验用免疫印迹法和免疫荧光显微镜检测doxycycline对Xaf1表达的调控.Xaf1诱导的细胞凋亡由流式细胞检测DNA含量来表示.[结果]在30个抗hygromycin的细胞株中,免疫印迹法筛选出5个明显由doxycycline调控诱导表达Xaf1的细胞株,免疫荧光显微镜检测显示doxycycline诱导Xaf1表达于细胞核内.流式细胞检测Xaf1于8h开始诱导Saos细胞凋亡,凋亡率最高约20%,而且不影响细胞周期.[结论]Xaf1-Saos诱导细胞株是研究Xaf1调节肿瘤细胞凋亡机制的良好细胞模型;Xaf1是一种核蛋白,能独立诱导肿瘤细胞凋亡.     

肝X受体激动剂T0901317对INS-1细胞株凋亡的影响

目的探讨肝X受体激动剂T0901317对软脂酸诱导的大鼠胰岛β细胞瘤株INS-1凋亡的促进作用。方法根据不同干预条件分为空白对照组（对照组）,T0901317干预组（T0901317组）。24h、48h后应用MTT检测各组细胞增殖活性;48h后Western blot检测细胞因子Bax及Bcl-2的表达、细胞凋亡应用Caspase-3活力检测、ROS含量应用CM2H2DCFDA试剂盒检测。结果T0901317组细胞增殖活性较对照组增殖受抑制,细胞Caspase-3活性显著高于对照组。T0901317组较对照组上调Bax、下调Bcl-2表达、ROS含量显著升高。结论T0901317可以促进胰岛β细胞的凋亡。     

转染肿瘤坏死因子及反向多药耐药基因对乳腺癌细胞耐药基因表达的影响

目的构建反向pEGFP-MDR1重组表达载体和pDsRed2-TNF-α重组表达载体,在乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR中进行表达,并观察它们对多药耐药(MDR)基因的影响。方法应用RT-PCR和DNA重组技术构建反向绿色荧光蛋白pEGFP-MDR1融合蛋白表达载体和红色荧光蛋白pDsRed2-TNF-α融合蛋白表达载体,分别和同时导入乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR中进行表达,应用荧光显微镜直接观察融合蛋白的表达情况,RT-PCR和免疫细胞化学染色法分别检测转染前后MDR1-mRNA和P糖蛋白表达情况。结果转染了反向pEGFP-MDR1载体的细胞可见到绿色荧光,转染了pDsRed2-TNF-α载体的细胞可见到红色荧光,而同时转染了反向pEGFP-MDR1载体和pDsRed2-TNF-α载体的细胞可见到红色及绿色荧光。转染后的细胞在mRNA水平及蛋白水平明显降低了耐药细胞MCF-7/ADR的MDR1基因的表达。结论反向pEGFP-MDR1融合蛋白和pDsRed2-TNF-α融合蛋白能在乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR中分别及同时获得表达,并能抑制MDR1基因在MCF-7/ADR细胞中的表达,为进一步研究基因治疗联同免疫治疗逆转乳腺癌耐药建立了很好的基础。     

WTK1细胞tk基因突变的多重PCR分析

目的 探讨WTK1细胞tk位点自发和诱发突变体的突变谱和突变热点。方法 用甲磺酸甲酯、丝裂霉素C和叠氮钠染毒WTK1细胞后,筛选出tk基因突变集落,用多重PCR方法对WTK1细胞tk基因突变谱进行分析。结果三种受试物均能诱导WTK1细胞tk位点突变频率增高,且存在剂量-反应关系;所分析的突变体中绝大部分缺失雎基因外显子4和5—7。结论 三种受试物对WTK1细胞均有致突变作用;tk位点的突变存在明显的突变热点。     

mdr1单因素耐药白血病细胞株的构建

目的 构建mdrl单因素耐药白血病细胞株,为研究RNA干扰逆转mdr1所致耐药提供细胞模型。方法 将含mdr1 cDNA全长的真核表达载体通过脂质体转染人对化疗药物敏感的K562细胞内,G418筛选获得转基因单克隆细胞．用RT-PCR检测有无mdr1表达、流式细胞技术检测细胞表面P-gp蛋白含量、Rh123泵出实验检测P-gp功能、MTT检测细胞对药物的敏感性。结果 转mdr1基因细胞K562／mdr1能较高水平表达mdr1,明显表现出对化疗药物的耐药性。结论 通过转基因方法构建mdr1单因素耐药细胞株可为RNA干扰逆转mdr1提供更精确的细胞研究模型。