日本血吸虫消减雌性成虫cDNA文库的建立及其特异表达基因的筛选

目的 筛选雌性日本血吸虫特异表达基因。方法 感染日本血吸虫6周的家兔,用静脉灌注法收集成虫,经核糖核酸固定液固定,分别提取雌、雄成虫总RNA,纯化后获得mRNA,并反转录为cDNA。用抑制性消减杂交技术(SSH)构建雌、雄成虫正向消减(雌虫消减雄虫)及反向消减(雄虫消减雌虫)cDNA文库。用斑点杂交法筛选差异表达基因,挑选目标基因片段(与正向消减探针杂交的信号明显高于与反向消减探针杂交信号的克隆)进行测序、同源性搜索及基因功能预测分析。以日本血吸虫肌动蛋白(actin)基因作内参照,用半定量PCR(semi-quantitative PCR)鉴定目标基因在雌、雄虫体内的表达。结果 得到正向消减及反向消减cDNA文库,斑点杂交筛选出50个雌虫特异性表达的克隆,经测序得到42个表达序列标签(EST),其中,有17个基因(占40.5%)与已知日本血吸虫卵壳蛋白基因高度同源;17个基因(占40.5%)与日本血吸虫未知基因高度同源、且有一小片段与卵壳蛋白基因高度同源;有8个基因(占19.0%)与日本血吸虫其他未知基因高度同源。半定量PCR结果,6个基因在雌虫体内的表达水平明显高于雄虫,分别与GenBank的血吸虫卵壳蛋白基因AY222885、AY222895、AB017097、AF519182、M32281及血吸虫其他基因AY813556高度同源。结论 构建了雌、雄成虫正向消减及反向消减cDNA文库。用SSH可筛选日本血吸虫雌性特异性表达基因。     

日本血吸虫病肝纤维化小鼠肝星状细胞差异表达cDNA文库的构建和筛选

目的构建日本血吸虫病肝纤维化小鼠肝星状细胞差异表达基因的消减cDNA文库,并筛选差异表达基因。方法取日本血吸虫尾蚴经腹部感染小鼠致肝纤维化。采用抑制性消减杂交技术(SSH),分离小鼠肝星状细胞(HSC)及正常小鼠HSC,通过对比寻找差异表达基因。将其与T载体连接(T/A克隆),其产物转化大肠埃希菌DH5α,经文库扩增后,随机挑取白色克隆进行酶切鉴定,克隆经过正、反向杂交,阳性克隆经过测序和BLAST(局部相似性基本查询工具)进行表达序列标签(ESTs)差异基因分析。最后经模拟Northern印迹确认基因表达差异。结果扩增消减cDNA文库获得400余个白色阳性克隆,随机挑取的克隆经酶切鉴定后均有200～600 bp插入片段。ESTs分析获得76个序列,其中70个序列提示与血吸虫病肝纤维化或与其相关的基因,6个在公共数据库中未找到同源序列片段。结论用SSH法及T/A克隆技术成功构建了肝纤维化小鼠HSC与正常小鼠HSC差异表达基因的消减cDNA文库。     

运用消减杂交技术构建IgA肾病肾阳虚证的相关基因文库

目的采用抑制性消减杂交技术构建汉族人IgA肾病肾阳虚证cDNA消减文库。方法以辨病与辨证相结合,以IgA肾病肾阳虚证入手,应用RNA微量扩增、抑制性消减杂交、基因克隆等技术和方法,构建IgA肾病肾阳虚证消减文库。结果该研究成功地构建了IgA肾病肾阳虚证的cDNA消减文库,其中正向消减文库获得276个阳性克隆,反向消减文库获得261个阳性克隆。结论该研究初步构建了IgA肾病肾阳虚证的cDNA消减文库,为进一步筛选和克隆肾阳虚证的相关基因奠定了基础。     

不同毒力株弓形虫速殖子消减cDNA文库的构建

目的构建不同毒力株弓形虫速殖子cDNA消减文库。方法以弓形虫强毒株RH株速殖子为Tester、弱毒株Prugniaud株速殖子为Driver,进行正向抑制性消减杂交;以Prugniaud株为Tester、RH株为Driver,进行反向抑制性消减杂交。分别将获取的2组抑制性消减杂交产物与pGEM-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆并以PCR扩增鉴定插入片段。结果获得正向和反向cDNA消减文库,每个消减文库分别随机挑取384个阳性克隆,PCR扩增显示插入率为98%,片段长度在200~2000bp之间。结论通过抑制性消减杂交技术成功构建2个消减文库,为进一步筛选和鉴定弓形虫毒力相关基因奠定了基础。     

申克孢子丝菌菌丝相和酵母相cDNA消减文库的构建及差异表达基因的筛选

目的构建申克孢子丝菌双相cDNA消减文库,筛选与双相转换相关的差异表达基因。方法运用抑制性消减杂交技术,构建申克孢子丝菌菌丝相（Mycelium,M）和酵母相（Yeast,Y）的正反cDNA消减文库,并对其差异表达的基因进行生物信息学分析。结果 M＋Y文库获得751条表达序列标签（Expressed Sequence Tags,ESTs）,经拼接后获得101条uni-genes;Y＋M文库获得875条ESTs,拼接获得249条unigenes。申克孢子丝菌酵母相菌丝相的转换伴随着不同菌相细胞差异基因的高表达,这些高表达的差异基因可分为结构基因类、代谢酶类、细胞表面分子类及功能不明的细胞分子。结论成功构建了申克孢子丝菌双相转换相关的cDNA消减文库基础上,筛选出部分差异表达基因,为进一步研究申克孢子丝菌致病相关基因奠定了基础。     

日本血吸虫侵袭前后的湖北钉螺转录组研究I RNA-Seq数据的de novo拼接

目的利用基于RNA-seq的二代测序技术分析日本血吸虫侵袭前后的湖北钉螺转录组的表达,为进一步完善湖北钉螺基因结构信息及挖掘血吸虫感染钉螺相关分子标记提供实验数据。方法分别提取日本血吸虫毛蚴感染后第7天、第30天湖北钉螺组织和正常钉螺组织的总RNA,经RNA质量检测合格后建立e DNA文库,利用Illumina NextSeq500测序仪进行测序得到原始序列数据;测序数据经过滤和de novo拼接后,进一步开展转录本注释和聚类分析。结果共得到63 686条广泛通用的基因数据(Unique gene,Unigene),基因功能注释及功能群组聚类分析结果显示,一般性功能蛋白质编码Unigene占比最多(15.36%),其次是信号转导(11.75%)、转录后修饰(8.89%)等,此外还有较高比例的未知功能蛋白质编码Unigene(12.20%)。结论日本血吸虫侵袭后的湖北钉螺转录组表达信息显示有数个基因呈显著性上调或下调表达,本研究为从分子水平研究湖北钉螺与血吸虫感染相互作用奠定了基础。     

自愈水牛血清免疫筛选日本血吸虫cDNA文库

目的　采用自愈水牛血清免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库并寻找日本血吸虫疫苗新候选抗原。　方法　用感染日本血吸虫后的自愈水牛血清免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库,将阳性重组子克隆、测序,对核酸序列进行分析,确定目的基因。　结果　从大陆株日本血吸虫成虫λZAPIIcDNA文库筛到26个阳性克隆,经初步鉴定获3种编码蛋白分子的基因:副肌球蛋白,谷胱甘肽S转移酶,羟基类固醇脱氢酶。　结论　感染日本血吸虫后的自愈水牛血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库,可用于寻找日本血吸虫疫苗新候选抗原。     

日本血吸虫童虫信号序列捕捉cDNA文库的构建及初步筛选

目的建立日本血吸虫童虫信号序列捕捉cDNA(SST-cDNA)文库,筛选日本血吸虫病潜在的疫苗候选分子。方法抽提日本血吸虫童虫mRNA,并转录合成cDNA。将纯化的cDNA插入到载体pAPtag2中,构建SST-cDNA文库。将cDNA文库质粒转染到COS7细胞中进行蛋白表达,通过检测转染细胞中胎盘碱性磷酸酶(PLAP)的活性来判定插入的血吸虫童虫cDNA片段中是否带有信号序列。测定阳性克隆中外源性cDNA的核苷酸序,并通过Blast与Gen-Bank、EST数据库进行比对确定其性质。采用快速扩增cDNA未端序列方法获得基因的全长cDNA序列。用SignalP3.0、TMPred、TargetP服务器对带有信号序列基因的特征进行分析和预测。结果日本血吸虫童虫cDNA被插入到真核表达载体pAPtag2中,成功构建日本血吸虫童虫SST-cDNA文库。限制性内切酶分析表明SST-cDNA文库的容量为5×106cfu。SST-cDNA文库质粒转染到COS7细胞中后,通过近缘筛选获得21个带有信号肽cDNA序列,其中4个为未知新基因序列,5个为已知功能基因,12个与血吸虫EST序列同源。获得了8个基因的全长cDNA序列,演绎氨基酸序列特征分析表明,其中5个为膜结合蛋白基因,3个为外分泌蛋白基因。结论本研究成功构建了日本血吸虫童虫SST-cDNA文库,初步筛选获得了8个带信号肽的外分泌或膜结合蛋白分子基因。     

日本血吸虫童虫cDNA文库的免疫筛选及其生物信息学分析

目的筛选新的可能具有诊断意义的血吸虫蛋白分子,并对其进行生物信息学分析。方法以血吸虫病人血清筛选日本血吸虫15d肝期童虫cDNA文库,对阳性克隆插入片段的核苷酸进行序列分析,将结果通过Internet送入NCBI GenBank进行同源性比较并利用蛋白质分析软件进行生物信息学分析。结果经3轮筛选,共获15个阳性克隆,对其进行测序,获得11个基因,其中5个为编码日本血吸虫线粒体的基因,1个为编码日本血吸虫肌球蛋白的基因,其他5个分别为编码SjCHGC05315、SjCHGC01371、SjCHGC04782、SjCHGC05166、SjCHGC09769的基因。结论从日本血吸虫肝期童虫cDNA文库中筛选到一批日本血吸虫基因,为血吸虫病新的诊断候选分子的研究提供了材料。     

抑制性消减杂交技术筛选NS5ATP13 蛋白的上调基因

目的 应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)NS5ATP13蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库，克隆HCV NS5ATP13蛋白反式激活靶基因。方法 以HCV NS5ATP13表达质粒pcDNA3．1(-)-NS5ATPl3转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(-)为对照；制备转染后的细胞裂解液，从中提取mRNA并合成cDNA，经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析。结果 成功构建人HCV-NS5ATPl3蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到102个白色克隆，进行菌落PCR分析，其中96个均得到100～1000bp插入片段。挑取40个插入片段测序分析，其中2个cDNA片段为未知序列，通过生物信息学分析获得其全长序列，已被GenBank收录，另有34个为已知功能序列。结论成功筛选出2个新的cDNA序列，并获得其全长序列，可能为HCV NS5ATPl3蛋白反式激活相关靶基因。     

人胰腺癌抑制消减cDNA文库的构建

目的应用抑制消减杂交技术(SSH)构建胰腺癌和正常胰腺组织间差异表达的抑制消减cDNA文库。方法分别提取胰腺癌(tester)和癌旁正常胰腺组织(driver)中的总RNA和mRNA．合成双链cDNA，经RsaI酶切后，将胰腺癌双链cDNA分为两组，分别加上不同的接头，再与正常胰腺组织cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR，分离出胰腺癌差异表达基因的cDNA片段。将该差异表达片段克隆至T／A载体，并转化大肠杆菌TOP10F’，经蓝白斑筛选后，再用PcR方法筛选阳性克隆，从而构建胰腺癌抑制消减cDNA文库。结果文库扩增后得到257个白色克隆，随机挑取50个阳性克隆进行PCR扩增分析，其中47个克隆有插入片段．克隆阳性率为94％，片段大小主要集中在300～600bp之间。结论成功构建了人胰腺癌抑制消减cDNA文库，为进一步筛选、克隆胰腺癌特异性表达基因奠定了基础。     

日本血吸虫149个表达序列标签和18个全长cDNA的获取和分析

目的从日本血吸虫成虫cDNA文库中分离、鉴定和分析表达基因序列，为日本血吸虫病的防治提供侯选疫苗和药物靶点。方法构建日本血吸虫成虫cDNA文库，随机挑取重组阳性克隆进行测序，将获取的表达序列标签（Expressed Sequence Tag, EST）登录GenBank；对某些感兴趣的序列进行步移法测序获取全长cDNA，并进行生物信息学分析和登录。结果随机挑取382 个阳性克隆进行测序，获得149个EST，同源性比较发现，部分序列与血吸虫的生活史的不同阶段和不同性别序列有一定的同源性。共获取18个日本血吸虫全长cDNA，大部分为管家基因，其中部分可作为日本血吸虫的候选疫苗分析和药物靶点。结论EST技术有助于快速、经济地获取日本血吸虫表达序列。     

水牛感染血清免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库

目的 筛选新的有潜质的日本血吸虫保护性抗原分子编码基因。方法 用水牛感染血清对日本血吸虫(Schistosoma Japonicum，Sj)成虫cDNA文库进行免疫筛选，将阳性克隆的插入片段进行PCR扩增和序列分析。结果 3轮筛选后，将7个阳性克隆经辅助噬菌体自动剪切并PCR扩增显示，插入的日本血吸虫cDNA片段大小在0．8～2．0kb之间，选取其中4个经DNA测序分析，发现2个未曾报道过的日本血吸虫新基因，分别命名为Sj-IB1和Sj-Rho GTPase-like gene，并在Gene Bank登记注册。结论 水牛感染血清可识别日本血吸虫的特异性抗原分子，这些抗原分子的免疫保护作用值得进一步研究。     

日本血吸虫（中国大陆株）若干酶类基因的发现

目的 运用表达序列标签（EST）技术,从日本血吸虫（Schistosoma japonicum,Sj)cDNA文库中分离、鉴定出有潜在应用价值的血吸虫基因序列。方法 应用EST方法,从日本血吸虫cDNA文库中随机挑选出单个重组克隆,PCR扩增出插入片段,并进行PCR产物直接测序;将获得的序列资料与EBI和GenBank进行BLASTn和BLASTx同源性检索,对可能的酶类基因序列进行分析。结论 采用EST策略,可获得日本血吸虫（中国大陆株）若干酶类基因序列EST,为进一步的cDNA全长坟和克隆奠定基础。     

正常肝组织与肝癌组织差异表达基因消减cDNA文库的构建

目的 构建人正常肝组织与肝癌组织差异表达基因的消减cDNA文库。方法 采用新近建立的抑制消减杂交技术,以癌旁正常肝组织及肝癌组织作为对比材料,分离肝癌组织中不表达或低表达基因的cDNA片段,将其与T载体进行T/A连接构建文库,将连接产物用电穿孔法转化大肠杆菌进行文库扩增后,随机挑取100个白色克隆进行酶切鉴定。结果 扩增消减cDNA文库获得4000余个白色阳性克隆,随机挑取的100个白色克隆进行酶切鉴定。结果 扩增消减cDNA文库获得4000余个白色阳性克隆,随机挑取的100个白色克隆经酶切后均有200-600bp的插入片段。结论 用SSH法及T/A克隆技术成功构建了正常肝组织与肝癌组织差异表达基因的消减cDNA文库,该文库的建立为进一步筛选、克隆肝癌组织中失活或低表达的新的抑癌基因奠定了基因。     

Construction of a metastasis-associated gene subtracted cDNA library of human colorectal carcinoma by suppression subtraction hybridization

AIM: To construct a differentially-expressed gene subtracted cDNA library from two colorectal carcinoma (CRC) cell lines with different metastatic phenotypes by suppression subtractive hybridization. METHODS: Two cell lines of human CRC from the same patient were used. SW620 cell line showing highly metastatic potential was regarded as tester in the forward subtractive hybridization, while SW480 cell line with lowly metastatic potential was treated as tester in the reverse hybridization. Suppression subtractive hybridization (SSH) was employed to obtain cDNA fragments of differentially expressed genes for the metastasis of CRC. These fragments were ligated with T vectors, screened through the blue-white screening system to establish cDNA library. RESULTS: After the blue-white screening, 235 white clones were picked out from the positive-going hybridization and 232 from the reverse. PCR results showed that 200-700 bp inserts were seen in 98% and 91% clones from the forward and reverse hybridizations, respectively. CONCLUSIONS: A subtractive cDNA library of differentially expressed genes specific for metastasis of CRC can be constructed with SSH and T/A cloning techniques.