日本血吸虫尾蚴cDNA文库的构建及分析

目的　构建日本血吸虫尾蚴 c DNA文库。　方法　从日本血吸虫尾蚴中提取总 RNA,运用“SMART c D-NA文库构建试剂盒”构建文库。　结果　所建文库的初始滴度为 1.8× 10 7pfu/ ml,经 1次扩增后的滴度为 2 .5× 10 7pfu/ ml,插入子的平均长度为 1.0 75 kb,重组率为 94 .4 % ,并从该文库中调出了日本血吸虫保守基因 TPI和 JF2的全长 c DNA片段。　结论　构建了日本血吸虫尾蚴 c DNA文库     

日本血吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库的构建

目的 构建日本血吸虫成虫T7噬菌体展示cDNA文库。 方法 用Trizol试剂提取日本血吸虫成虫总RNA，分离纯化mRNA，经随机引物反转录合成双链cDNA。在双链cDNA末端加上定向EcoRⅠ/HindⅢ接头，再用EcoRⅠ和HindⅢ消化，使其成为两端分别带有EcoRⅠ和HindⅢ粘性末端的双链cDNA。收集300 bp以上的双链cDNA片段，与T7Select 10-3b载体连接，经体外包装后，以大肠埃希菌BLT5403为宿主菌构建T7噬菌体展示cDNA文库。通过滴度测定及PCR技术鉴定文库质量，用7种特异性引物以PCR法从文库中钓取目的基因以检测文库的代表性。 结果 原始文库的库容量为4.98×10⁶ pfu，扩增后文库滴度为3.85×10¹¹ pfu/ml。对随机挑取的96个噬菌斑进行PCR鉴定，重组率为93.8%，其中95.6%的插入片段大于300 bp。7种特异性引物均能从文库中钓取到日本血吸虫成虫相关基因。 结论 构建了日本血吸虫成虫T7噬菌体展示cDNA文库。     

免疫筛选日本血吸虫cDNA文库的研究进展

日本血吸虫病是一种流行广泛并严重危害公众健康的人兽共患寄生虫病.目前研制开发高效的抗血吸虫疫苗和新型药物已成为血防科研的热点领域.     

日本血吸虫虫卵cDNA文库的免疫筛选

目的：从日本血吸虫虫卵文库中筛选并鉴定出与免疫诊断及免疫预防有关的基因克隆。方法：采用Ｓ．ｊＳＥＡ超免疫兔血清对日本血吸虫卵文库进行筛选。先去除抗大肠杆菌抗体，经三轮筛选得到１２个阳性克隆，然后，用辅助噬菌体进行体内剪切，经抗菌素平板筛选含重组质粒的阳性菌落，每个菌落分为２份，一份进行ＰＣＲ扩增以测定插入片段的大小。另一份用于制备纯质粒ＤＮＡ模板，进行ＤＮＡ序列测定，通过ＧＣＧ软件对所得ＤＮＡ序列与ＧｅｎＢａｎｋ中的序列进行同源性比较。结果：共筛得１２个阳性克隆，ＰＣＲ后测得其长度大多为１．２ｋｂ，其中８个与Ｓ．ｊ热休克蛋白７０的基因同源，２个与Ｓ．ｊ钙网蛋白同源，１个与Ｓ．ｍｉｍｍｕｎｏｐｈｉｌｉｎ同源，１个与Ｓ．ｊ２３ｋＤａ蛋白同源。结论：本研究首次报道用抗ＳＥＡ血清对日本血吸虫虫卵文库的筛选结果，所得的１２个阳性克隆均为编码日本血吸虫免疫诊断及预防有关的基因。     

人胰腺癌抑制消减cDNA文库的构建

目的应用抑制消减杂交技术(SSH)构建胰腺癌和正常胰腺组织间差异表达的抑制消减cDNA文库。方法分别提取胰腺癌(tester)和癌旁正常胰腺组织(driver)中的总RNA和mRNA．合成双链cDNA，经RsaI酶切后，将胰腺癌双链cDNA分为两组，分别加上不同的接头，再与正常胰腺组织cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR，分离出胰腺癌差异表达基因的cDNA片段。将该差异表达片段克隆至T／A载体，并转化大肠杆菌TOP10F’，经蓝白斑筛选后，再用PcR方法筛选阳性克隆，从而构建胰腺癌抑制消减cDNA文库。结果文库扩增后得到257个白色克隆，随机挑取50个阳性克隆进行PCR扩增分析，其中47个克隆有插入片段．克隆阳性率为94％，片段大小主要集中在300～600bp之间。结论成功构建了人胰腺癌抑制消减cDNA文库，为进一步筛选、克隆胰腺癌特异性表达基因奠定了基础。     

胰腺癌抑制消减cDNA文库的构建及质量分析

目的构建人胰腺癌抑制消减cDNA文库.方法从来源于同一标本的胰腺癌和癌旁正常组织分离poly(A)+ RNA,经反转录后,利用抑制消减杂交(SSH)方法,通过两轮杂交和两次抑制PCR构建了两种组织间差异表达基因的cDNA消减文库.结果挑取500个克隆进行PCR扩增检测是否有插入片段,结果显示其中 457个克隆有插入片段,片段大小范围为 250～750 pb.结论应用消减杂交的方法,再经适当的改进,在去除相同遗传背景的条件下,可以建立较特异的胰腺癌cDNA消减文库,该文库为进一步批量筛选胰腺癌发生的相关基因群并克隆胰腺癌相关表达基因,研究其胰腺癌发生的分子机理与生物学特性间的关系奠定了基础.     

人胰腺癌抑制消减cDNA文库的构建

目的应用抑制消减杂交技术(SSH)构建胰腺癌和正常胰腺组织间差异表达的抑制消减cDNA文库.方法分别提取胰腺癌(tester)和癌旁正常胰腺组织(driver)中的总RNA和mRNA,合成双链cDNA,经Rsa Ⅰ酶切后,将胰腺癌双链cDNA分为两组,分别加上不同的接头,再与正常胰腺组织cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,分离出胰腺癌差异表达基因的cDNA片段.将该差异表达片段克隆至T/A载体,并转化大肠杆菌TOP 10F',经蓝白斑筛选后,再用PCR方法筛选阳性克隆,从而构建胰腺癌抑制消减cDNA文库.结果文库扩增后得到257个白色克隆,随机挑取50个阳性克隆进行PCR扩增分析,其中47个克隆有插入片段,克隆阳性率为94%,片段大小主要集中在300～600bp之间.结论成功构建了人胰腺癌抑制消减cDNA文库,为进一步筛选、克隆胰腺癌特异性表达基因奠定了基础.     

胰腺癌抑制消减cDNA文库的构建及质量分析

目的：构建人胰腺癌抑制消减cDNA库。方法：从来源于同一标本的胰腺癌的和癌旁正常组织分离poly(A)^ RNA,经反转录后，利用抑制消减杂交（SSH）方法，通过两轮杂交和两次抑制PCR构建了两种组织间差异表达基因的cDNA消减库。结果：挑取500个克隆进行PCR扩增检测是否有插入片段，结果显示其中457个克隆有插入片段，片段大小范围为250－750pb。结论：应用消减杂交的方法，再经适当的改进，在去除相同遗传背景的条件下，可以建立较特异的胰腺癌cDNA消减库，该库为进一步批量筛选胰腺癌发生的相关基因群并克隆胰腺癌相关表达基因，研究其胰腺癌发生的分子机理与生物学特性间的关系奠定了基础。     

日本血吸虫未成熟卵抗血清对日本血吸虫cDNA文库的免疫筛选

目的为了获得抗雌虫生殖和卵胚发育相关抗原的血吸虫基因。方法通过采用抗日本血吸虫未成熟卵SIEA26—28kDa免疫血清对日本血吸虫成虫cDNA文库进行筛选。结果共获得阳性克隆23个,经重复筛选之后,随机挑取其中的5个阳性克隆,分别进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳显示获得单一扩增条带,其大小位于150bp～1.5kb之间。结论从SjcDNA文库中筛选出抗卵相关阳性克隆,有关分析鉴定在进一步进行中。     

钉螺对不同宿主源性日本血吸虫毛蚴的易感性

目的了解钉螺对不同终宿主源性日本血吸虫毛蚴的易感性差异。方法收集家兔、水牛和小白鼠排出的虫卵,孵出毛蚴,以毛蚴和钉螺5：1的比例感染同一地钉螺。同时设对照组,观察各组钉螺感染率、死亡率。结果实验组家兔、水牛和小白鼠排出虫卵孵出毛蚴感染钉螺,获得的阳性率分别为1.42%、8.67%和19.87%,钉螺死亡率分别为29.5%、13.5%和24.5%;对照组钉螺阳性率分别为2.63%、2.02%和11.66%,死亡率分别为24.0%、49.5%和18.5%。结论不同宿主源日本血吸虫毛蚴对钉螺易感性存在差异。     

叶巢外睾吸虫感染钉螺对钉螺体内日本血吸虫发育的影响

目的　探讨在日本血吸虫中间宿主湖北钉螺体内叶巢外睾吸虫和日本血吸虫的对抗性。　方法　通过叶巢外睾吸虫和日本血吸虫对湖北钉螺的双重感染 ,计算血吸虫的感染率和尾蚴逸出量 ,常规石蜡切片观察钉螺组织学变化。　结果　钉螺在感染血吸虫 37d后再感染外睾吸虫 ,经一定时间后检查发现 ,血吸虫的感染率为 5 2 9% ,显著低于同时单独感染日本血吸虫对照组的感染率 (75 9% ) ;先感染叶巢外睾吸虫 ,经 10、 32、6 0、 10 0和 12 0d不同的时间间隔后再感染日本血吸虫的钉螺 ,血吸虫感染率分别为 6 4 %、 6 6 7%、 6 5 2 %、5 6 4 %和 5 7 1% ,而单独感染日本血吸虫对照组钉螺血吸虫感染率为 90 5 % ,经统计检验 ,各双重感染实验组血吸虫与对照组的感染率间差异具有显著或非常显著性意义 (P <0 0 5或P <0 0 1)。对各试验组及对照组钉螺逸出尾蚴试验发现 ,试验组钉螺血吸虫尾蚴逸出量均显著低于对照组的逸出量。组织学观察发现各双重感染组钉螺消化腺萎缩 ,消化腺盲囊间隙只有少量血吸虫子胞蚴 ,血吸虫子胞蚴皱缩、变形及不规则 ,且子胞蚴中只含稀疏的尾蚴胚球 ,有的子胞蚴中已无胚球 ;而单独感染血吸虫的对照组中血吸虫均发育到成熟的子胞蚴或尾蚴。　结论　钉螺体内叶巢外睾吸虫和日本血吸虫之间存     

检测日本血吸虫感染性钉螺PCR方法的建立

目的 建立灵敏、特异的检测日本血吸虫感染性钉螺的PCR方法。 方法 根据日本血吸虫18S小亚基单位核糖体核酸（18S-rRNA）基因设计1对引物，建立检测日本血吸虫感染性钉螺的PCR方法。测定PCR产物的DNA序列，稀释血吸虫毛蚴DNA进行PCR方法的灵敏性试验，扩增单尾尾蚴感染的钉螺DNA进行交叉反应试验，并根据不同稀释度的感染性钉螺DNA的扩增结果来验证PCR的群体检测效果。 结果 PCR扩增日本血吸虫感染性钉螺，得到了与靶DNA片段位置相同的产物，测序片段长度为469 bp，与靶DNA相同且序列一致，并将序列登录GenBank(注册号：DQ442999)。扩增阴性钉螺无产物出现。灵敏性试验提示，PCR可检出日本血吸虫毛蚴DNA的最低浓度为40 pg/μl；交叉反应试验显示，PCR方法不能扩增出单尾尾蚴感染钉螺的DNA；群体检测试验表明，PCR可检出感染性钉螺提取的DNA最高稀释度为1∶640。 结论 初步建立的检测日本血吸虫感染性钉螺的PCR方法灵敏、特异且具有良好的群体检测效果。     

日本血吸虫幼虫在钉螺体内发育起点温度的研究

目的　研究环境温度对血吸虫幼虫在钉螺体内生长发育进程的影响程度。　方法　采集无血吸虫感染的钉螺,以钉螺与毛蚴1∶20比例感染,感染后置于30℃、27℃、24℃、21℃和18℃环境中饲养,计算钉螺体内血吸虫的尾蚴开放前期和发育速度,分析尾蚴开放前期和发育速度与环境温度间的相关关系。　结果　21℃、24℃、27℃、30℃时血吸虫的尾蚴平均开放前期分别为(128.89±16.05)d、(95.00±21.03)d、(71.93±12.74)d和(62.74±14.19)d。尾蚴开放前期与环境温度的回归方程为y=730.68x-0.8918(r=0.9976,P<0.01)。血吸虫发育速度与环境温度的回归方程为y=0.0235ln(x)-0.0639(r=0.9973,P<0.01)。从此方程中推算出日本血吸虫幼虫在钉螺体内的发育起点温度为15.17℃±0.43℃。　结论　环境温度降低,钉螺体内血吸虫幼虫发育速度减慢。     

湖北钉螺被目平外睾吸虫与日本血吸虫不同间隔时间感染后分泌物的检测与分析

观察被目平外睾吸虫和日本血吸虫双重感染钉螺后钉螺体内外分泌物及其血吸虫幼虫被击毁的关系。方法 观察钉螺感染外睾吸虫21 d、37 d、55 d、70 d和85 d后再感染血吸虫,经482 d后,取钉螺软体组织作埋蜡连续染色制片。结果与结论 无论单独感染目平外睾吸虫或两种吸虫双重感染,均可在螺软体发现多种分泌物,随时间延长分泌物数量逐渐增多。螺体内含小细胞核的分泌物和螺副腺细胞都出现在各时期的血吸虫残骸体内。     

目平外睾吸虫日本血吸虫不同间隔时间双重感染湖北钉螺螺体血淋巴细胞存在情况的比较

目的 外睾吸虫与日本血吸虫双重感染湖北钉螺,后进入螺体的血吸虫幼虫全部被击毁,双重感染间隔时间愈长,血吸虫幼虫被击毁的效力愈强烈.为要了解钉螺血淋巴细胞在所有螺体存在及进入血吸虫幼虫体内情况是否相同,开展了本实验观察.方法与结果 共检查双重感染间隔时间21d、37d、55 d、70 d、85d5组不同时龄的血吸虫幼虫50条.50条血吸虫幼虫周围螺组织大中小3种血淋巴细胞总数:大1 43粒、中386粒、小219粒;血吸虫幼虫体内3种血淋巴细胞总数:大40粒、中65粒、小60粒;两者总数:大183粒、中451粒、小279粒;每条血吸虫幼虫体及其周围的平均数为:大3.7粒、中9粒、小5.6粒.5组每种血淋巴细胞平均数及百分比情况如下:间隔21d:9(45％)、15.9(35％)、7.4(27％);间隔37 d:4.1(21％)、11(24％)、7.8(29％);间隔55d:3.6(18％)、8.6(18％)、5.2(1 9％);间隔70 d:2(10％)、7.9(17％)、3.4(1 3％);间隔85 d:1.2(6％)、2.9(6％)、3.1(11％).结论 显示间隔时间愈长,大中小3种血淋巴细胞数均逐步下降.     

日本血吸虫幼虫在钉螺及感染外睾吸虫钉螺发育的比较

湖北钉螺先感染外睾吸虫后再感染日本血吸虫,血吸虫幼虫在其体内被击杀(唐崇惕等,2008;2009),本文用日本血吸虫毛蚴分别接触已感染外睾吸虫21d的钉螺和阴性钉螺,观察血吸虫幼虫在此2组实验钉螺体内发育情况。从感染外睾吸虫钉螺再感染血吸虫的28个(73.7%)阳性螺,查获4～82d血吸虫幼虫共300条(侵入率26.74%),全部虫体结构异常停留在早期母胞蚴阶段。从单独感染血吸虫的25粒(69.4%)阳性螺,查获5～61d正常血吸虫母胞蚴67条(侵入率13.96%)和许多不同发育期子胞蚴,感染后75d阳性螺含血吸虫成熟子胞蚴和尾蚴。单独感染血吸虫钉螺的血淋巴细胞增生情况与双重感染外睾吸虫和血吸虫的钉螺存在差异。     

中国大陆湖北钉螺种下分化研究进展

湖北钉螺是日本血吸虫的惟一中间宿主,在日本血吸虫病传播过程中起重要作用,其种下分化及鉴别在血吸虫病防治、钉螺控制等方面具有重要意义。本文基于形态学、细胞生物学、分子生物学等方面证据综述了湖北钉螺种下分化的研究进展,并对今后的研究方向提出了建议。     

日本血吸虫幼虫在先感染外睾吸虫后不同时间钉螺体内被生物控制效果的比较

摘要：前此实验显示：21d外睾吸虫阳性钉螺能使再侵入的全部血吸虫幼虫发育停留在异常早期母胞蚴阶段〔1 3〕。本文实验比较观察了感染外睾吸虫后不同时间（21d、35d、55d、70d及85d）的钉螺对再侵入的日本血吸虫幼虫生物控制的情况,发现外睾吸虫和血吸虫双重感染的钉螺,两者间隔时间愈长,后侵入的血吸虫幼虫被击毁程度愈强（图1 20）;不同间隔时间双重感染的各组实验钉螺,血吸虫幼虫感染率及幼虫侵入率如下：间隔21d,75%(39/52)和25.5%（398/1 560);间隔37d,77.8%（21/27）和 35.6%(299/840);间隔55d,44.4%（8/18）和11.9%(19/160);间隔70d,100%（15/15）和10.6%(143/1 350);间隔85d,43.3%（13/30）和5.8%(66/1 140)。     

日本血吸虫幼虫在钉螺体内发育观察

目的观察日本血吸虫幼虫在钉螺体内的发育过程。方法用毛蚴重感染钉螺后在不同时间对钉螺进行解剖,检出母胞蚴、子胞蚴和尾蚴,用鲍氏液固定,卡红染色,中性树胶封片。结果1~24h的母胞蚴体内可见神经环,2d后消失。母胞蚴体内的胚细胞增多聚集成胚球,一个胚球发育为一个子胞蚴。子胞蚴体内形成不同发育期的胚球,胚球发育成尾蚴。结论观察到毛蚴进入钉螺体内发育成各个阶段的母胞蚴和子胞蚴,以及形成尾蚴和尾蚴从子胞蚴中逸出。