乳糖诱导胸腺融合肽Tα1-TP5在大肠杆菌中的表达

目的研究用乳糖替代异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂诱导胸腺融合肽Tα1-TP5表达,并优化诱导表达条件。方法在摇瓶发酵条件下,以乳糖作为诱导剂,SDS-PAGE电泳和AlphaEase凝胶电泳图像分析系统研究培养基组成、诱导剂浓度、诱导时机、诱导时间、诱导温度和诱导方式等条件对目的肽Tα1-TP5表达量的影响,并与IPTG诱导结果相比较。结果选用TB培养基,在菌体对数生长的中后期加入终浓度为1 g/L的乳糖,37℃诱导6 h,GST-Tα1-TP5融合蛋白的表达量约占菌体总蛋白的35%,且主要以可溶形式表达,与IPTG的诱导结果相同。分批流加乳糖4次和一次性加入乳糖诱导,融合蛋白表达量无明显差异。结论乳糖可以替代IPTG诱导胸腺融合肽Tα1-TP5的表达。     

IL-13融合蛋白表达载体与非融合蛋白表达载体的构建与比较

采用RT－PCR技术直接从激活的健康人外周血单个核细胞中扩增得到hIL－13的基因片段，通过DNA重组技术分别将其插入到含有PRPL启动子的高效表达载体pBV220及含tac启动子、lac1阻遏蛋白基因及凝血酶识别位点的融合蛋白表达载体pGEX－4T－2中，成功地构建了hIL－13的原核非融含蛋白表达菌株hIL－13－PBV220／DHS5a及融合蛋白表达菌株hIL－13－PGEX－4T－2／TG1，分别经42℃热诱导及异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）化学诱导后，SDS－PAGE结果表明IL－13仅以GST融合蛋白的形式在E.coli中获得了表达，表达量约占菌体蛋白总量的10％～30％。IL-13的蛋白单体在原核细胞中表达量很低。     

重组人胸腺素α1融合蛋白在大肠杆菌中表达条件的优化

为提高人胸腺素α1（Tα1）融合蛋白在大肠杆菌中的表达量，研究了本实验室构建的pET39-Tα1重组质粒在E.coli BL21（DE3）宿主菌中的表达条件。经SDS-PAGE和凝胶成像系统GDS-8000分析结果表明，重组菌以LB为培养基，卡那霉素浓度为50mg／L，开始诱导时的菌体密度为（OD600=0．5，所加IPTG的浓度为0．5mmol／L，27．5℃摇床200r／min振荡诱导培养10h时，可在周至空间中获得高效表达的可溶的Tα1融合蛋白，占周质蛋白总量的64．7％，为下一步纯化工作提供了方便。     

新型抗菌蛋白天蚕素-人溶菌酶在大肠杆菌中的表达条件优化及纯化

目的探讨重组家蝇天蚕素-人溶菌酶(Mdc-hly)在大肠杆菌中的表达条件及纯化。方法利用SDS-PAGE电泳和BandScan凝胶电泳图像分析系统研究诱导温度、诱导时机、异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导浓度和诱导时间对融合蛋白表达的影响。融合蛋白经His琼脂糖柱亲和色谱纯化后,Western blot鉴定。结果在起始菌浓度为A600=0.6时加入浓度为1.0 mmol/L的IPTG,37℃诱导6 h,融合蛋白的表达量最高,占菌体总蛋白的39.1%。纯化后融合蛋白纯度可达95%,Western blot鉴定为目的蛋白。结论确定了重组融合蛋白的最佳表达条件,并纯化了目的蛋白。     

抗血小板多肽在大肠杆菌中的克隆和表达

设计 合成了两条编码KGDE（赖－甘－天冬－X）的寡核苷酸链，长度为36个碱基对，两端分别为BamHI 酶和XcoI酶切位点。该基因插入原核高效表达载体PGEX－4T－1的tac启动子下游，获得重组质粒PGEX－4T－1KGDX，转化大肠杆菌DH5a,37℃诱导使重组子表达。GST－KGDX融合蛋白具有可溶性，产量为35mg/L培养基，表达量占菌体总蛋白48．02％。破碎菌体上清经谷胱甘肽－琼脂糖悬珠亲和层析法获得纯度为95％的重组蛋白。^12517E3竞争拮抗实验结果表明，GST无GP11b/IIIa结合作用，GST－KGD融合蛋白能代替7E3竞争性地与GPIIb/IIIa受体特异性结合，从而抑制血小板聚集。其IC50值为40μmol/L。     

肿瘤坏死因子受体1 PLAD结构域工程菌表达条件的优化

为提高可溶性GST-PLAD蛋白的表达量,对含有GST-PLAD基因的E.coli BL21(DE3)工程菌的发酵条件进行优化。采用单因素实验和正交实验,对影响大肠杆菌生长及融合蛋白表达的培养基组分、培养条件进行了优化。结果显示最优培养基配比(%)为:蔗糖0.5、蛋白胨1、酵母提取物1.5、硫酸铵0.4、氯化钠1、硫酸镁0.03;最佳表达条件为:诱导剂IPTG浓度为0.4 mmol/L,37℃培养5.5 h,诱导9 h,摇瓶装瓶量为100 mL/500 mL。表达条件优化后菌体生长密度是优化前的1.89倍,GST-PLAD表达量是优化前的2.05倍。     

抗癫痫肽/GST融合表达载体的构建及蛋白表达

目的构建抗癫痫肽(anti-epilepsy peptide,AEP)/GST融合表达载体,原核表达GST-AEP融合蛋白。方法从克隆载体质粒pGEM-T/AEP中双酶切,得到AEP片段;通过中间载体puc18,转换酶位点;最后将AEP基因克隆入表达载体pGEX-4T-1质粒中,构建融合表达载体pGEX-4T-1/AEP;转化感受态大肠杆菌DH5α,经异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获得GST-AEP融合蛋白;SDS-PAGE分析表达产物,确定蛋白质高表达条件;超声裂解法鉴定蛋白质可容性;凝胶薄层扫描确定蛋白质相对表达量。结果经酶切鉴定、测序证明,AEP基因已正确插入到pGEX-4T-1中,经IPTG诱导后,表达出相对分子质量约为36 000的融合蛋白,该融合蛋白以包涵体形式存在,约占总蛋白质的70%左右。结论pGEX-4T-1/AEP载体构建成功,融合蛋白在大肠杆菌中获得高效表达。     

重组人Shiga-EGF工程菌发酵工艺研究

目的研究表达重组人Shiga EGF(rhShiga EGF)融合蛋白工程菌的发酵条件。方法通过摇瓶试验优选适合工程菌生长、表达的培养基配方、pH及以乳糖替代IPTG作诱导剂等 ,并在 5L发酵罐上进行试验。 结果采用A3配方的培养基 ,在pH 6 .8条件下 ,以乳糖诱导表达 5h ,5L罐发酵工程菌菌密度 (A60 0nm)达到 15 ,菌体湿重 2 7g/L ,目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的 15 %～ 2 0 %。结论确立以乳糖为诱导剂的发酵条件能降低目的蛋白制备成本     

酵母胱硫醚β-合成酶的表达及酶活鉴定

将重组质粒pET45b-yCBS转入E.coli BL21中,构建高效表达酵母胱硫醚β-合成酶(yeast cystathionine β-synthase,1)的重组菌.研究诱导时菌体浓度、诱导剂IPTG浓度、诱导时间和温度,以及在培养基中添加不同浓度的山梨醇、葡萄糖、甘油对1表达量的影响.使用Ni2+亲和色谱柱纯化重组蛋白,再经His-Trap脱盐柱脱盐,以茚三酮法检测蛋白活性.结果表明,培养基中添加0.05％的山梨醇,重组菌在37℃培养3h后,添加终浓度为0.1 mmo/L的IPTG于20℃诱导培养15h,可溶性1表达量达到110 mg/L;纯化后比活为1 320 u/mg.     

蜂毒肽基因在大肠杆菌中的表达、纯化及初步鉴定

目的通过pGEX-2T原核表达载体表达蜂毒肽。方法将人工合成整合了肠激酶作用位点的蜂毒肽基因,插入载体pGEX-2T,构建蜂毒肽与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合表达载体pGEX-MEL。重组质粒转化E.coliBL21(DE3)诱导表达,超声破碎菌体,SDS-PAGE检测蛋白表达情况,取超声上清,通过GST亲和色谱系统纯化目的融合蛋白,酶切通过溶血实验检测其溶血活性。结果SDS-PAGE结果显示,表达了相对分子质量约为30 000的融合蛋白,目的融合蛋白量约占菌体总蛋白量的29.5%。经Western blot鉴定,表达的GST融合蛋白与GST抗体有强烈的交叉反应,说明成功表达了目的融合蛋白。取超声上清,亲和色谱纯化融合蛋白,纯度为95%。肠激酶切割得到了人工天然蜂毒肽,测定蜂毒肽回收率为80%。结论通过原核表达系统成功表达蜂毒肽,具有和天然蜂毒相同的溶血活性。     

乳糖诱导表达重组人甲状旁腺激素rhPTH(1-34)

目的研究以乳糖代替异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组人甲状旁腺激素的可行性。方法对乳糖浓度、诱导时间及发酵培养方式进行研究,确定了乳糖诱导的最佳条件。结果 0.6%的乳糖诱导4 h,目的蛋白的表达量约占菌体总蛋白的56.8%,采取分批补料培养方式,5 L发酵罐中蛋白表达量达到42.6%。结论乳糖能作为诱导剂诱导rhPTH(1-34)在大肠杆菌中的表达。     

融合表达pGEX-Tα1的发酵研究

为了研究重组人胸腺素α1(Tα1)工程菌的发酵工艺 ,在NBS MICROS15L自动控制发酵罐中 ,利用分批培养和补料分批培养技术培养含融合表达载体 pGEX Tα1的大肠杆菌DE3 (lys)。采用分批培养 ,得到的最终菌体密度OD60 0 为 8,GST Tα1融合蛋白的含量为 0 .1g L(发酵液 ) ;通过限制性流加补料 ,促进体系溶解氧能使发酵菌体密度及融合蛋白的含量显著提高 ,OD60 0 可达 3 2 ,融合蛋白的含量为 0 .7g L(发酵液 ) ,且融合蛋白主要以可溶形式表达 ,为后续蛋白纯化工作提供了便利。本研究确定了周期短、产率高且稳定的发酵工艺 ,为工业化生产重组Tα1打下了基础     

重组人抗血栓蛋白(rHAP)工程菌表达条件的优化

优化重组人抗血栓蛋白(rHAP)工程菌的培养基及培养和表达条件,提高菌体产量及可溶性的重组rHAtP蛋白含量.通过单因素及正交实验,对影响重组大肠杆菌生长及rHAP蛋白表达的培养基的组分、诱导剂的浓度、培养温度等工艺条件进行优化.结果表明半合成培养基成分的最优配比:0.5%蔗糖、1%蛋白胨、3%酵母提取物,IPTG诱导...     

CTB-Aβ42融合蛋白的原核表达条件优化及鉴定

目的探索融合基因CTB-Aβ42在大肠杆菌中表达的最适条件,并纯化得融合蛋白。方法设置不同的诱导温度、诱导时间、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度,在大肠杆菌中表达融合基因CTB-Aβ42,SDS-PAGE凝胶电泳鉴定表达产物,GST亲和色谱柱纯化目的蛋白,Western blot鉴定目的蛋白免疫原性。结果 SDS-PAGE结果显示,GST-CTB-Aβ42融合蛋白分子质量约为45 kD,与预期结果一致;Western blot结果表明,纯化得到的目的蛋白具有免疫原性。在诱导条件为30℃,0.1 mmol/L IPTG诱导2 h表达的可溶性蛋白所占比例最高;在37℃,0.1mmol/L IPTG诱导4 h表达的融合蛋白总量最高,小部分可溶性表达,大部分以包涵体的形式存在。结论本实验对CTB-Aβ42融合蛋白的原核表达条件进行了优化,经GST亲和色谱柱纯化获得具有免疫原性的融合蛋白。     

谷胱甘肽-S-转移酶-人表皮生长因子融合蛋白基因的表达及其产物的生物活性

目的　通过融合蛋白的表达使人表皮生长因子(hEGF)易于纯化。方法　构建基于tac启动子的pGEX 4T-1-hEGF原核表达载体,转化大肠杆菌BL2 1(DE3 ) ,以异丙基 1 硫代-β-D半乳糖苷诱导,表达谷胱甘肽 S 转移酶(GST) hEGF融合蛋白。结果　表达产物占细菌总蛋白的3 4%。部分为可溶性的,部分形成包涵体。菌体裂解上清液经GlutathioneSepharose 4B纯化后,SDS PAGE电泳出现一条3 2ku蛋白条带,与GST hEGF融合蛋白的计算分子量相符。菌体裂解液中的可溶性GST hEGF的产率为63mg·L- 1 。将其添加到培养的HEK-2 93细胞中,能明显促进该细胞的分裂和生长。结论　成功地构建并表达了GST-hEGF融合蛋白基因,其表达产物GST hEGF显示良好的促细胞增殖活性     

重组人胸腺素原α在大肠杆菌中的表达优化

在15L的生物反应器内,对重组人胸腺素原α（huPTMAα）在大肠杆菌TG－1中经IPTG诱导后的表达条件进行优化;应用NBS－MICROS15.L.T.DR型生物反应器（15L）,用工程菌E.coli pGEX－IN／PTMA,研究了诱导时不同的pH、温度、搅拌速率和IPTG浓度,利用正交试验对发酵条件进行了优化。经1次预试验和9次正式试验结果表明,huPTMAα的表达受溶氧条件的影响较显著,其中搅拌速率和通气量为最大的影响因子,当其为250r/min时,表达水平最高。经SDS－PAGE和凝胶扫描发现表达蛋白占菌体蛋白的60％以上。该实验为工程菌的中试提供了最佳的表达诱导条件,对其稳定性,高效表达具有重要的指导意义。     

脂多糖应激新分子融合蛋白的高表达及纯化

目的在原核表达系统中表达脂多糖应激新分子编码的蛋白质。方法PCR扩增HlrgcDNA编码区,克隆入表达载体pcTAT中,构建成融合6His的表达载体pcTAT-lrg,转化E.coli BL21(DE3),以IPTG诱导。表达产物用SDS-PAGE及凝胶光密度扫描分析,用Ni-NTA亲和层析柱纯化。结果经过IPTG诱导4 h,表达出相对分子质量(Mr)约25 000的蛋白,占菌体总蛋白的51%。表达产物为可溶性的,用Ni-NTA亲和层析柱纯化的表达蛋白达到电泳纯。加入培养液中的纯化蛋白,可在30 min内进入HEK293细胞。结论在E.coli中成功地高表达人Lrg融合蛋白,并对其进行初步纯化,为人Lrg功能的研究打下基础。     

重组 GST-β-GT 融合蛋白的原核表达、纯化及活性鉴定

目的：构建噬菌体β‐GT蛋白的原核重组体系,诱导表达、纯化GST‐β‐GT 融合蛋白并对其进行酶活性测定。方法利用PCR技术从T4噬菌体中扩增β‐GT基因;经T‐A克隆,获得β‐GT基因片段,经酶切连接,构建原核表达载体pGEX‐6P‐1‐β‐GT ;经测序鉴定序列正确后,将所构建的载体转化进入大肠埃希菌BL21（DE3）中进行表达。利用IPTG诱导,经10％ SDS‐PAGE鉴定目的蛋白表达后,采用GST柱纯化目的蛋白;通过酶切和qPCR鉴定其活性。结果成功扩增了噬菌体β‐GT基因;重组质粒在大肠埃希菌BL21（DE3）中诱导表达出GST‐β‐GT融合蛋白;通过GST柱纯化后获得了GST‐β‐GT融合蛋白,纯度达95％;通过酶切和qPCR验证,此GST‐β‐GT融合蛋白具有T4‐β‐GT酶的活性。结论。原核表达GST‐β‐GT融合蛋白具有糖基转移酶活性。     

抗菌肽Cecropin B-肿瘤血管生长抑制因子 Kringle5融合蛋白表达载体的构建及其表达

通过重叠区扩增法人工合成抗菌肽Cecropin B(CB)基因,从ThioA/L15-7上卸下肿瘤血管生长抑制因子Kringle5(K5)基因,将两者按正确的阅读框架融合并定向克隆至大肠杆菌高效表达载体pET32a上,构建成pET32a/CB-K5重组载体。重组载体转化BL21(DE3)细胞后,提取质粒进行PCR鉴定和序列分析,证明重组质粒pET32a/CB-K5阅读框架和融合基因序列均与预期相符。实验结果显示,成功地构建了抗菌肽CecropinB(CB)和肿瘤血管生长抑制因子Kringle5(K5)融合蛋白的表达载体pET32a/CB-K5。转化E.coliBL21(DE3),SDS-PAGE分析显示,在IPTG诱导下,融合蛋白以包涵体的形式在重组转化菌株中获得高效表达,表达量达到菌体总蛋白的50%。     

乳糖诱导人胰岛素样生长因子-1在大肠杆菌中的表达

目的以含有人源性胰岛素样生长因子-1（hIGF-1）基因的大肠杆菌DH5a为研究对象,研究以乳糖作为诱导剂时目的融合蛋白的表达规律。方法利用可表达hIGF-1的工程菌,研究乳糖代替IPTG诱导大肠杆菌在不同条件下表达目的蛋白的一般规律．并优化表达条件,表达结果借助SDS-PAGE等方法进行分析。结果乳糖可诱导hIGF-1在大肠杆菌中的表达．最优表达条件为37℃下重组菌株生长至OD600值为0．7时加入诱导浓度为0．8％的乳糖继续诱导4h。诱导的目的融合蛋白相对表达量能够达到占总蛋白的40-60％水平,接近IPTG的诱导表达水平。结论乳糖能够代替IPTG作为诱导剂成功诱导hIGF-1在大肠杆菌中的表达。