特异诱导脐血CD8+抗白血病细胞毒淋巴细胞的研究

目的研究体外诱导脐血CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)特异性杀伤白血病细胞的作用,探讨脐血淋巴细胞用于特异性免疫治疗的可行性.方法联合细胞因子体外诱导10份脐血单个核细胞(MNC)分化为树突细胞(DC),同时负载U937冻融抗原;成熟DC刺激同源的脐血T淋巴细胞成为CTL,经MACS磁珠分选出CD8+CTL.倒置显微镜、扫描电子显微镜及流式细胞术等方法检测DC细胞特性.MTT法测定细胞杀伤活性.结果10份脐血标本均可培养出形态典型、功能成熟的DC.CD8+CTL、CD8-CTL和淋巴细胞(TL)组对U937细胞不同效靶比的杀伤率以CD8+CTL组最高;CD8+CTL在401效靶比时对靶细胞U937细胞的杀伤率高于对K562细胞的杀伤率[分别为(66.36±12.43)%和(41.97±14.24)%,(P《0.05)];而CD8-CTL在401效靶比时对U937细胞和K562细胞的杀伤率差异无统计学意义[分别为(34.47±8.19)%和(22.45±4.00)%(P》0.05)].结论用负载U937细胞抗原的成熟脐血DC,诱导出脐血淋巴细胞特异性的CD8+CTL;CD8+CTL对U937细胞的杀伤活性强于CD8-CTL;CD8+CTL对U937细胞的杀伤活性具有特异性.     

外周血单核细胞来源树突状细胞体外扩增及诱导抗乳腺癌免疫的研究

目的研究外周血来源树突状细胞(DC)的体外扩增及诱导特异性抗乳腺癌细胞的免疫效应。方法(1)从外周血中分离单个核细胞后,获得单核细胞(monocyte,Mo)。粒-单集落刺激因子(GM-CSF)和白介素4(IL-4)诱导分化扩增培养7d后,应用流式细胞术进行表型分析。(2)诱导单核细胞分化的第3天加入人乳腺癌细胞株3A0的冻融抗原培养4d后,获得负载肿瘤抗原的成熟DC;将致敏DC与从外周血中分离的同种异体T淋巴细胞共培养3d,获得细胞毒T淋巴细胞(CTL);四甲基偶氮唑蓝法检测CTL及上清液对人乳腺癌细胞株3A0、人胚肾细胞株293T(对照细胞)、人肝癌细胞株HCCC-9810的细胞毒作用。结果(1)外周血来源Mo在GM-GSF和IL-4作用下,第7天后可分化生成成熟的DC,高表达DC特异性抗原CDla、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)HLA-DR、CD83。(2)DC可负载并递呈肿瘤抗原,激活同种异体T淋巴细胞,诱导肿瘤特异性CTL产生。不同浓度CTL及上清液对乳腺癌细胞3A0有特异性杀伤、抑制作用(P<0.05)。结论外周血中Mo可体外分化扩增为成熟的功能性DC,并诱导出特异性杀伤乳腺癌细胞的免疫效应。     

应用免疫球蛋白重链可变区上框架区来源的抗原九肽获得的细胞毒T细胞功能分析

目的明确存B淋巴细胞肿瘤表面的免疫球蛋白重链可变区(IgHV)的框架区(FR)上是否存在可以激发细胞毒T淋巴细胞(CTL)的抗原表位，这些来源于FR的抗原肽是否能够激发家族特异性的免疫反应，探讨按照B淋巴细胞肿瘤的IgHV基因分型进行家族性的免疫治疗的可能性，方法利用生物信息学系统预测了40例B淋巴细胞肿瘤表面的免疫球蛋白序列的抗原表位，人工合成不同基因家族的抗原几肽，利用1、2细胞结合实验检测预测的抗原肽和HLA分子的亲合力利用体外CTL刺激扩增体系。诱导特异性的CTL细胞增殖，用肽／HLA四聚体检测特异性CTL的数目，应用LDH释放实验检测CTL的细胞毒活性并验证其家族特异性。结果在B淋巴细胞肿瘤的7个IgHV基因家族中找到了12个高亲和力的抗原九肽，其中10个(83％)位于FR，以HLA-A*0201正常供的外周血单个核细胞(PBMNC)负荷该九肽作为抗原呈递细胞去刺激自身PBMNC，经过4轮刺激，CD8和肽／HLA四聚体双阳性细胞从0．38％上升到49．38％LDH释放实验证明对HLA—A*0201( )、IgHV1( )靶细胞有明显的杀伤作用，并且被IgHV1肽刺激出的CTL不能识别负荷IgHV3肽的靶细胞：结论IgHV基因FR抗原儿肽可以刺激产生具有HLA限制性的并且肽特异性的CTL，同时这样的杀伤作用具有家族特异性，以此为靶位有望对B淋巴细胞肿瘤进行家族特异性的免疫治疗。     

抗原冲击致敏树突状细胞诱导特异性CTL杀伤Jurkat细胞实验研究

本研究以健康人外周血单核细胞为前体细胞，体外诱导其为树突状细胞（DC），分别负载Jurkat细胞冻融抗原及WT1多肽抗原，产生特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL），以探讨其对白血病Jurkat细胞的杀伤作用。联合应用rhGM—CSF、rhIL-4、rhTNF-α及rhsCD40L等细胞因子，密度梯度离心法、贴壁法从外周血获取单核细胞并进行诱导扩增，培养出DC，分别用冻融抗原及WT1多肽抗原冲击致敏DC。实验分4组：冻融抗原致敏DC组为实验组A，WT1多肽致敏DC组为实验组B，未致敏DC组为对照组A，单核细胞组为对照组B，观察CTL对Jurkat细胞的杀伤作用。结果表明：培养出了具有典型特征的DC，它高表达CD40、CD80、CD1a及CD86等表面标志，能体外诱导强烈的同种异基因混合淋巴细胞增殖反应。实验组显示高水平杀伤率，与对照组比较均具有统计学意义（P〈0.01），实验组A、B间比较无统计学意义。结论：Jurkat细胞冻融抗原及WT1多肽抗原冲击致敏DC能有效诱导T细胞抗白血病作用，为临床研制DC疫苗提供了实验依据。     

特异诱导脐血CD8+抗白血病细胞毒淋巴细胞的研究

微小残留病灶(minimal residual disease,MRD)的存在是导致白血病复发的主要根源,特异性免疫治疗能有效地清除MRD,其中的策略之一就是诱导并回输白血病特异性的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL).本实验的目的是研究脐血能否在体外诱导生成CD8+ CTL,所生成的CD8+ CTL能否特异性杀伤白血病细胞,从而确定脐血淋巴细胞的利用价值及用于特异性免疫治疗的可行性.通过联合细胞因子体外诱导脐血单个核细胞(mononuclear cells,MNC)分化为树突状细胞(dendritic cells,DC),同时负载U937冻融抗原;成熟DC刺激同源的脐血T淋巴细胞成为CTL,经MACS磁珠分选出CD8+ CTL.用倒置显微镜、扫描电镜及流式细胞仪等方法检测DC,四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法测定杀伤活性.结果显示,10份人脐血标本均可培养出形态典型、功能成熟的DC.3组效应细胞CD8+ CTL、CD8- CTL和T淋巴细胞(TL)组在相同效靶比(40∶1)对U937细胞株的杀伤率分别为(66.36±12.43)%、(34.47±8.19)%和(15.79±4.64)%,以CD8+ CTL组最高;效靶比为40∶1时,CD8+ CTL对U937细胞株的杀伤率(66.36%)高于对K562细胞株的杀伤率(41.97%)(P＜0.05);而CD8- CTL对U937细胞株和K562细胞株的杀伤率无显著差异(P＞0.05).结论用负载U937白血病细胞株抗原的成熟脐血DC可使脐血淋巴细胞诱导产生特异性的CD8+ CTL;CD8+ CTL对U937白血病细胞株的杀伤活性强于CD8- CTL的作用;CD8+ CTL对U937白血病细胞株杀伤具有特异性.     

高强度聚焦超声制备抗原致敏树突状细胞及其诱导细胞毒性T淋巴细胞杀伤效应的研究

目的 探讨高强度聚焦超声(HIFU)制备抗原致敏树突状细胞(DC)及其诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的杀伤效应.方法 应用小鼠重组GM-CSF和IL-4培养小鼠骨髓DC,用HIFU制备CT26肿瘤细胞抗原致敏DC疫苗,用3H-TdR法检测T细胞增殖反应的能力,标准的4 h 51Cr 释放测定法检测CTL杀伤活性.结果 HIFU组、肿瘤细胞冻融组、肿瘤上清组和PBS组的DC在体外均可以诱导CTL增殖,但HIFU组、肿瘤细胞冻融组的DC体外诱导CTL增殖能力明显高于肿瘤上清组和PBS组(P＜0.05).HIFU组和肿瘤细胞冻融组DC体外诱导的CTL对CT26结肠癌均有明显的细胞毒性作用,与肿瘤上清组DC和PBS组比较差异有统计学意义(P＜0.05),HIFU组体外诱导的CTL杀伤活性与肿瘤细胞冻融组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 HIFU制备抗原致敏DC可以诱导CTL大量增殖,并能诱导出杀伤效应较强的CTL.     

活化B淋巴细胞诱导健康人外周血HBcAg 短肽特异性细胞毒性T淋巴细胞

目的 探讨负载乙型肝炎病毒核心抗原18-27(HBcAg 18-27)序列肽的活化B淋巴细胞诱导自体外周血单个核细胞(PBMC)产生HBcAg 18-27特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的能力.方法 免疫磁珠法分选B淋巴细胞,与CpG寡核苷酸(CpG-ODN)(2 μg/mL)和白细胞介素-4(IL-4)(2 ng/mL)共培养48 h,再加入人工合成的HBcAg 18-27肽(50 μg/mL),继续温育12 h.将负载抗原肽的活化B淋巴细胞与自体PBMC进行混合淋巴细胞培养5 d,采用Pro5TM MHC Pentamers技术检测HBcAg 18-27特异性CTL.结果 免疫磁珠法分选B淋巴细胞纯度为89.60%.荧光显微镜观察到HBcAg 18-27抗原肽进入活化B细胞,流式细胞仪定量检测抗原负载率为41.3%.以此作为HBcAg 18-27特异性抗原递呈细胞(APC)能够从自体PBMC中诱导出HBcAg 18-27特异性CTL.对照组(不加APC)HBcAg 18-27特异性CTL为(0.20±0.10)%,实验组(加APC)为(0.50±0.19)%,2组差异有统计学意义(P<0.01).结论 负载了HBcAg 18-27肽的活化B淋巴细胞能够诱导自体PBMC产生HBcAg 18-27特异性CTL.     

食管癌抗原联合金葡素诱导杀瘤性细胞的实验研究

目的：体外应用超抗原金葡素C型（SEC）联合食管癌可溶性抗原（TSA）刺激外周血淋巴细胞,诱导产生细胞毒T细胞（CTLs）,对肿瘤细胞进行杀伤,探讨其治疗肿瘤的可行性。方法：外周血淋巴细胞经TSA、超抗原SEC联合作用,进行体外培养。用酶联免疫吸附测定法（ELISA）法和细胞毒试验测定细胞因子含量和杀伤活性。结果：经TSA与超抗原SEC联合刺激,淋巴细胞增殖活性增强,在刺激后72h达到峰值;与空白对照组相比,SEC、TSA以及SEC与TSA联合刺激,人肿瘤坏死因子α（TNF-α）活性从第1天开始升高,在3d达峰值;并且联合刺激的淋巴细胞组诱导的效应细胞对靶细胞杀伤活性显著高于单纯淋巴细胞组（P〈0.05）,对TSA来源的食管癌细胞具有选择性杀伤作用。结论：肿瘤可溶性抗原与超抗原SEC联合应用能诱导效应细胞明显增殖、活化、并产生高效特异性的抗肿瘤效果。     

LMP2混合肽负载树突状细胞与EB病毒感染患者外周血单个核细胞共培养产生识别EB病毒抗原的T细胞

LMF2是EB病毒感染细胞后表达的一种蛋白。本研究探讨应用适于不同HLA分型的EB病毒-LMF2抗原混合肽（MIX—LMF2）体外刺激EB病毒感染患者外周血单个核细胞，诱导产生EB病毒抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）。取EB病毒相关噬血细胞综合症患者的外周血，分离并诱导培养树突状细胞，在培养过程中用EB病毒MIX—LMF2混合肽刺激，促成熟后在体外激活自体T淋巴细胞，每周刺激1次，共刺激2次；同时对部分分离的淋巴细胞在培养过程中不予以刺激作为对照。用基因扫描T细胞受体（TCR）B基因图谱的方法观察培养前后的T细胞克隆分布变化；用流式细胞术检测T淋巴细胞的表型变化；将培养的细胞和靶细胞共培养检测IFN—γ的分泌以研究CTL细胞抗原特异性的细胞毒作用。研究结果表明，基因扫描TCRβ基因结果显示体外培养改变了患者的TCRβ基因图谱，培养前为寡克隆的TCRβ基因家族在培养后出现与正常人相似的多峰分布，提示淋巴细胞亚群分布恢复正常；流式细胞分析显示培养前的淋巴细胞CD3^＋、CD3^＋ CD8^＋、CD^＋ CD45RA^- CD45RO^＋比例分别为70．73％、42．99％、27．56％。用负载EB病毒LMF2肽2次刺激体外培养后，上述的淋巴细胞表型分别升高为95．17％、52．54％、81、41％。NK细胞（CD3^- CD56^＋）、调节性T细胞（CD4^＋CD25^＋FOXP3^＋）比例变化不大，分别从培养前的2.12％，0．03％变化为2.35％．0．02％。CD3^＋ CD45RA^- CD45RO^＋细胞增长比例较大，表明2次刺激后大部分的初始型T淋巴细胞被激活。IFN—γ分泌检测结果显示。当负载LMF2肽的DC细胞作为靶细胞时，刺激1次的细胞分泌IFN—γ量和刺激2次的细胞分泌IFN-γ量明显高于同期未刺激细胞分泌IFN-γ量（P〈0．05）。而对于未负载LMP2的DC细胞作为靶细胞时，IFN-γ检测结果则显示无统计学意义（P〉0.05）。结论：用负载EB病毒MIX—LMF2肽的树突状细胞（De）刺激T淋巴细胞的培养方法。可以改变患者T淋巴细胞克隆分布，产生识别EB病毒的特异性T淋巴细胞。     

白血病肿瘤相关抗原特异性细胞毒T细胞的体外扩增及杀伤功能的实验研究

目的:探索体外扩增白血病肿瘤相关抗原特异性细胞毒T细胞(tumor-associated antigen-specific cytotoxic T lymphocytes,TAA-CTL)的可行性,并验证其特异性杀伤作用。方法:采用密度梯度离心法分离出健康志愿者外周血单个核细胞,诱导培养树突状细胞(dendritic cells,DC)并负载白血病相关抗原WT1、PRAME、NY-ESO-1混合多肽,然后与自体T淋巴细胞共培育,扩增出TAA-CTL。用流式细胞术检测TAA-CTL表型及多种细胞因子的分泌率,细胞毒实验检测TAA-CTL对负载肿瘤相关抗原的自体靶细胞的杀伤力。结果:1体外诱导培养的TAACTL扩增倍数为3.81±1.61;流式细胞术检测其中CD3+细胞平均为(97.22±0.71)%,CD3+CD4+占(41.47±27.08)%,CD3+CD8+占(56.40±11.15)%,CD3-CD56+占(0.50±0.31)%,CD19+仅占(0.14±0.20)%,与对照组细胞表型分析比较差异无统计学意义(P0.05)。2流式细胞术检测经抗原刺激后TAA-CTL分泌的胞内细胞因子,CD8+TAA-CTL分泌的IFN-γ和TNF-α水平分别为(27.67±2.21)%和(34.2±0.71)%,CD4+TAA-CTL分泌的IFN-γ和TNF-α分别为(21.6±2.55)%和(9.97±3.44)%;对照组CD8+CTL分泌的IFN-γ和TNF-α水平分别为(1.36±0.04)%和(5.58±0.03)%,CD4+CTL分泌的IFN-γ和TNF-α分别为(0.91±0.06)%和(1.60±0.07)%,均明显低于TAA-CTL组,其差异有统计学意义(P0.01)。TAA-CTL在效靶比为5∶1、10∶1、20∶1和40∶1时对负载TAA的自体靶细胞的杀伤率分别为(26.85±5.25)%、(60.55±2.45)%、(67.4±3.60)%和(77.00±1.00)%,对未负载TAA的自体靶细胞未见明显杀伤作用(P0.05)。结论:来源于健康志愿者的外周血单个核细胞体外可以成功诱导扩增出TAA-CTL并具有特异性杀伤功能。